生化課件-dna復(fù)制過程

DNA

過程（一）原核生物DNA

過程1.

的起始DNA

的起始就是要解開雙鏈和生成引物。(1)DNA解成單鏈由拓?fù)洚悩?gòu)酶松弛超螺旋，解螺旋酶解開雙鏈，SSB結(jié)合到單鏈上使其穩(wěn)定。起始的解鏈需要多種蛋白質(zhì)參與。這些蛋白質(zhì)與

起始點(diǎn)的特有序列結(jié)合，促使其鄰近的DNA解鏈。首先起始復(fù)合體（DnaA-ATP）與4×9bp重復(fù)序列結(jié)合，3×13bp(富含AT)重復(fù)序列在Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用下，使3×13bp重復(fù)序列區(qū)域松弛，再在DNA解旋酶(DnaB蛋白）的作用下，3×13bp區(qū)域發(fā)生解鏈；

泡被單鏈結(jié)合蛋白(SSB蛋白)覆蓋，以免斷裂和再復(fù)性；引物酶結(jié)合到模板DNA上并

一段短的RNA，作為

DNA的引物，

第一個(gè)

叉的先導(dǎo)鏈的

，接下來是雙向

。體引導(dǎo)引物酶到達(dá)適當(dāng)?shù)奈恢?/p>

引(2)引物物2.

的延長(zhǎng)在DNA聚合酶Ⅲ的作用下前導(dǎo)鏈

1000-2000個(gè)核苷酸后隨從鏈開始

，

片段的長(zhǎng)度為1000-2000個(gè)（大腸桿菌）PolⅢ為不對(duì)稱二聚體，一個(gè)作用于前導(dǎo)鏈，另一個(gè)作用于隨從鏈(loop)。5′3′領(lǐng)頭鏈(leading

strand)順著解鏈方向生成的子鏈，其

是連續(xù)進(jìn)行的，得到一條連續(xù)的子鏈。5'3'3'5'5'解鏈方向3'隨從鏈(laggingstrand)方向與解鏈方向相反，須等解開足夠長(zhǎng)度的模板鏈才能繼續(xù)

，得到的子鏈由不連續(xù)的片段所組成。5'3'3'3'5'3'5'解鏈方向5'3'5'三、

的終止去除RNA引物補(bǔ)充空缺連接DNA聚合酶Ⅰ的小片段5’

3’外切酶DNA聚合酶Ⅰ的大片段3’

5’外切酶5’

3’聚合酶DNA連接酶（二）真核生物DNA的

特點(diǎn)酵母的

起始點(diǎn)稱為ARS(autonomously

replicatingsequences,自主左右，包括數(shù)個(gè)序列)，長(zhǎng)約15Obp起始必需的保守區(qū)，其

序列富含AT。真核生物DNA

的起始需要起點(diǎn)辨認(rèn)復(fù)合物(ORC)參與。真核生物DNA

叉的移動(dòng)速度比原核生物慢得多（大約只有5Obp/s，還不到大腸桿菌的1/20）。1．DNA起始過程起始點(diǎn)(ori)。

起始點(diǎn)真核生物有多個(gè)有特殊的序列。起點(diǎn)辯認(rèn)復(fù)合物（ORC）組裝在起始部位上，形成叉。ORC在起始點(diǎn)上的組裝還不足以開始起動(dòng)，另一種復(fù)合物稱小維系蛋白（MCM）必須參與。MCM有較弱的解旋酶的活性。此外，還需拓?fù)洚悩?gòu)酶、因子(RF)、增值細(xì)胞核抗原（PCNA）的參與。此外需要DNA-polα（引物酶活性）和pol

δ（解螺旋酶活性）參與。細(xì)胞能否，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種因子而實(shí)施調(diào)控作用。相關(guān)的激酶都有調(diào)節(jié)亞基即細(xì)胞周期蛋白(cyclin)，和催化亞基即細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDK)。CDK2Cyclin

D1,

D2,

D3G1期CDK3和CDK4Cyclin

ECyclin

ACyclin

D1,

D2,

D3G1→S期S期G2期CDK1（CDC2）CyclinA,

BG2→M期CDK 相匹配的周期蛋白 作用點(diǎn)哺乳類動(dòng)物的周期蛋白和CDK哺乳類動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)還發(fā)現(xiàn)天然抑制CDK的蛋白質(zhì)，例如錨蛋白(ankynin)是CDK4的特異性抑制物，P21蛋白能抑制多種CDK。錨蛋白和P21蛋白的抑制/活化可使細(xì)胞周期開放/關(guān)閉，因此被形容為細(xì)胞周期的檢查點(diǎn)蛋白。RF有多種如RFA、RFB、RFC等，是調(diào)節(jié)細(xì)胞DNA

的重要蛋白質(zhì)。在蛋白激酶的作用下被磷酸化，激活或抑制RF的活性。而蛋白激酶包括調(diào)節(jié)亞基（又稱細(xì)胞周期蛋白）和催化亞基（又稱細(xì)胞周期蛋白依賴激酶，CDK），且各有多種。從而對(duì)DNA

起始進(jìn)行精確及多樣化控制,使多位點(diǎn)

呈時(shí)序性而非同步性。PRA： 蛋白A2．RNA引物的DNA聚合酶α能識(shí)別起始位點(diǎn)，并且以核糖核苷三磷酸為底物（NTP），以解開的一段DNA為模板，一個(gè)短鏈RNA（8～10個(gè)核苷酸）引物。然后從酶的活性轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA聚合酶α的活性，RNA引物的3’-OH末端為新的DNA單鏈的起點(diǎn)，以dNTP為原料，延長(zhǎng)引物大約15-30個(gè)脫氧核苷酸。3.DNA鏈的延伸的方向仍然為5’→3’。一旦片段達(dá)到一定長(zhǎng)度，DNA聚合酶α便從DNA上解離下來。RFC結(jié)合到這一延長(zhǎng)的引物上，并組裝到PCNA滑動(dòng)夾上，然后DNA聚合酶δ（polδ）結(jié)合到PCNA上并完成 片段的最終長(zhǎng)度130-200bp.當(dāng)它遇到原先已形成的 片段5`末端時(shí)，polδ A復(fù)合物從DNA上下來兩條鏈均按5’到3’方向 ，一條鏈3’末端的方向朝著 叉前進(jìn)的方向，可連續(xù) ，稱前導(dǎo)鏈（leading

strand）。另一條鏈5’末端朝著 叉，是不連續(xù)的，形成

片段，此鏈稱后隨鏈(lagging

strand)。4.RNA引物的水解引物的去除通過兩個(gè)步驟，首先由RNaseH降解RNA引物，留下單個(gè)核糖核苷酸連接到片段上。然后，由側(cè)翼內(nèi)切核酸酶（flapendonucleae1,FEN1）除去最后一個(gè)核苷酸。FEN1也能除去由于DNA聚合酶δ產(chǎn)生的某些錯(cuò)誤的堿基。5．DN