不同樣品核酸提取擴增熒光定量PCR完美解決方案

不同樣品核酸提取、擴增、熒光定量PCR完美解決方案不同樣品核酸提取、擴增、熒光定量PCR完美解決方案不同樣品核酸提取、擴增、熒光定量PCR完美解決方案核酸提取攻略北京百泰克生物技術(shù)有限公司（北京市海淀區(qū)上地信息路15號）不同樣品核酸提取、擴增、熒光定量PCR完美解決方案核酸不同樣品RNA提取最適方法RNA純度與質(zhì)量考察RNA提取常見問題及解決方案常見樣品DNA提取特殊樣品DNA提取DNA分離純化中常見問題分析內(nèi)容概要不同樣品RNA提取最適方法內(nèi)容概要樣品裂解液上層溶液液氮研磨或其他方法處理抽提細胞裂解干燥溶解或洗脫離心洗滌酒精沉淀或介質(zhì)吸附RNA提取流程樣品裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉沉淀法：異丙醇或乙醇介質(zhì)吸附法：RNA提取常用方法沉淀方法吸附材料原理硅基質(zhì)高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫陰離子交換樹脂低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫磁珠磁性微粒掛上不同基團可吸附并攜帶RNA沉淀法：異丙醇或乙醇RNA提取常用方法沉淀方法吸附材料異硫氰酸胍/苯酚法在變性劑異硫氰酸胍的作用下，細胞被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離；有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。RNA提取常用方法裂解方式胍鹽/β-巰基乙醇鹽酸胍裂解樣本，抑制RNase的活性；β-巰基乙醇變性蛋白異硫氰酸胍/苯酚法RNA提取常用方法裂解方式胍鹽/βBioTeke的RNA提取試劑具有明顯的優(yōu)勢在經(jīng)典試劑的基礎(chǔ)上，不斷升級。多款高品質(zhì)的RNA提取試劑：Tripure（Trizol）RNApure（Trizol法的升級產(chǎn)品）BioTeke的RNA提取試劑具有明顯的優(yōu)勢在經(jīng)典試劑的基礎(chǔ)組織/細胞樣品RNA提取材料：

小鼠肝臟組織方法：

BioTeke

RNApure高純總RNA快速提取試劑盒0.1g樣品組織結(jié)果：

圖：小鼠肝臟組織RNA1234組織/細胞樣品RNA提取材料：方法：圖：小鼠肝臟組織RNARNApure高純總RNA快速提取試劑123圖片說明：1BioTekeRNAclean2BioTekeTRIpure(TRIzol法)3BioTekeRNApure離心柱型(注：本圖實驗材料為植物葉片）RNApure高純總RNA快速提取試劑1同一樣品基因組DNA和RNA分提原理：根據(jù)基因組DNA和RNA在硅基質(zhì)膜上的結(jié)合條件不同，用兩根離心吸附柱分別提取基因組DNA和RNA。同一樣品基因組DNA和RNA分提原理：特殊樣品RNA提取血液圖1全血樣品溶解在TRIpureLSReagent試劑后的狀態(tài)圖2泳道1與2，在-80度保存一個月后的提取結(jié)果。M泳道：標準的Hela細胞RNA特殊樣品RNA提取血液圖1全血樣品溶解在TRIpur材料：

松針、冬青、香蕉、木菠蘿和楊樹方法：

通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）0.1g樣品組織結(jié)果：

得率：約35-40μg

純度：OD260/OD280＝1.82-1.95

12345678910圖片說明：1、2楊樹；3、4香蕉；5、6松針；7、8冬青；9、10木菠蘿

多糖多酚植物樣品RNA的提取12345678910試劑盒適用范圍：

水稻種子、小麥種子、玉米種子、高粱種子、擬南芥種子、大豆種子、蘋果、葡萄、香蕉、棉花、龍眼、荔枝、各種草坪牧草植物、各種樹木、各種花卉等絕大多數(shù)植物材料：方法：123456圖片說明：1、2DNA和大RNA；3、4MicroRNA(材料為小鼠肝臟組織)MicroRNA提取1234提取原理：傳統(tǒng)方法：先提取總RNA然后跑膠回收或沉淀MicroRNA。新方法：通過裂解液裂解和酸酚分層后過柱兩次，一次去除基因組DNA和大片段RNA，后一次吸附MicroRNA，然后漂洗收集。新方法特點：高效分離小RNA，同時分離總RNA可用于miRNA、siRNA和snRNA的分析適用各種來源的樣品提取時間短，約30分鐘完成實驗圖片說明：1、2DNA和大RNA；3、4MicroRNA生物大分子具有共軛雙鍵，在260和280nm波長處有光吸收峰。純度：紫外分光光度計測定所提總RNA在260nm和280nm波長處的光吸收，以A260/A280的比值來判斷總RNA的純度。質(zhì)量：甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定。RNA純度與質(zhì)量考察生物大分子具有共軛雙鍵，在260和280nm波長處有光吸收峰RNA提取常見問題及解決方案RNA的降解OD260/OD280比值偏低電泳帶型異常下游實驗效果不佳RNA提取常見問題及解決方案RNA的降解新鮮細胞或組織：裂解液的質(zhì)量外源RNase的污染裂解液的用量不足組織裂解不充分另外某些富含內(nèi)源酶的樣品(如脾臟，胸腺等)，很難避免RNA的降解。建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用更多裂解液。RNA的降解新鮮細胞或組織：RNA的降解冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70℃冰箱保存。樣品要相對小一點；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，研磨過程中及時補充液氮。RNA的降解冷凍樣品：RNA的保護采集樣品的保護：通常用液氮保存樣品保護劑RNAfixer,樣品浸泡其中可以在37℃保存一天，25℃一周，4℃一個月，-20℃一年左右。環(huán)境中RNase的清除：DEPC處理各種實驗器具RNAsafe對溶液中RNase進行清除。RNA酶噴霧清除劑，可對固體表面的RNase起到清除的作用，更大程度上避免RNase的污染。RNA的保護采集樣品的保護：環(huán)境中RNase的清除：蛋白質(zhì)污染：不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚殘留：不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。OD260/OD280比值偏低蛋白質(zhì)污染：OD260/OD280比值偏低OD260/OD280比值偏低抽提試劑殘留：確保洗滌時要徹底懸浮RNA，并且徹底去掉75%乙醇。解決辦法:再沉淀一次后，溶解。設(shè)備限制：測定OD260及OD280數(shù)值時，要使OD260讀數(shù)在0.10-0.50之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測OD時，對照及樣品稀釋液請使用10mMTris，pH7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。OD260/OD280比值偏低非變性電泳：上樣量超過3μg，電壓超過6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均可能導(dǎo)致28S和18S條帶分不開。變性電泳條帶變淡：

EB與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些；甲醛的質(zhì)量不高。電泳條帶異常電泳條帶異常抽提試劑的殘留75%乙醇洗滌樣品中雜質(zhì)的殘留多糖等雜質(zhì)，再次沉淀DNA污染使用RNase-Free的DNaseI消化抽提RNA下游實驗效果不佳（RNA降解）下游實驗效果不佳（RNA降解）不同樣品基因組DNA提取常見樣品基因組DNA提取細胞/組織/細菌/血液基因DNA提取植物材料DNA提取特殊樣品基因組DNA提取大量血液樣品DNA提取環(huán)境微生物DNA提取臨床樣本DNA提取DNA分離純化中的常見問題分析不同樣品基因組DNA提取常見樣品基因組DNA提取基因組DNA提取流程基因組DNA提取流程化學(xué)方法CTAB法：適用于植物材料等。是一種陽離子去污劑，溶解細胞膜，與核酸結(jié)合。在高鹽下溶解釋放DNA。SDS法：適用于血液，細胞，動物組織，細菌，酵母等物理方法機械剪切，超聲波破碎，研磨勻漿等。易造成DNA斷裂。酶法

蛋白酶KBioTeke基因組DNA提取系列試劑盒綜合利用上述方法基因組DNA提取流程-細胞裂解化學(xué)方法基因組DNA提取流程-細胞裂解特點：不需要使用有毒的氯仿、苯酚等試劑多次柱漂洗確保高純度；長度可達30-50Kb提取原理：組織/細胞/細菌/血液基因組DNA提取特點：提取原理：組織/細胞/細菌/血液基因組DNA提取玉米葉片基因組DNA提?。ㄊ褂眯滦涂焖僦参锘蚪MDNA提取試劑盒）提取原理：植物材料基因組DNA提取玉米葉片基因組DNA提取提取原理：植物材料基因組DNA提取特殊樣品基因組DNA提取傳統(tǒng)方法適用于所有材料基因組DNA的提??？比如大量血液？比如土壤/糞便中的微生物基因組DNA的提??？比如病毒及其他微量樣品DNA的提取？

NO！特殊樣品基因組DNA提取傳統(tǒng)方法適用于所有材料基因組DNA的中量/大量血液基因組DNA提取傳統(tǒng)方法消化后，用酚/氯仿抽提，時間長，損害操作人員健康BioTeke創(chuàng)新

不用蛋白酶消化不用酚/氯仿抽提結(jié)果：

得率：約75-250μg/5mL血樣純度：OD260/OD280＝1.87-1.955ml全血基因組DNA提取電泳結(jié)果中量/大量血液基因組DNA提取傳統(tǒng)方法5ml全血基因組DNA土壤/糞便微生物基因組DNA提取其他品牌試劑盒存在缺點：采用玻璃珠或鋼珠破碎，導(dǎo)致基因組斷裂嚴重；必須購買破碎專用設(shè)備，增加使用成本；采用包括玻璃奶、離心吸附柱串聯(lián)的純化方式，導(dǎo)致DNA大量損失，得率很低，很難真實反映土壤微生物的多樣性。BioTeke的技術(shù)創(chuàng)新：采用酶法破碎，保證基因組的完整性；用異丙醇沉淀DNA，DNA無損失。廠家破碎方式純化方式提取時間是否需要專門設(shè)備BioTeke酶法破碎基因組完整離心柱吸附雜質(zhì)純度高1小時內(nèi)不需要Q公司鋼珠破碎基因組斷裂玻璃奶同離心柱結(jié)合得率低2小時需要M公司玻璃珠破碎基因組斷裂離心柱純化得率較低2小時需要土壤/糞便微生物基因組DNA提取其他品牌試劑盒存在缺點：廠家臨床樣品基因組DNA提取病毒基因組DNA提取酵母基因組DNA提取口腔拭子DNA提取微量樣品DNA提取石蠟組織DNA提取頭發(fā)DNA提取臨床樣品基因組DNA提取病毒基因組DNA提取一步法DNA提取擴增原理：綜合微量樣品基因組DNA提取和高效的PCR擴增試劑。從毛發(fā)、石蠟組織等微量組織中高效提取足夠濃度的DNA，然后進行PCR擴增。操作簡單、方便，可對大量樣品同時進行操作。一步法DNA提取擴增原理：保證基因組DNA的完整性和純度提高DNA的洗脫效率DNA的儲存基因組DNA分離純化中的注意事項保證基因組DNA的完整性和純度基因組DNA分離純化中的注意事保證基因組DNA的完整性和純度提高DNA的洗脫效率DNA的儲存基因組DNA分離純化中的注意事項簡化操作步驟，縮短操作時間減少物理因素對DNA的降解，震蕩、攪拌等減少化學(xué)物質(zhì)對DNA的降解，操作多在pH4-10防止基因組DNA的生物降解：DNase保證基因組DNA的完整性和純度基因組DNA分離純化中的注意事保證基因組DNA的完整性和純度提高DNA的洗脫效率DNA的儲存基因組DNA分離純化中的注意事項洗脫液65度預(yù)熱10分鐘洗脫體積不小于30μL洗脫2次或者3次保證基因組DNA的完整性和純度基因組DNA分離純化中的注意事保證基因組DNA的完整性和純度提高DNA的洗脫效率DNA的儲存基因組DNA分離純化中的注意事項可長期儲存于pH=7.0的ddH2O或TE不易制成干品儲存分裝低溫保存保證基因組DNA的完整性和純度基因組DNA分離純化中的注意事如何提高微量核酸提取或回收后的濃度核酸助沉劑的應(yīng)用微量吸附柱的應(yīng)用15μl洗脫體系質(zhì)粒提取膠回收或PCR產(chǎn)物回收微量細胞/組織DNA/RNA提取病毒DNA/RNA提取微量臨床樣本DNA/RNA提取如何提高微量核酸提取或回收后的濃度核酸助沉劑的應(yīng)用不同樣品核酸提取、擴增、熒光定量PCR完美解決方案Real-timeqPCR攻略北京百泰克生物技術(shù)有限公司（北京市海淀區(qū)上地信息路15號）不同樣品核酸提取、擴增、熒光定量PCR完美解決方案ReRT-PCR原理Real-timeqPCR原理及應(yīng)用Real-timeqPCR成功關(guān)鍵Real-timeqPCR數(shù)據(jù)分析Real-timeqPCR常見問題及解決方案主要內(nèi)容RT-PCR原理主要內(nèi)容中心法則與RT、PCRRNADNARTPCR中心法則與RT、PCRRNADNARTPCR逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。提取RNA的質(zhì)量會影響到RT的產(chǎn)量及cDNA的完整性。整個過程要求無RNA酶操作。反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑都會對產(chǎn)物的質(zhì)量造成一定的影響。反轉(zhuǎn)錄相關(guān)因素反轉(zhuǎn)錄相關(guān)因素SuperM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶高效的逆轉(zhuǎn)錄活性，且無RNaseH活性ThermoM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶高效的逆轉(zhuǎn)錄活性，且無RNaseH活性適合合成長片段的cDNA,有很強的模板兼容性，對高GC含量（75%以上）和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的模板效果顯著在42℃-60℃具有較好的熱穩(wěn)定性。SuperM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶OnestepRT-PCR模板：使用BioTeke公司的RNApure總RNA提取試劑盒提取的雞肝臟組織RNA

目的片段：管家基因β-Actin反應(yīng)體系：

反應(yīng)程序：

OnestepRT-PCR模板：目的片段：管家基因β-ART-PCR相關(guān)產(chǎn)品SuperM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，10000u/198元SuperRTKitcDNA第一鏈合成試劑盒50次，特價490元SuperOne-stepRT-PCRKit一步法RT-PCR試劑盒50次，特價880元Thermo系列產(chǎn)品買二贈一！ThermoM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，10000u/580元ThermoRTKitcDNA第一鏈合成試劑盒50次，價格1200元ThermoOne-stepRT-PCRKit一步法RT-PCR試劑盒50次，價格1400元反轉(zhuǎn)錄酶及試劑盒系列產(chǎn)品講座期間特價優(yōu)惠！RT-PCR相關(guān)產(chǎn)品SuperM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，1000RT-PCR原理Real-timeqPCR原理及應(yīng)用Real-timeqPCR成功關(guān)鍵Real-timeqPCR數(shù)據(jù)分析Real-timeqPCR常見問題及解決方案RT-PCR原理實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用基因表達差異分析拷貝數(shù)分析SNP檢測miRNA定量轉(zhuǎn)基因成分定量分析臨床診斷、疾病及藥物研發(fā)等實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用基因表達差異分析Real-timeqPCR原理如何對初始模板定量熒光信號如何產(chǎn)生？Real-timeqPCR原理如何對初始模板定量Real-TimeqPCR主要概念實時定量PCR非探針化學(xué)原理探針兩個重要圖形擴增曲線熔解曲線Real-TimeqPCR主要概念實時定量PCR非探針化學(xué)Real-TimeqPCR曲線的意義擴增曲線熔解曲線圖片為：首都醫(yī)科大學(xué)演示實驗結(jié)果材料：小鼠肝臟基因：β-actinReal-TimeqPCR曲線的意義擴增曲線熔解曲線圖片為實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種。非探針類則是利用熒光染料（如SYBRGreenI）或者特殊設(shè)計的引物(如LUXPrimers)來指示擴增的增加。探針類(TaqMan探針和

分子信標)是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加。后者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但前者則簡便易行。熒光染料和熒光探針實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種。熒SYBRGreenI工作原理SYBRGreenI是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強。這一性質(zhì)使其用于擴增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBRGreenI的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBRGreenI工作原理SYBRGreenI是LUX(lightuponextention)引物是利用熒光標記的引物實現(xiàn)定量的一項新技術(shù)。目標特異的引物對中的一個引物3’

端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在有目標片斷的時候，引物與模板配對，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生特異的熒光信號。LUX引物工作原理LUX(lightuponextention)引物是TaqMan探針工作原理FQPrimerFQPrimerDegradationofTaqManprobebyDNApolymeraseFQReporterQuencherSuppressionoffluorescenceTaqMan探針工作原理FQPrimerFQPrimerDe分子信標（molecularbeacon）工作原理分子信標：一種在靶DNA不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，位于分子一端的熒光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。分子信標的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個核苷酸長，并與目標序列互補；莖一般5-7個核苷酸長，并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標必須非常仔細的設(shè)計，以致于在復(fù)性溫度下，模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，模板存在時則與模板配對。與模板配對后，分子信標的構(gòu)象改變使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發(fā)時，它發(fā)出自身波長的光子（圖5）。分子信標（molecularbeacon）工作原理分子熒光閾值(Threshold)CtCt值是擴增DNA的量達到閾值時候的循環(huán)次數(shù)。熒光閾值(Threshold)CtCt值是擴增DNA的量達Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值（如圖所示）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。Ct值Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的Ct值與該模板Real-timeqPCR流程Real-timeqPCR流程一步法兩步法優(yōu)點節(jié)省時間穩(wěn)定性好減少污染靈敏度高定量相對準確缺點靈敏度稍差穩(wěn)定性稍差操作稍復(fù)雜一步法和兩步法優(yōu)缺點比較根據(jù)自己需求，選擇合適的方法！一步法兩步法優(yōu)點節(jié)省時間穩(wěn)定性好減少污染靈敏度高定量相對準確RT-PCR原理Real-timeqPCR原理及應(yīng)用Real-timeqPCR成功關(guān)鍵Real-timeqPCR數(shù)據(jù)分析Real-timeqPCR常見問題及解決方案RT-PCR原理Real-timeqPCR成功因素引物設(shè)計：

3’末端盡量不是A；18－24bp；擴增產(chǎn)物80-150bp;設(shè)計在基因保守區(qū)內(nèi)

Taqman探針：盡量靠在上游引物；長度30－45bp，Tm比引物高至少5℃；5’端不要是G，G會有淬滅作用，影響定量RNA質(zhì)量和定量

比較好，2條主帶可見（28s和18s）；定量準確內(nèi)標（housekeepinggene）正確選擇18srRNA,?-actin,GAPDH等

標準曲線的準確制作R2＝0.99Real-timeqPCR成功因素引物設(shè)計：反應(yīng)體系：模板濃度不要太高，反轉(zhuǎn)錄最多1μg總RNA，PCR一般1μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；引物濃度一般100nM-1mM；根據(jù)kit要摸索最佳反應(yīng)條件小心操作：每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個槍頭加樣，即使是混合液！每個樣品至少要做3個平行孔。每組實驗最好有3個重復(fù)，做統(tǒng)計分析。Real-timeqPCR成功因素做real-timeqRT-PCR前，做個普通的PCR，檢測您的反應(yīng)條件！反應(yīng)體系：Real-timeqPCR成功因素做real-tRT-PCR原理Real-timeqPCR原理及應(yīng)用Real-timeqPCR成功關(guān)鍵Real-timeqPCR數(shù)據(jù)分析Real-timeqPCR常見問題及解決方案RT-PCR原理Real-timeqPCR數(shù)據(jù)分析基線（baseline）通常是3－15個循環(huán)的熒光信號同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨設(shè)置基線閾值（threshold)自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍手動設(shè)置：置于指數(shù)擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨設(shè)置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。Ct值:與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系分析定量時候一般取Ct:15-35.太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準確。Real-timeqPCR數(shù)據(jù)分析基線（baseline）統(tǒng)計分析方法絕對定量：此方法是用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量。該標準品可以是純化的質(zhì)粒DNA，體外轉(zhuǎn)錄的RNA，或者是體外合成的ssDNA。

相對定量：通過與內(nèi)參基因Ct值之間的相差來計算基因表達差異,一般是

2-Ct?；蛘呤强紤]擴增效率的Pfaffl法。統(tǒng)計分析方法絕對定量：絕對定量絕對定量相對定量MarisaL.WongandJuanF.Medrano:BioTechniquesJuly2005相對定量MarisaL.WongandJuanF.相對定量相對定量實時檢測（在對數(shù)擴增時期）而不是終點檢測敏感性高需要樣品少特異性高（Taqman）精確定量Real-timeqRT-PCR優(yōu)點實時檢測（在對數(shù)擴增時期）而不是終點檢測Real-timeRT-PCR原理Real-timeqPCR原理及應(yīng)用Real-timeqPCR成功關(guān)鍵Real-timeqPCR數(shù)據(jù)分析Real-timeqPCR常見問題及解決方案RT-PCR原理特異性

重復(fù)性

靈敏度其他問題常見問題討論特異性常見問題討論擴增的特異性引物？Tm，重新設(shè)計引物，優(yōu)化條件Tm擴增的特異性引物？Tm，重新設(shè)計引物，優(yōu)化條件Tm重復(fù)性判斷實驗優(yōu)劣的重要指標判斷指標：主要為標準差（SD）和變異系數(shù)（CV）影響重復(fù)性的因素：PCR反應(yīng)擴增的效率：優(yōu)化實驗條件，使反應(yīng)體系達到最佳擴增效率。目的基因的初始濃度：使用初始濃度具有較高數(shù)量級的樣本或作平行孔。標準曲線的影響：不少于5個稀釋度的標準品，涵蓋待測樣本中目的基因量可能出現(xiàn)的全部濃度范圍；理想的標準品應(yīng)與樣本具有高同源性，質(zhì)粒DNA或是體外合成、轉(zhuǎn)錄的RNA。重復(fù)性判斷實驗優(yōu)劣的重要指標影響靈敏度的因素反應(yīng)體系中形成的引物二聚體的影響

可以用水解探針代替SYBRGreenI，有文獻報導(dǎo)使用水解探針的敏感性要比SYBRGreenI高出10倍。可以使用熱啟動辦法或使用特殊處理的Taq酶要盡可能地優(yōu)化引物設(shè)計如果反應(yīng)體系中出現(xiàn)PCR的抑制因素，應(yīng)適當將目的基因的濃度稀釋后再進行擴增。注意避免室溫混合各種試劑，并且在一經(jīng)混合后立即開始進行擴增。循環(huán)數(shù)

Mg2＋的濃度

影響靈敏度的因素反應(yīng)體系中形成的引物二聚體的影響Q1:無Ct值（信號）出現(xiàn)可能性不大檢測熒光信號的步驟有誤:一般SG法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。引物或探針降解:可通過PAGE電泳檢測其完整性。模板量不足:對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。模板降解:避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。Q1:無Ct值（信號）出現(xiàn)可能性不大檢測熒光信號的步驟有誤:Q2:Ct值出現(xiàn)過晚（Ct＞38）擴增效率低:反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計更好的引物或探針；改用三步法進行反應(yīng)；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。PCR產(chǎn)物太長:一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。Q2:Ct值出現(xiàn)過晚（Ct＞38）擴增效率低:反應(yīng)條件Q3:標準曲線的線性關(guān)系不佳加樣存在誤差:

使得標準品不呈梯度。標準品出現(xiàn)降解:應(yīng)避免標準品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標準品。引物或探針不佳:重新設(shè)計更好的引物和探針模板中存在抑制物，或模板濃度過高。Q3:標準曲線的線性關(guān)系不佳加樣存在誤差:使得標準品不Q4:陰性對照也出現(xiàn)明顯的起飛反應(yīng)mix或水被污染。引物二聚體的出現(xiàn)：用SG法在35cycles以后陰性出現(xiàn)起飛屬正常情況，可配合熔解曲線進行分析。反應(yīng)過程中探針的降解：用PAGE電泳對探針進行檢測。ROX校正的問題：如果使用了，則可能是ROX的降解所造成。Q4:陰性對照也出現(xiàn)明顯的起飛反應(yīng)mix或水被污染。Q5:熔解曲線不止一個主峰引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異擴增。Q5:熔解曲線不止一個主峰引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體Q6:擴增效率低反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。Q6:擴增效率低反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。Q7:同樣的試劑在不同儀器上產(chǎn)生不同的曲線，如何比較？判斷標準：擴增效率，靈敏度，特異性Q7:同樣的試劑在不同儀器上產(chǎn)生不同的曲線，如何比較BioTeke產(chǎn)品—從根本上解決您的實驗問題熒光定量PCR試劑盒系列產(chǎn)品講座期間特價優(yōu)惠！2×SYBRreal-timePCRpremixture熒光定量PCR試劑盒200次，特價890元2×SYBRreal-timeRT-PCRpremixture反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR試劑盒50次，特價1090元One-stepSYBRreal-timeRT-PCRKit一步法熒光定量試劑盒50次，特價1200元BioTeke產(chǎn)品—從根本上解決您的實驗問題熒光定量PCR試BioTekeReal-timeqPCR產(chǎn)品可用于各種儀器ABI:PRISM7000/7700/7900HT,7300/7500Bio-Rad:DNAEngineOption/DNAEngineOption2/Chromo4RealtimeSystem,iCyclerIQ/MyiQ/iQ5Stratagene:Mx3000P/Mx3005PRoche:LightcyclerBioer:Line-Gene其他各種real-timeqPCR擴增儀ROX參考染料：在熒光檢測中標準化非PCR相關(guān)的震蕩；在qPCR中提供一個穩(wěn)定的基線BioTekeReal-timeqPCR產(chǎn)品可用于各種儀BioTekeReal-timeqPCR產(chǎn)品反應(yīng)程序兩步擴增反應(yīng)Real-timeqPCR:循環(huán)數(shù)Step溫度時間檢測說明1195℃2minOff起始模板預(yù)變性35-45195℃15secOff模板變性260-68℃20-60secOn退火/延伸三步擴增反應(yīng)Real-timeqPCR:循環(huán)數(shù)Step溫度時間檢測說明1195℃2minOff起始模板預(yù)變性35-45195℃10-20secOff模板變性255-65℃10-20secOff退火372℃20-60secOn延伸BioTekeReal-timeqPCR產(chǎn)品反應(yīng)程序兩步溶解程序：（dissociationprogram),擴增反應(yīng)完成后的最后一步，檢測擴增反應(yīng)的特異性。不同儀器要求的程序稍微不同。ABI7000的溶解程序：BioTekeReal-timeqPCR產(chǎn)品反應(yīng)程序循環(huán)數(shù)Step溫度時間檢測1End55-65℃10-20secOnEnd95℃10-20secOff溶解程序：（dissociationprogram),擴增BioTeke產(chǎn)品應(yīng)用實例最權(quán)威的聲音來源于實踐目前應(yīng)用最廣泛的主流儀器：ABI系列及Bio-Rad系列。來自Bio-Rad系列的檢驗報告。來自ABI系列的檢驗報告。我們都做得很好，我們一直在不斷創(chuàng)新，力求解決您的實驗需求。BioTeke產(chǎn)品應(yīng)用實例最權(quán)威的聲音來源于實踐目前應(yīng)不同公司熒光定量試劑比較T公司BioTeke不同公司熒光定量試劑比較T公司BioTeke不同樣品核酸提取擴增熒光定量PCR完美解決方案不同樣品核酸提取擴增熒光定量PCR完美解決方案不同樣品核酸提取擴增熒光定量PCR完美解決方案不同樣品核酸提取擴增熒光定量PCR完美解決方案不同樣品核酸提取擴增熒光定量PCR完美解決方案不同樣品核酸提取擴增熒光定量PCR完美解決方案不同樣品核酸提取擴增熒光定量PCR完美解決方案不同樣品核酸提取擴增熒光定量PCR完美解決方案百泰克讓您的實驗更完美選擇BioTeke，選擇信任與回饋百泰克讓您的實驗更完美選擇BioTeke，選擇信任與回饋

謝謝大家！謝謝大家！不同樣品核酸提取、擴增、熒光定量PCR完美解決方案不同樣品核酸提取、擴增、熒光定量PCR完美解決方案不同樣品核酸提取、擴增、熒光定量PCR完美解決方案核酸提取攻略北京百泰克生物技術(shù)有限公司（北京市海淀區(qū)上地信息路15號）不同樣品核酸提取、擴增、熒光定量PCR完美解決方案核酸不同樣品RNA提取最適方法RNA純度與質(zhì)量考察RNA提取常見問題及解決方案常見樣品DNA提取特殊樣品DNA提取DNA分離純化中常見問題分析內(nèi)容概要不同樣品RNA提取最適方法內(nèi)容概要樣品裂解液上層溶液液氮研磨或其他方法處理抽提細胞裂解干燥溶解或洗脫離心洗滌酒精沉淀或介質(zhì)吸附RNA提取流程樣品裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉沉淀法：異丙醇或乙醇介質(zhì)吸附法：RNA提取常用方法沉淀方法吸附材料原理硅基質(zhì)高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫陰離子交換樹脂低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫磁珠磁性微粒掛上不同基團可吸附并攜帶RNA沉淀法：異丙醇或乙醇RNA提取常用方法沉淀方法吸附材料異硫氰酸胍/苯酚法在變性劑異硫氰酸胍的作用下，細胞被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離；有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。RNA提取常用方法裂解方式胍鹽/β-巰基乙醇鹽酸胍裂解樣本，抑制RNase的活性；β-巰基乙醇變性蛋白異硫氰酸胍/苯酚法RNA提取常用方法裂解方式胍鹽/βBioTeke的RNA提取試劑具有明顯的優(yōu)勢在經(jīng)典試劑的基礎(chǔ)上，不斷升級。多款高品質(zhì)的RNA提取試劑：Tripure（Trizol）RNApure（Trizol法的升級產(chǎn)品）BioTeke的RNA提取試劑具有明顯的優(yōu)勢在經(jīng)典試劑的基礎(chǔ)組織/細胞樣品RNA提取材料：

小鼠肝臟組織方法：

BioTeke

RNApure高純總RNA快速提取試劑盒0.1g樣品組織結(jié)果：

圖：小鼠肝臟組織RNA1234組織/細胞樣品RNA提取材料：方法：圖：小鼠肝臟組織RNARNApure高純總RNA快速提取試劑123圖片說明：1BioTekeRNAclean2BioTekeTRIpure(TRIzol法)3BioTekeRNApure離心柱型(注：本圖實驗材料為植物葉片）RNApure高純總RNA快速提取試劑1同一樣品基因組DNA和RNA分提原理：根據(jù)基因組DNA和RNA在硅基質(zhì)膜上的結(jié)合條件不同，用兩根離心吸附柱分別提取基因組DNA和RNA。同一樣品基因組DNA和RNA分提原理：特殊樣品RNA提取血液圖1全血樣品溶解在TRIpureLSReagent試劑后的狀態(tài)圖2泳道1與2，在-80度保存一個月后的提取結(jié)果。M泳道：標準的Hela細胞RNA特殊樣品RNA提取血液圖1全血樣品溶解在TRIpur材料：

松針、冬青、香蕉、木菠蘿和楊樹方法：

通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）0.1g樣品組織結(jié)果：

得率：約35-40μg

純度：OD260/OD280＝1.82-1.95

12345678910圖片說明：1、2楊樹；3、4香蕉；5、6松針；7、8冬青；9、10木菠蘿

多糖多酚植物樣品RNA的提取12345678910試劑盒適用范圍：

水稻種子、小麥種子、玉米種子、高粱種子、擬南芥種子、大豆種子、蘋果、葡萄、香蕉、棉花、龍眼、荔枝、各種草坪牧草植物、各種樹木、各種花卉等絕大多數(shù)植物材料：方法：123456圖片說明：1、2DNA和大RNA；3、4MicroRNA(材料為小鼠肝臟組織)MicroRNA提取1234提取原理：傳統(tǒng)方法：先提取總RNA然后跑膠回收或沉淀MicroRNA。新方法：通過裂解液裂解和酸酚分層后過柱兩次，一次去除基因組DNA和大片段RNA，后一次吸附MicroRNA，然后漂洗收集。新方法特點：高效分離小RNA，同時分離總RNA可用于miRNA、siRNA和snRNA的分析適用各種來源的樣品提取時間短，約30分鐘完成實驗圖片說明：1、2DNA和大RNA；3、4MicroRNA生物大分子具有共軛雙鍵，在260和280nm波長處有光吸收峰。純度：紫外分光光度計測定所提總RNA在260nm和280nm波長處的光吸收，以A260/A280的比值來判斷總RNA的純度。質(zhì)量：甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定。RNA純度與質(zhì)量考察生物大分子具有共軛雙鍵，在260和280nm波長處有光吸收峰RNA提取常見問題及解決方案RNA的降解OD260/OD280比值偏低電泳帶型異常下游實驗效果不佳RNA提取常見問題及解決方案RNA的降解新鮮細胞或組織：裂解液的質(zhì)量外源RNase的污染裂解液的用量不足組織裂解不充分另外某些富含內(nèi)源酶的樣品(如脾臟，胸腺等)，很難避免RNA的降解。建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用更多裂解液。RNA的降解新鮮細胞或組織：RNA的降解冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70℃冰箱保存。樣品要相對小一點；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，研磨過程中及時補充液氮。RNA的降解冷凍樣品：RNA的保護采集樣品的保護：通常用液氮保存樣品保護劑RNAfixer,樣品浸泡其中可以在37℃保存一天，25℃一周，4℃一個月，-20℃一年左右。環(huán)境中RNase的清除：DEPC處理各種實驗器具RNAsafe對溶液中RNase進行清除。RNA酶噴霧清除劑，可對固體表面的RNase起到清除的作用，更大程度上避免RNase的污染。RNA的保護采集樣品的保護：環(huán)境中RNase的清除：蛋白質(zhì)污染：不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚殘留：不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。OD260/OD280比值偏低蛋白質(zhì)污染：OD260/OD280比值偏低OD260/OD280比值偏低抽提試劑殘留：確保洗滌時要徹底懸浮RNA，并且徹底去掉75%乙醇。解決辦法:再沉淀一次后，溶解。設(shè)備限制：測定OD260及OD280數(shù)值時，要使OD260讀數(shù)在0.10-0.50之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測OD時，對照及樣品稀釋液請使用10mMTris，pH7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。OD260/OD280比值偏低非變性電泳：上樣量超過3μg，電壓超過6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均可能導(dǎo)致28S和18S條帶分不開。變性電泳條帶變淡：

EB與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些；甲醛的質(zhì)量不高。電泳條帶異常電泳條帶異常抽提試劑的殘留75%乙醇洗滌樣品中雜質(zhì)的殘留多糖等雜質(zhì)，再次沉淀DNA污染使用RNase-Free的DNaseI消化抽提RNA下游實驗效果不佳（RNA降解）下游實驗效果不佳（RNA降解）不同樣品基因組DNA提取常見樣品基因組DNA提取細胞/組織/細菌/血液基因DNA提取植物材料DNA提取特殊樣品基因組DNA提取大量血液樣品DNA提取環(huán)境微生物DNA提取臨床樣本DNA提取DNA分離純化中的常見問題分析不同樣品基因組DNA提取常見樣品基因組DNA提取基因組DNA提取流程基因組DNA提取流程化學(xué)方法CTAB法：適用于植物材料等。是一種陽離子去污劑，溶解細胞膜，與核酸結(jié)合。在高鹽下溶解釋放DNA。SDS法：適用于血液，細胞，動物組織，細菌，酵母等物理方法機械剪切，超聲波破碎，研磨勻漿等。易造成DNA斷裂。酶法

蛋白酶KBioTeke基因組DNA提取系列試劑盒綜合利用上述方法基因組DNA提取流程-細胞裂解化學(xué)方法基因組DNA提取流程-細胞裂解特點：不需要使用有毒的氯仿、苯酚等試劑多次柱漂洗確保高純度；長度可達30-50Kb提取原理：組織/細胞/細菌/血液基因組DNA提取特點：提取原理：組織/細胞/細菌/血液基因組DNA提取玉米葉片基因組DNA提?。ㄊ褂眯滦涂焖僦参锘蚪MDNA提取試劑盒）提取原理：植物材料基因組DNA提取玉米葉片基因組DNA提取提取原理：植物材料基因組DNA提取特殊樣品基因組DNA提取傳統(tǒng)方法適用于所有材料基因組DNA的提取？比如大量血液？比如土壤/糞便中的微生物基因組DNA的提??？比如病毒及其他微量樣品DNA的提?。?/p>

NO！特殊樣品基因組DNA提取傳統(tǒng)方法適用于所有材料基因組DNA的中量/大量血液基因組DNA提取傳統(tǒng)方法消化后，用酚/氯仿抽提，時間長，損害操作人員健康BioTeke創(chuàng)新

不用蛋白酶消化不用酚/氯仿抽提結(jié)果：

得率：約75-250μg/5mL血樣純度：OD260/OD280＝1.87-1.955ml全血基因組DNA提取電泳結(jié)果中量/大量血液基因組DNA提取傳統(tǒng)方法5ml全血基因組DNA土壤/糞便微生物基因組DNA提取其他品牌試劑盒存在缺點：采用玻璃珠或鋼珠破碎，導(dǎo)致基因組斷裂嚴重；必須購買破碎專用設(shè)備，增加使用成本；采用包括玻璃奶、離心吸附柱串聯(lián)的純化方式，導(dǎo)致DNA大量損失，得率很低，很難真實反映土壤微生物的多樣性。BioTeke的技術(shù)創(chuàng)新：采用酶法破碎，保證基因組的完整性；用異丙醇沉淀DNA，DNA無損失。廠家破碎方式純化方式提取時間是否需要專門設(shè)備BioTeke酶法破碎基因組完整離心柱吸附雜質(zhì)純度高1小時內(nèi)不需要Q公司鋼珠破碎基因組斷裂玻璃奶同離心柱結(jié)合得率低2小時需要M公司玻璃珠破碎基因組斷裂離心柱純化得率較低2小時需要土壤/糞便微生物基因組DNA提取其他品牌試劑盒存在缺點：廠家臨床樣品基因組DNA提取病毒基因組DNA提取酵母基因組DNA提取口腔拭子DNA提取微量樣品DNA提取石蠟組織DNA提取頭發(fā)DNA提取臨床樣品基因組DNA提取病毒基因組DNA提取一步法DNA提取擴增原理：綜合微量樣品基因組DNA提取和高效的PCR擴增試劑。從毛發(fā)、石蠟組織等微量組織中高效提取足夠濃度的DNA，然后進行PCR擴增。操作簡單、方便，可對大量樣品同時進行操作。一步法DNA提取擴增原理：保證基因組DNA的完整性和純度提高DNA的洗脫效率DNA的儲存基因組DNA分離純化中的注意事項保證基因組DNA的完整性和純度基因組DNA分離純化中的注意事保證基因組DNA的完整性和純度提高DNA的洗脫效率DNA的儲存基因組DNA分離純化中的注意事項簡化操作步驟，縮短操作時間減少物理因素對DNA的降解，震蕩、攪拌等減少化學(xué)物質(zhì)對DNA的降解，操作多在pH4-10防止基因組DNA的生物降解：DNase保證基因組DNA的完整性和純度基因組DNA分離純化中的注意事保證基因組DNA的完整性和純度提高DNA的洗脫效率DNA的儲存基因組DNA分離純化中的注意事項洗脫液65度預(yù)熱10分鐘洗脫體積不小于30μL洗脫2次或者3次保證基因組DNA的完整性和純度基因組DNA分離純化中的注意事保證基因組DNA的完整性和純度提高DNA的洗脫效率DNA的儲存基因組DNA分離純化中的注意事項可長期儲存于pH=7.0的ddH2O或TE不易制成干品儲存分裝低溫保存保證基因組DNA的完整性和純度基因組DNA分離純化中的注意事如何提高微量核酸提取或回收后的濃度核酸助沉劑的應(yīng)用微量吸附柱的應(yīng)用15μl洗脫體系質(zhì)粒提取膠回收或PCR產(chǎn)物回收微量細胞/組織DNA/RNA提取病毒DNA/RNA提取微量臨床樣本DNA/RNA提取如何提高微量核酸提取或回收后的濃度核酸助沉劑的應(yīng)用不同樣品核酸提取、擴增、熒光定量PCR完美解決方案Real-timeqPCR攻略北京百泰克生物技術(shù)有限公司（北京市海淀區(qū)上地信息路15號）不同樣品核酸提取、擴增、熒光定量PCR完美解決方案ReRT-PCR原理Real-timeqPCR原理及應(yīng)用Real-timeqPCR成功關(guān)鍵Real-timeqPCR數(shù)據(jù)分析Real-timeqPCR常見問題及解決方案主要內(nèi)容RT-PCR原理主要內(nèi)容中心法則與RT、PCRRNADNARTPCR中心法則與RT、PCRRNADNARTPCR逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。提取RNA的質(zhì)量會影響到RT的產(chǎn)量及cDNA的完整性。整個過程要求無RNA酶操作。反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑都會對產(chǎn)物的質(zhì)量造成一定的影響。反轉(zhuǎn)錄相關(guān)因素反轉(zhuǎn)錄相關(guān)因素SuperM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶高效的逆轉(zhuǎn)錄活性，且無RNaseH活性ThermoM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶高效的逆轉(zhuǎn)錄活性，且無RNaseH活性適合合成長片段的cDNA,有很強的模板兼容性，對高GC含量（75%以上）和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的模板效果顯著在42℃-60℃具有較好的熱穩(wěn)定性。SuperM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶OnestepRT-PCR模板：使用BioTeke公司的RNApure總RNA提取試劑盒提取的雞肝臟組織RNA

目的片段：管家基因β-Actin反應(yīng)體系：

反應(yīng)程序：

OnestepRT-PCR模板：目的片段：管家基因β-ART-PCR相關(guān)產(chǎn)品SuperM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，10000u/198元SuperRTKitcDNA第一鏈合成試劑盒50次，特價490元SuperOne-stepRT-PCRKit一步法RT-PCR試劑盒50次，特價880元Thermo系列產(chǎn)品買二贈一！ThermoM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，10000u/580元ThermoRTKitcDNA第一鏈合成試劑盒50次，價格1200元ThermoOne-stepRT-PCRKit一步法RT-PCR試劑盒50次，價格1400元反轉(zhuǎn)錄酶及試劑盒系列產(chǎn)品講座期間特價優(yōu)惠！RT-PCR相關(guān)產(chǎn)品SuperM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，1000RT-PCR原理Real-timeqPCR原理及應(yīng)用Real-timeqPCR成功關(guān)鍵Real-timeqPCR數(shù)據(jù)分析Real-timeqPCR常見問題及解決方案RT-PCR原理實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用基因表達差異分析拷貝數(shù)分析SNP檢測miRNA定量轉(zhuǎn)基因成分定量分析臨床診斷、疾病及藥物研發(fā)等實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用基因表達差異分析Real-timeqPCR原理如何對初始模板定量熒光信號如何產(chǎn)生？Real-timeqPCR原理如何對初始模板定量Real-TimeqPCR主要概念實時定量PCR非探針化學(xué)原理探針兩個重要圖形擴增曲線熔解曲線Real-TimeqPCR主要概念實時定量PCR非探針化學(xué)Real-TimeqPCR曲線的意義擴增曲線熔解曲線圖片為：首都醫(yī)科大學(xué)演示實驗結(jié)果材料：小鼠肝臟基因：β-actinReal-TimeqPCR曲線的意義擴增曲線熔解曲線圖片為實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種。非探針類則是利用熒光染料（如SYBRGreenI）或者特殊設(shè)計的引物(如LUXPrimers)來指示擴增的增加。探針類(TaqMan探針和

分子信標)是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加。后者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但前者則簡便易行。熒光染料和熒光探針實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種。熒SYBRGreenI工作原理SYBRGreenI是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強。這一性質(zhì)使其用于擴增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBRGreenI的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBRGreenI工作原理SYBRGreenI是LUX(lightuponextention)引物是利用熒光標記的引物實現(xiàn)定量的一項新技術(shù)。目標特異的引物對中的一個引物3’

端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在有目標片斷的時候，引物與模板配對，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生特異的熒光信號。LUX引物工作原理LUX(lightuponextention)引物是TaqMan探針工作原理FQPrimerFQPrimerDegradationofTaqManprobebyDNApolymeraseFQReporterQuencherSuppressionoffluorescenceTaqMan探針工作原理FQPrimerFQPrimerDe分子信標（molecularbeacon）工作原理分子信標：一種在靶DNA不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，位于分子一端的熒光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。分子信標的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個核苷酸長，并與目標序列互補；莖一般5-7個核苷酸長，并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標必須非常仔細的設(shè)計，以致于在復(fù)性溫度下，模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，模板存在時則與模板配對。與模板配對后，分子信標的構(gòu)象改變使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發(fā)時，它發(fā)出自身波長的光子（圖5）。分子信標（molecularbeacon）工作原理分子熒光閾值(Threshold)CtCt值是擴增DNA的量達到閾值時候的循環(huán)次數(shù)。熒光閾值(Threshold)CtCt值是擴增DNA的量達Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值（如圖所示）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。Ct值Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的Ct值與該模板Real-timeqPCR流程Real-timeqPCR流程一步法兩步法優(yōu)點節(jié)省時間穩(wěn)定性好減少污染靈敏度高定量相對準確缺點靈敏度稍差穩(wěn)定性稍差操作稍復(fù)雜一步法和兩步法優(yōu)缺點比較根據(jù)自己需求，選擇合適的方法！一步法兩步法優(yōu)點節(jié)省時間穩(wěn)定性好減少污染靈敏度高定量相對準確RT-PCR原理Real-timeqPCR原理及應(yīng)用Real-timeqPCR成功關(guān)鍵Real-timeqPCR數(shù)據(jù)分析Real-timeqPCR常見問題及解決方案RT-PCR原理Real-timeqPCR成功因素引物設(shè)計：

3’末端盡量不是A；18－24bp；擴增產(chǎn)物80-150bp;設(shè)計在基因保守區(qū)內(nèi)

Taqman探針：盡量靠在上游引物；長度30－45bp，Tm比引物高至少5℃；5’端不要是G，G會有淬滅作用，影響定量RNA質(zhì)量和定量

比較好，2條主帶可見（28s和18s）；定量準確內(nèi)標（housekeepinggene）正確選擇18srRNA,?-actin,GAPDH等

標準曲線的準確制作R2＝0.99Real-timeqPCR成功因素引物設(shè)計：反應(yīng)體系：模板濃度不要太高，反轉(zhuǎn)錄最多1μg總RNA，PCR一般1μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；引物濃度一般100nM-1mM；根據(jù)kit要摸索最佳反應(yīng)條件小心操作：每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個槍頭加樣，即使是混合液！每個樣品至少要做3個平行孔。每組實驗最好有3個重復(fù)，做統(tǒng)計分析。Real-timeqPCR成功因素做real-timeqRT-PCR前，做個普通的PCR，檢測您的反應(yīng)條件！反應(yīng)體系：Real-timeqPCR成功因素做real-tRT-PCR原理Real-timeqPCR原理及應(yīng)用Real-timeqPCR成功關(guān)鍵Real-timeqPCR數(shù)據(jù)分析Real-timeqPCR常見問題及解決方案RT-PCR原理Real-timeqPCR數(shù)據(jù)分析基線（baseline）通常是3－15個循環(huán)的熒光信號同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨設(shè)置基線閾值（threshold)自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍手動設(shè)置：置于指數(shù)擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨設(shè)置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。Ct值:與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系分析定量時候一般取Ct:15-35.太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準確。Real-timeqPCR數(shù)據(jù)分析基線（baseline）統(tǒng)計分析方法絕對定量：此方法是用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量。該標準品可以是純化的質(zhì)粒DNA，體外轉(zhuǎn)錄的RNA，或者是體外合成的ssDNA。

相對定量：通過與內(nèi)參基因Ct值之間的相差來計算基因表達差異,一般是

2-Ct?；蛘呤强紤]擴增效率的Pfaffl法。統(tǒng)計分析方法絕對定量：絕對定量絕對定量相對定量MarisaL.WongandJuanF.Medrano:BioTechniquesJuly2005相對定量MarisaL.WongandJuanF.相對定量相對定量實時檢測（在對數(shù)擴增時期）而不是終點檢測敏感性高需要樣品少特異性高（Taqman）精確定量Real-timeqRT-PCR優(yōu)點實時檢測（在對數(shù)擴增時期）而不是終點檢測Real-timeRT-PCR原理Real-timeqPCR原理及應(yīng)用Real-timeqPCR成功關(guān)鍵Real-timeqPCR數(shù)據(jù)分析Real-timeqPCR常見問題及解決方案RT-PCR原理特異性

重復(fù)性

靈敏度其他問題常見問題討論特異性常見問題討論擴增的特異性引物？Tm，重新設(shè)計引物，優(yōu)化條件Tm擴增的特異性引物？Tm，重新設(shè)計引物，優(yōu)化條件Tm重復(fù)性判斷實驗優(yōu)劣的重要指標判斷指標：主要為標準差（SD）和變異系數(shù)（CV）影響重復(fù)性的因素：PCR反應(yīng)擴增的效率：優(yōu)化實驗條件，使反應(yīng)體系達到最佳擴增效率。目的基因的初始濃度：使用初始濃度具有較高數(shù)量級的樣本或作平行孔。標準曲線的影響：不少于5個稀釋度的標準品，涵蓋待測樣本中目的基因量可能出現(xiàn)的全部濃度范圍；理想的標準品應(yīng)與樣本具有高同源性，質(zhì)粒DNA或是體外合成、轉(zhuǎn)錄的RNA。重復(fù)性判斷實驗優(yōu)劣的重要指標影響靈敏度的因素反應(yīng)體系中形成的引物二聚體的影響

可以用水解探針代替SYBRGreenI，有文獻報導(dǎo)使用水解探針的敏感性要比SYBRGreenI高出10倍?？梢允褂脽釂愚k法或使用特殊處理的Taq酶要盡可能地優(yōu)化引物設(shè)計如果反應(yīng)體系中出現(xiàn)PCR的抑制因素，應(yīng)適當將目的基因的濃度稀釋后再進行擴增。注意避免室溫混合各種試劑，并且在一經(jīng)混合后立即開始進行擴增。循環(huán)數(shù)

Mg2＋的濃度