BSA毛細管電色譜柱的制備及手性分離應(yīng)用課件

BSA毛細管電色譜柱的制備及手性分離應(yīng)用02化工專業(yè)：伍品端指導(dǎo)老師：馬志玲副教授BSA毛細管電色譜柱的制備及手性分離應(yīng)用1目錄Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀Ⅱ.實驗部分Ⅲ.結(jié)果與討論Ⅳ.實驗創(chuàng)新點目錄Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀2Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀手性分離的重要性

生物大分子幾乎都具有“手性”特征。手性藥物各對映體的藥效學(xué)等可能存在很大的差異。

因而評價手性藥物各對映體的生物學(xué)活性,建立快速、準確、靈敏的對映體拆分方法具有十分重要的意義。

Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀手性分離的重要性3

拆分對映體的色譜技術(shù)：高效液相色譜高效毛細管電泳超臨界流體色譜

……

毛細管區(qū)帶電泳膠束電動色譜毛細管電色譜（CEC）(以電滲流為驅(qū)動力的微柱液相色譜技術(shù))……對映體分離機理：

手性選擇劑與對映體主要為疏水和靜電作用

，只有具備特定空間構(gòu)形和化學(xué)官能團的分子才能與這一區(qū)域結(jié)合。Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀

拆分對映體的色譜技術(shù)：毛細管區(qū)帶電泳對映體分離機理：4CEC的優(yōu)點：CELCCEC高效性高選擇性多功能性高效性、高選擇性、多功能性Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀CEC的優(yōu)點：CELCCEC高效性高選擇性多功能性高效性、高5常用CEC手性選擇劑人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、抗生素蛋白、卵類粘蛋白、α-酸性糖蛋白

等。手性引入方法柱前手性衍生化法手性流動相添加劑法

手性固定相法

Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀√常用CEC手性選擇劑手性引入方法Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀√6

總之，CEC以樣品與固定相之間的相互作用為分離機理，以電滲流為流動相驅(qū)動力。不僅具有CE水平的高柱效，而且具有HPLC水平的高選擇性。而且，CEC整體柱在手性分離中也顯示出一定優(yōu)勢。Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀返回總之，CEC以樣品與固定相之間的相互作用為分離7Ⅱ.實驗部分毛細管處理在毛細管內(nèi)聚合整體柱基質(zhì)用動態(tài)法在聚合整體柱基質(zhì)上鍵合BSA蛋白使用選擇性鍵合蛋白質(zhì)對手性物質(zhì)進行分離1.儀器和試劑（略）2.實驗方法Ⅱ.實驗部分毛細管處理在毛細管內(nèi)聚合整體柱基質(zhì)用動態(tài)法在聚合8二、在毛細管內(nèi)合成整體柱

返回單體交聯(lián)劑二、在毛細管內(nèi)合成整體柱

返回單體交聯(lián)劑9三、鍵合BSA蛋白

Epoxymethod返回三、鍵合BSA蛋白

Epoxymethod返回10四、使用選擇性鍵合蛋白質(zhì)對手性物質(zhì)進行分離。返回分離對象：D,L－組氨酸分離條件：運行緩沖溶液：2mM磷酸鹽緩沖液分離電壓：＋6kV檢測方法：

電導(dǎo)檢測四、使用選擇性鍵合蛋白質(zhì)對手性物質(zhì)進行分離。返回分離對象：D11Ⅲ.實驗結(jié)果與討論一、整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化二、整體柱分離D,L-組氨酸對映體Ⅲ.實驗結(jié)果與討論一、整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化12活性基團——IR滲透性——背壓孔結(jié)構(gòu)——SEM、氮吸附法整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化表1整體柱各性能的影響因素最佳聚合條件

單體含量交聯(lián)劑含量致孔劑含量活性基團√滲透性√√孔結(jié)構(gòu)

√活性基團——IR整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化表1整體柱各13環(huán)氧活性基團——IR

環(huán)氧基和酯基分別在約910cm-1和1730cm-1處有吸收。圖1整體柱基質(zhì)的紅外光譜圖環(huán)氧活性基團——IR環(huán)氧基和酯基分別在約9114單體含量對整體柱活性基團含量的影響

固定致孔劑和溶劑的含量，改變單體（）和交聯(lián)劑（）相對含量，用紅外光譜法比較環(huán)氧基吸收峰（約910cm-1）和酯基吸收峰（約1729cm-1）峰面積。返回

樣品號單體/交聯(lián)劑環(huán)氧基峰面積酯基峰面積環(huán)氧基與酯基峰面積之比1＃3：233.405559.39040.56252＃1：126.807249.15960.54533＃2：326.324553.51840.4919表2環(huán)氧基與酯基峰面積比較單體含量對整體柱活性基團含量的影響固定致孔劑和151.交聯(lián)劑含量對整體柱背壓的影響原因：隨著交聯(lián)劑用量的減少，相分離提前，使孔徑增大。樣品號

單體/交聯(lián)劑（v/v)流速（mL/min)背壓（MPa）C3#3:20.0053.4C6#1:10.0054.7C7#2:30.005>5.2表3不同交聯(lián)劑含量的整體柱基質(zhì)背壓1.交聯(lián)劑含量對整體柱背壓的影響原因：隨著交聯(lián)劑用量的減少，162.致孔劑含量對整體柱背壓的影響隨著致孔劑（非良性溶劑）用量增大，相分離提前，孔徑增大。返回圖2不同致孔劑含量整體柱基質(zhì)背壓2.致孔劑含量對整體柱背壓的影響隨著致孔劑（非良性溶劑）用量17孔結(jié)構(gòu)——SEM圖3K1#（50%致孔劑）SEM圖圖4K5#（10%致孔劑）SEM圖樣品號單體％交聯(lián)劑％溶劑％致孔劑％

K1＃

24161050K5＃

24165010表4整體柱基質(zhì)組成

孔結(jié)構(gòu)——SEM圖3K1#（50%致孔劑）SEM圖圖18孔結(jié)構(gòu)——氮吸附法

該整體柱基質(zhì)的孔都是中孔和大孔，孔徑分布在50nm-90nm范圍內(nèi)最多。圖5K1#（50％致孔劑）孔徑分布圖返回孔結(jié)構(gòu)——氮吸附法該整體柱基質(zhì)的孔都是中孔和大孔，孔19單體: 24%交聯(lián)劑: 16%致孔劑: 50%溶劑: 10%整體柱基質(zhì)聚合條件返回單體: 24%整體柱基質(zhì)聚合條件返回20CEC分離組氨酸對映體結(jié)果

在＋6.0kV的分離電壓下，以2mmol·L－1，

pH＝5.5磷酸鹽緩沖溶液作運行液，分離D,L-組氨酸，所得CEC圖。圖6D,L-組氨酸CEC圖

CEC分離組氨酸對映體結(jié)果在＋6.0kV的分離21表5緩沖液的pH值對分離效果的影響結(jié)論

緩沖液作運行液的pH值越高，BSA（pI=4.7）離解的負電荷越多，使正的電滲流越強，使保留時間越早。較高pH值的緩沖液作運行液時分離度下降是由于，正的電滲流較強，待分離對映體與手性選擇劑的作用來不及很好地進行，就被帶出毛細管。返回緩沖液pH

L-組氨酸t(yī)R（min）

D-組氨酸t(yī)R（min）分離度R5.0／／／5.56.236.681.06.05.025.560.4表5緩沖液的pH值對分離效果的影響結(jié)論返回緩沖液pH22Ⅳ實驗創(chuàng)新點通過條件實驗，用IR、測定背壓、SEM和氮吸附法等方法，確定出最佳聚合條件，成功制備出毛細管電色譜柱。用手性毛細管電色譜柱分離組氨酸對映體，并考察了運行緩沖液pH值對柱效及分離度的影響,并從原理上作出解釋。最簡便的方法（環(huán)氧基法），用BSA蛋白對毛細管整體柱進行修飾，制成手性毛細管電色譜柱。

首次建立了采用IR法定性和定量分析整體柱基質(zhì)表面的活性基團。Ⅳ實驗創(chuàng)新點通過條件實驗，用IR、測定背壓、SEM和氮吸23前景展望

目前，CEC在藥物分析方面已有廣泛的研究，集中在與藥物相關(guān)的雜質(zhì)分離和手性藥物的分離等。隨著毛細管電色譜技術(shù)的不斷完善和提高，將在生物技術(shù)、環(huán)境保護、農(nóng)業(yè)化學(xué)、精細化工產(chǎn)品、食品工業(yè)等多個領(lǐng)域的分析中得到應(yīng)用。在可預(yù)計的將來，CEC作為一種發(fā)展中的快速分離技術(shù)，將有更廣泛的應(yīng)用前景。前景展望目前，CEC在藥物分析方面已有廣泛的研究24致謝感謝創(chuàng)新化學(xué)實驗與研究基金項目感謝導(dǎo)師馬志玲副教授的悉心指導(dǎo)感謝凌連生、謝天堯、曾鋒、鄒世春等老師的關(guān)心和幫助感謝師兄師姐和朋友們對我的鼓勵和幫助致謝感謝創(chuàng)新化學(xué)實驗與研究基金項目25謝謝！謝謝！26BSA毛細管電色譜柱的制備及手性分離應(yīng)用02化工專業(yè)：伍品端指導(dǎo)老師：馬志玲副教授BSA毛細管電色譜柱的制備及手性分離應(yīng)用27目錄Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀Ⅱ.實驗部分Ⅲ.結(jié)果與討論Ⅳ.實驗創(chuàng)新點目錄Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀28Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀手性分離的重要性

生物大分子幾乎都具有“手性”特征。手性藥物各對映體的藥效學(xué)等可能存在很大的差異。

因而評價手性藥物各對映體的生物學(xué)活性,建立快速、準確、靈敏的對映體拆分方法具有十分重要的意義。

Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀手性分離的重要性29

拆分對映體的色譜技術(shù)：高效液相色譜高效毛細管電泳超臨界流體色譜

……

毛細管區(qū)帶電泳膠束電動色譜毛細管電色譜（CEC）(以電滲流為驅(qū)動力的微柱液相色譜技術(shù))……對映體分離機理：

手性選擇劑與對映體主要為疏水和靜電作用

，只有具備特定空間構(gòu)形和化學(xué)官能團的分子才能與這一區(qū)域結(jié)合。Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀

拆分對映體的色譜技術(shù)：毛細管區(qū)帶電泳對映體分離機理：30CEC的優(yōu)點：CELCCEC高效性高選擇性多功能性高效性、高選擇性、多功能性Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀CEC的優(yōu)點：CELCCEC高效性高選擇性多功能性高效性、高31常用CEC手性選擇劑人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、抗生素蛋白、卵類粘蛋白、α-酸性糖蛋白

等。手性引入方法柱前手性衍生化法手性流動相添加劑法

手性固定相法

Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀√常用CEC手性選擇劑手性引入方法Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀√32

總之，CEC以樣品與固定相之間的相互作用為分離機理，以電滲流為流動相驅(qū)動力。不僅具有CE水平的高柱效，而且具有HPLC水平的高選擇性。而且，CEC整體柱在手性分離中也顯示出一定優(yōu)勢。Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀返回總之，CEC以樣品與固定相之間的相互作用為分離33Ⅱ.實驗部分毛細管處理在毛細管內(nèi)聚合整體柱基質(zhì)用動態(tài)法在聚合整體柱基質(zhì)上鍵合BSA蛋白使用選擇性鍵合蛋白質(zhì)對手性物質(zhì)進行分離1.儀器和試劑（略）2.實驗方法Ⅱ.實驗部分毛細管處理在毛細管內(nèi)聚合整體柱基質(zhì)用動態(tài)法在聚合34二、在毛細管內(nèi)合成整體柱

返回單體交聯(lián)劑二、在毛細管內(nèi)合成整體柱

返回單體交聯(lián)劑35三、鍵合BSA蛋白

Epoxymethod返回三、鍵合BSA蛋白

Epoxymethod返回36四、使用選擇性鍵合蛋白質(zhì)對手性物質(zhì)進行分離。返回分離對象：D,L－組氨酸分離條件：運行緩沖溶液：2mM磷酸鹽緩沖液分離電壓：＋6kV檢測方法：

電導(dǎo)檢測四、使用選擇性鍵合蛋白質(zhì)對手性物質(zhì)進行分離。返回分離對象：D37Ⅲ.實驗結(jié)果與討論一、整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化二、整體柱分離D,L-組氨酸對映體Ⅲ.實驗結(jié)果與討論一、整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化38活性基團——IR滲透性——背壓孔結(jié)構(gòu)——SEM、氮吸附法整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化表1整體柱各性能的影響因素最佳聚合條件

單體含量交聯(lián)劑含量致孔劑含量活性基團√滲透性√√孔結(jié)構(gòu)

√活性基團——IR整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化表1整體柱各39環(huán)氧活性基團——IR

環(huán)氧基和酯基分別在約910cm-1和1730cm-1處有吸收。圖1整體柱基質(zhì)的紅外光譜圖環(huán)氧活性基團——IR環(huán)氧基和酯基分別在約9140單體含量對整體柱活性基團含量的影響

固定致孔劑和溶劑的含量，改變單體（）和交聯(lián)劑（）相對含量，用紅外光譜法比較環(huán)氧基吸收峰（約910cm-1）和酯基吸收峰（約1729cm-1）峰面積。返回

樣品號單體/交聯(lián)劑環(huán)氧基峰面積酯基峰面積環(huán)氧基與酯基峰面積之比1＃3：233.405559.39040.56252＃1：126.807249.15960.54533＃2：326.324553.51840.4919表2環(huán)氧基與酯基峰面積比較單體含量對整體柱活性基團含量的影響固定致孔劑和411.交聯(lián)劑含量對整體柱背壓的影響原因：隨著交聯(lián)劑用量的減少，相分離提前，使孔徑增大。樣品號

單體/交聯(lián)劑（v/v)流速（mL/min)背壓（MPa）C3#3:20.0053.4C6#1:10.0054.7C7#2:30.005>5.2表3不同交聯(lián)劑含量的整體柱基質(zhì)背壓1.交聯(lián)劑含量對整體柱背壓的影響原因：隨著交聯(lián)劑用量的減少，422.致孔劑含量對整體柱背壓的影響隨著致孔劑（非良性溶劑）用量增大，相分離提前，孔徑增大。返回圖2不同致孔劑含量整體柱基質(zhì)背壓2.致孔劑含量對整體柱背壓的影響隨著致孔劑（非良性溶劑）用量43孔結(jié)構(gòu)——SEM圖3K1#（50%致孔劑）SEM圖圖4K5#（10%致孔劑）SEM圖樣品號單體％交聯(lián)劑％溶劑％致孔劑％

K1＃

24161050K5＃

24165010表4整體柱基質(zhì)組成

孔結(jié)構(gòu)——SEM圖3K1#（50%致孔劑）SEM圖圖44孔結(jié)構(gòu)——氮吸附法

該整體柱基質(zhì)的孔都是中孔和大孔，孔徑分布在50nm-90nm范圍內(nèi)最多。圖5K1#（50％致孔劑）孔徑分布圖返回孔結(jié)構(gòu)——氮吸附法該整體柱基質(zhì)的孔都是中孔和大孔，孔45單體: 24%交聯(lián)劑: 16%致孔劑: 50%溶劑: 10%整體柱基質(zhì)聚合條件返回單體: 24%整體柱基質(zhì)聚合條件返回46CEC分離組氨酸對映體結(jié)果

在＋6.0kV的分離電壓下，以2mmol·L－1，

pH＝5.5磷酸鹽緩沖溶液作運行液，分離D,L-組氨酸，所得CEC圖。圖6D,L-組氨酸CEC圖

CEC分離組氨酸對映體結(jié)果在＋6.0kV的分離47表5緩沖液的pH值對分離效果的影響結(jié)論

緩沖液作運行液的pH值越高，BSA（pI=4.7）離解的負電荷越多，使正的電滲流越強，使保留時間越早。較高pH值的緩沖液作運行液時分離度下降是由于，正的電滲流較強，待分離對映體與手性選擇劑的作用來不及很好