基因表達(dá)調(diào)控與重組DNA技術(shù)課件

第十三---十五章基因表達(dá)調(diào)控及重組DNA技術(shù)第十三---十五章主要內(nèi)容

基因及基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)概念原核基因表達(dá)調(diào)控基本原理真核基因表達(dá)調(diào)控基本原理重組DNA技術(shù)相關(guān)概念重組DNA技術(shù)基本原理2主要內(nèi)容基因及基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)概念2

負(fù)載特定遺傳信息的DNA片段，包括：DNA編碼序列、非編碼調(diào)節(jié)序列和內(nèi)含子序列。

基因（Gene）負(fù)載特定遺傳信息的DNA片段，包括：DNA編碼序列、基因組（Genome）

來自一個遺傳體系的一整套遺傳信息原核：單個環(huán)狀染色體所含的全部基因真核：一個生物體的染色體所包含的全部

DNA，又稱染色體基因組線粒體基因組葉綠體基因組基因組（Genome）來自一個遺傳體系的一整套遺傳信息原核HumanGenomeHumanGenome人類基因組計劃（HumanGenomeProject,HGP）1985年美國提出計劃投入30億美元，15年完成

1990年正式啟動英、法、德、日、中國等先后加入中國的任務(wù)：人類3號染色體短臂上一個約30Mb區(qū)域的測序，該區(qū)域約占人類整個基因組的1％。

人類基因組計劃1985年美國提出中國的任務(wù)：年10月啟動2000年6月完成草圖2001年2月《nature》公布草圖

Nature,409(6822):860-921,2001

2004年10月《nature》公布精度>99%的測序圖人類基因數(shù)：2-2.5萬

Nature,431(7011):931-945,2004HGP的進(jìn)展Thepost-genomeeraiscoming年10月啟動HGP的進(jìn)展Thepost-ge譜主為生物學(xué)大師耗資200萬完成盼未來降價普及助提早預(yù)防疾病“生命天書”——首份個人基因圖公布

(2007.5.30)JamesWaston譜主為生物學(xué)大師“生命天書”——首份個人基因圖公布Ja

基因表達(dá)調(diào)控是指細(xì)胞生物接受環(huán)境信號刺激或適應(yīng)環(huán)境營養(yǎng)供給狀況的變化，在基因表達(dá)水平上作出應(yīng)答反應(yīng)的分子機(jī)制。重組DNA技術(shù)本質(zhì)上是一項生物技術(shù)，目的在于通過人工重組DNA的方法，獲得某一目的基因的無性繁殖系—DNA克隆，或使目的基因在一定的表達(dá)體系表達(dá)有特殊意義的蛋白質(zhì)。主要研究內(nèi)容：基因表達(dá)方式、規(guī)律、調(diào)節(jié)機(jī)理基因表達(dá)調(diào)控是指細(xì)胞生物接受環(huán)境信號刺激或適應(yīng)環(huán)境營養(yǎng)供給第一節(jié)基因表達(dá)調(diào)控10第一節(jié)基因表達(dá)調(diào)控10一、基因表達(dá)的概念*

在各種調(diào)節(jié)機(jī)制控制下，從基因激活開始，經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程產(chǎn)生具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子，從而賦予細(xì)胞一定的功能或表型，或使生物體獲得一定的遺傳性狀。11一、基因表達(dá)的概念*在各種調(diào)節(jié)機(jī)制控制下，從基因激活

DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄簡單定義：轉(zhuǎn)錄＋翻譯廣義：包括rRNA、tRNA的表達(dá)DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄簡單定義：轉(zhuǎn)錄＋翻譯廣二、基因表達(dá)調(diào)控的意義

生物體基因數(shù)量很多，但在某一特定時期只有一小部分基因處于活化狀態(tài)，能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄（例如，真核細(xì)胞約2～5％基因具轉(zhuǎn)錄活性）。因此，機(jī)體內(nèi)存在著復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。通過調(diào)控基因的表達(dá)，使生物體適應(yīng)環(huán)境、調(diào)節(jié)代謝、維持其生長與繁殖?；虮磉_(dá)調(diào)控的意義：13二、基因表達(dá)調(diào)控的意義生物體基因數(shù)量很多，但在某一特定三、基因表達(dá)的規(guī)律*

階段特異性（時間特異性）

組織特異性（空間特異性）14三、基因表達(dá)的規(guī)律*階段特異性（時間特異性）組織特

階段特異性（時間特異性）甲胎蛋白

某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按一定的時間順序發(fā)生，稱時間特異性*

多細(xì)胞生物的不同基因在不同發(fā)育階段按特定時間順序開啟和關(guān)閉，稱階段特異性*哺乳類nAChR：胚胎型α2βγδ(煙堿型乙酰膽堿受體)

成年型α2βεδ15階段特異性（時間特異性）甲胎蛋白某一特定基因的

組織特異性（空間特異性）在個體生長的某一階段，不同細(xì)胞有不同基因表達(dá)胰島素：胰島細(xì)胞血紅蛋白：紅細(xì)胞鳥氨酸循環(huán)酶類：肝細(xì)胞X

YXY

AB16組織特異性（空間特異性）在個體生長的某一階段，不同細(xì)胞四、基因表達(dá)的方式

有些基因的產(chǎn)物對于生物體的整個生命過程都是必不可少的，這類基因在生物體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，這類基因被稱為管家基因。這類基因的表達(dá)稱為基本的基因表達(dá)*

。例如：葡萄糖酵解途徑中各種酶的編碼基因基本的基因表達(dá)也是在一定機(jī)制控制下進(jìn)行（一）基本的基因表達(dá)17四、基因表達(dá)的方式有些基因的產(chǎn)物對于生物體的整個生命過（二）可調(diào)節(jié)的基因表達(dá)

與管家基因不同，另一些基因表達(dá)狀況極易受外環(huán)境變化的影響，隨外環(huán)境變化，這類基因表達(dá)水平可升高或降低,又稱適應(yīng)性表達(dá)；又稱奢侈基因。

特點：不是細(xì)胞生命必不可少的表達(dá)受外環(huán)境的影響較大，不恒定表達(dá)有間斷性和空間特異性18（二）可調(diào)節(jié)的基因表達(dá)與管家基因不同，另一些基因

誘導(dǎo)基因表達(dá)水平在特定環(huán)境中增高的現(xiàn)象這類基因叫可誘導(dǎo)基因阻遏基因?qū)Νh(huán)境信號應(yīng)答表現(xiàn)為表達(dá)水平降低這類基因叫可阻遏基因DNA損傷：DNA損傷修復(fù)酶被誘導(dǎo)色氨酸供應(yīng)充足：參與合成色氨酸的酶被阻遏誘導(dǎo)阻遏DNA損傷：DNA損傷修復(fù)酶被誘導(dǎo)五.基因表達(dá)的多級調(diào)控基因表達(dá)調(diào)控在多級水平上進(jìn)行基因激活

轉(zhuǎn)錄起始*

轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運mRNA降解

翻譯及翻譯后加工

蛋白質(zhì)降解20五.基因表達(dá)的多級調(diào)控基因表達(dá)調(diào)控在多級水平上進(jìn)行基因激活六、基因表達(dá)調(diào)控原理以mRNA轉(zhuǎn)錄為例DNA元件調(diào)節(jié)蛋白RNA聚合酶活性*調(diào)控要素（一）轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)基因表達(dá)21六、基因表達(dá)調(diào)控原理以mRNA轉(zhuǎn)錄為例DNA元件*調(diào)控

（1）DNA元件：具有調(diào)節(jié)功能的特異DNA序列操縱子：由功能上相關(guān)的一組酶或蛋白質(zhì)基因在染色體上串聯(lián)一起并共同享用同一表達(dá)調(diào)控的DNA組件所構(gòu)成的一個轉(zhuǎn)錄單位。操縱子調(diào)節(jié)序列編碼序列：編碼蛋白質(zhì)啟動序列：結(jié)合RNA聚合酶操縱序列：結(jié)合阻遏蛋白*1、原核生物（1）DNA元件：具有調(diào)節(jié)功能的特異DNA序列操縱子：由

操縱子結(jié)構(gòu)編碼序列

啟動序列

操縱序列其他調(diào)節(jié)序列(promoter)(operator)PO(codingsequence)操縱子結(jié)構(gòu)編碼序列啟動序列操縱序列其他調(diào)節(jié)序列(p

原核生物啟動序列（啟動子）RNA轉(zhuǎn)錄起始-35區(qū)-10區(qū)TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrptRNATyrlacrecAAraBADTTGACA

TATAAT一致序列原核生物啟動序列（啟動子）RNA轉(zhuǎn)錄起始-35區(qū)-10區(qū)T

（2）調(diào)節(jié)蛋白特異因子

決定RNA聚合酶特異識別并結(jié)合啟動序列的能力（σ因子）阻遏蛋白

與操縱序列結(jié)合，抑制RNA聚合酶活性

（負(fù)性調(diào)節(jié)）激活蛋白

促進(jìn)RNA聚合酶活性（正性調(diào)節(jié)）（2）調(diào)節(jié)蛋白特異因子決定RNA聚合酶特異識別并結(jié)合

（3）

RNA聚合酶活性

DNA元件與調(diào)節(jié)蛋白對轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)作用最終由RNA聚合酶活性體現(xiàn)。啟動序列或啟動子的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)蛋白的性質(zhì)對RNA聚合酶活性影響最大。（3）RNA聚合酶活性DNA元件與調(diào)節(jié)蛋白2.真核生物（1）順式作用元件：（2）反式作用因子：

（3）mRNA轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)2.真核生物（1）順式作用元件：第二節(jié)原核基因表達(dá)調(diào)控與真核基因表達(dá)調(diào)控的基本原理28第二節(jié)原核基因表達(dá)調(diào)控與真核基因表達(dá)調(diào)控的基本原理28一、原核基因表達(dá)及其調(diào)控的特點1、轉(zhuǎn)錄與翻譯兩過程緊密偶聯(lián)3、操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制中普遍存在阻遏蛋白介導(dǎo)的負(fù)性調(diào)節(jié)*2、普遍存在操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制阻遏蛋白操縱序列結(jié)合阻遏解聚結(jié)合去阻遏阻礙29一、原核基因表達(dá)及其調(diào)控的特點1、轉(zhuǎn)錄與翻譯兩過程緊密偶聯(lián)

4、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為多順反子mRNA5、轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)調(diào)控的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)*多順反子mRNA：多個功能相關(guān)的基因串聯(lián)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在一條mRNA上，翻譯產(chǎn)物為多個多肽鏈4、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為多順反子mRNA5、轉(zhuǎn)錄起始是基二、操縱子理論通常一個操縱子含有一個啟動序列及數(shù)個編碼基因（2～6個，甚至更多），還有其它調(diào)節(jié)序列。編碼序列

啟動序列

操縱序列其他調(diào)節(jié)序列(promoter)(operator)PO(codingsequence)操縱子結(jié)構(gòu)31二、操縱子理論編碼序列啟動序列操縱序列其他調(diào)節(jié)序列(乳糖操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制

阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)

CAP的正性調(diào)節(jié)協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)32乳糖操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制32

乳糖操縱子結(jié)構(gòu)CAP結(jié)合位點PIIPOZYA調(diào)控區(qū)結(jié)構(gòu)基因I:阻遏蛋白編碼基因

PI:阻遏蛋白基因啟動序列

Z:β-半乳糖苷酶Y:透酶

A:乙?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)基因O:操縱序列（阻遏蛋白結(jié)合部位）P:啟動序列CAP結(jié)合位點調(diào)控區(qū)乳糖操縱子結(jié)構(gòu)CAP結(jié)合位點PIIPOZYA調(diào)控區(qū)結(jié)

1.阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)（無乳糖）*阻遏蛋白與O序列結(jié)合,抑制轉(zhuǎn)錄,lac操縱子關(guān)閉阻遏蛋白mRNACAP結(jié)合位點PIIPOZYARNA聚合酶

1.阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)（無乳糖）*阻遏蛋白與O序列結(jié)合

誘導(dǎo)劑結(jié)合于阻遏蛋白，阻遏蛋白與O序列解離，轉(zhuǎn)錄抑制解除，lac操縱子開啟乳糖別乳糖CAP結(jié)合位點PIIPOZYAmRNA

阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)（有乳糖）*

誘導(dǎo)劑結(jié)合于阻遏蛋白，阻遏蛋白與O序列解離，轉(zhuǎn)錄抑制解除，

CAP:分解代謝基因激活蛋白

catabolitegeneactivatorprotein同二聚體cAMP

結(jié)合區(qū)

DNA

結(jié)合區(qū)CAP:分解代謝基因激活蛋白同二聚體cAMP結(jié)合區(qū)

2.CAP的正性調(diào)節(jié)（無葡萄糖）*cAMPCAP蛋白PIIPOZYACAP結(jié)合位點mRNA無葡萄糖，cAMP濃度高cAMP與CAP結(jié)合

與CAP結(jié)合位點結(jié)合轉(zhuǎn)錄活性提高約50倍

2.CAP的正性調(diào)節(jié)（無葡萄糖）*cAMPCAP蛋白P

CAP的正性調(diào)節(jié)（有葡萄糖）*cAMPCAP蛋白PIIPOZYACAP結(jié)合位點mRNA有葡萄糖，cAMP濃度低cAMP與CAP結(jié)合受阻轉(zhuǎn)錄活性下降

CAP的正性調(diào)節(jié)（有葡萄糖）*cAMPCAP蛋白PI

阻遏蛋白mRNACAP結(jié)合位點PIIPOZYARNA聚合酶

3.阻遏蛋白與CAP的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)*（1）無乳糖時,阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄，CAP無作用阻遏蛋白mRNACAP結(jié)合位點PIIPOZYARNA聚合

（2）有乳糖時,乳糖操縱子去阻遏,雖可轉(zhuǎn)錄,

但活性很低,必須由CAP的正性調(diào)節(jié)來加強(qiáng)PIIPOZYACAP結(jié)合位點mRNA

（2）有乳糖時,乳糖操縱子去阻遏,雖可轉(zhuǎn)錄,P

乳糖操縱子強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖乳糖操縱子強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性（一）真核基因結(jié)構(gòu)特點1.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子

一個基因——

一條mRNA——

一條多肽鏈2.重復(fù)序列

高度重復(fù)序列、中度重復(fù)序列、單拷貝序列3.基因不連續(xù)性

非編碼序列內(nèi)含子1235’3’三、真核基因表達(dá)調(diào)控42（一）真核基因結(jié)構(gòu)特點1.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為

（二）真核基因轉(zhuǎn)錄特點活性染色體結(jié)構(gòu)變化

對核酸酶敏感、甲基化程度降低、組蛋白乙酰化修飾2.正性調(diào)節(jié)占主導(dǎo)

真核RNA聚合酶對啟動子的親和力極小或根本沒有實質(zhì)的親和力，轉(zhuǎn)錄起始需依賴多種激活蛋白的作用3．轉(zhuǎn)錄與翻譯分隔進(jìn)行

轉(zhuǎn)錄在核內(nèi)進(jìn)行，翻譯在胞漿進(jìn)行（二）真核基因轉(zhuǎn)錄特點活性染色體結(jié)構(gòu)變化2.正性調(diào)節(jié)

轉(zhuǎn)錄（起始）調(diào)節(jié)實質(zhì)上是調(diào)節(jié)蛋白與DNA的相互作用

1、順式作用元件：2、反式作用因子：

3、mRNA轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)（三）真核基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)44轉(zhuǎn)錄（起始）調(diào)節(jié)實質(zhì)上是調(diào)節(jié)蛋白與DNA的相互作用1

1.順式作用元件*

指結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)或內(nèi)部具有調(diào)節(jié)功能的DNA序列，因其作用于自身分子并發(fā)揮作用，所以稱順式作用元件。

根據(jù)位置、性質(zhì)及作用方式的不同分為啟動子、增強(qiáng)子和抑制子。1.順式作用元件*指結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)或內(nèi)部具有

真核生物——順式作用元件結(jié)構(gòu)基因序列

啟動子(promoter)P

抑制子(silencer)

增強(qiáng)子(enhancer)

增強(qiáng)子(enhancer)46真核生物——順式作用元件結(jié)構(gòu)基因序列啟動子(promRNA聚合酶II啟動位點周圍一組轉(zhuǎn)錄控制組件常見組件：

TATA盒（TATAAA）-25bp~-30bp

GC盒（GGGCGG）

CAAT盒（CCAATC）CAAT盒GC盒TATA盒轉(zhuǎn)錄起始點-30bp~-110bp啟動子promoter47RNA聚合酶II啟動位點周圍一組轉(zhuǎn)錄控制組件常見組件：CA

增強(qiáng)子*

：

遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點、決定組織特異性表達(dá)、增強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄活性的特異DNA序列，其發(fā)揮作用的方式與方向、距離無關(guān)。

抑制子*

：

對啟動子轉(zhuǎn)錄活性起抑制作用的DNA序列負(fù)性調(diào)節(jié)元件增強(qiáng)子*：抑制子*：

2、反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子）轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白

基本轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄抑制因子2、反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子）

絕大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子屬于反式作用因子*真核生物：由某一基因表達(dá)后，通過DNA-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用控制另一基因的轉(zhuǎn)錄。絕大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子屬于反式作用因子*真核生物：由某一基因表達(dá)

ABAB

RNA聚合酶結(jié)合啟動子所必須的一組轉(zhuǎn)錄因子

基本轉(zhuǎn)錄因子FEBDARNA

polⅡTATADNATATATFⅡD

TFⅡA

TFⅡB

TFⅡF

TFⅡERNApolⅡRNA聚合酶結(jié)合啟動子所必須的一組轉(zhuǎn)錄因子基本轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄激活因子（正性調(diào)節(jié)因子）

通過DNA－蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用起正性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。

轉(zhuǎn)錄抑制因子（負(fù)性調(diào)節(jié)因子）

通過DNA－蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用起負(fù)性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。與增強(qiáng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子與抑制子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活因子（正性調(diào)節(jié)因子）轉(zhuǎn)錄抑制因子（真核RNA聚合酶II不能單獨識別啟動子，而是由基本轉(zhuǎn)錄因子TFIID識別并結(jié)合啟動子，形成TFIID－啟動子復(fù)合物，然后有一系列的轉(zhuǎn)錄因子（如TFIIA、TFIIB、TFIIE、TFIIF等）加入形成前起始復(fù)合物，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的起始。3．mRNA轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)54真核RNA聚合酶II不能單獨識別啟動子，而是由基本轉(zhuǎn)錄因子T第三節(jié)重組DNA技術(shù)55第三節(jié)重組DNA技術(shù)55基因重組（geneticrecombination）

自然發(fā)生的基因重排真核、原核均會發(fā)生基因變異、物種演變、生物進(jìn)化的基礎(chǔ)基因工程（geneticengineering）重組DNA技術(shù)人工進(jìn)行基因重組基因重組（geneticrecombination）自

克隆*(名詞)：就是指來自同一母本的所有副本或拷貝的集合。克隆化（動詞）：獲取同一拷貝的過程。二、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念母本克隆clonecloning（一）克隆與克隆化57克隆*(名詞)：就是指來自同一母本

細(xì)胞克?。簭拇罅咳后w細(xì)胞中分離出某一種類型細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)增獲得這樣一類相同的細(xì)胞。在分子生物學(xué)領(lǐng)域所說的分子克隆專指

DNA克隆(DNAcloning)。

分子克?。簭谋姸嗖煌姆肿尤后w中分離到的很多相同分子的集合。細(xì)胞克?。涸诜肿由飳W(xué)領(lǐng)域所說的分子克隆專指分子克隆：（二）重組DNA技術(shù)*

應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（目的基因或目的DNA）與載體DNA連接成復(fù)制子，然后通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞，生長、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增、提取，獲得大量目的DNA的無性繁殖系，即DNA克隆，基因工程。59（二）重組DNA技術(shù)*應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各

目的DNA載體DNA連接復(fù)制子（重組DNA）導(dǎo)入宿主細(xì)胞（轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染）轉(zhuǎn)化子細(xì)胞轉(zhuǎn)化子細(xì)胞擴(kuò)增，可獲得大量重組DNA目的DNA載體DNA連接復(fù)制子（重組DNA）導(dǎo)入宿主細(xì)

基因克隆DNA克隆重組DNA同一概念生物技術(shù)工程基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程

獲得DNA的無性繁殖系獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物重組DNA的目的

基因克隆同一概念生物技術(shù)工程基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、蛋（三）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶連接酶DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶多聚核苷酸激酶62（三）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶62

限制性核酸內(nèi)切酶*識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)部特異核苷酸序列的一類核酸酶。限制性核酸內(nèi)切酶共分三類，基因工程常用II類酶，這類酶常識別DNA的回文序列

*

。限制性核酸內(nèi)切酶*識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)部特異核苷酸序

HpaI：5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’平端PstI：5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’突出粘性末端EcoRI：5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’突出粘性末端HpaI：5’-GTTAAC-3’平端Pst

（四）目的基因targetgenecDNA(complementaryDNA)

在體外以RNA（通常為mRNA）為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的單鏈DNA?；蚪MDNA(genomicDNA)

代表一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列。目的基因又稱外源DNA（四）目的基因targetgenecDNA(c

攜帶外源DNA，實現(xiàn)外源DNA無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體：質(zhì)粒噬菌體DNA病毒DNA質(zhì)粒（1）雙鏈環(huán)狀DNA，細(xì)菌染色體外（2）2-3kb或數(shù)百kb

（3）獨立自主復(fù)制，穩(wěn)定遺傳（4）遺傳標(biāo)志(五)基因載體（克隆載體）66質(zhì)粒（1）雙鏈環(huán)狀DNA，細(xì)菌染色體外(五)基因載三、重組DNA技術(shù)的原理與基本過程*1.獲取目的基因2.選擇、構(gòu)建基因載體3.目的基因與載體連接，形成重組分子4.重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞5.篩選、擴(kuò)增6.表達(dá)目的基因67三、重組DNA技術(shù)的原理1.獲取目的基因67

+載體目的基因重組DNA分子細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染擴(kuò)增篩選+載體目的基因重組DNA分子細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染擴(kuò)增篩選（1）化學(xué)合成（4）PCR（2）基因組DNA文庫

（3）cDNA文庫1.獲取目的基因69（1）化學(xué)合成（4）PCR（2）基因組DNA文庫

組織或細(xì)胞染色體

限制性內(nèi)切酶多個DNA片段載體多種轉(zhuǎn)化子

（基因文庫）重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNAcDNA文庫組織或細(xì)胞染色體限制性內(nèi)切酶多個DNA片段載體多種轉(zhuǎn)化子聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

在有特定模板、特異DNA引物及合成DNA所需要的dNTP存在時，向DNA合成體系內(nèi)加入耐熱的DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶*

），經(jīng)反復(fù)變性、退火及延伸的多個循環(huán)反應(yīng)，生成特異DNA產(chǎn)物的過程。71聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）在有特定模板、特異DNA

變性：解開模板雙鏈DNA95℃退火：使引物與單鏈模板DNA結(jié)合

55℃延伸：DNA鏈的合成

72℃變性：解開模板雙鏈DNA退火：使引物與單鏈模板DNA結(jié)合延

2.克隆載體的選擇與構(gòu)建目的基因不能自我復(fù)制3.目的基因與載體連接（DNA連接酶*

）重組DNA4.重組DNA導(dǎo)入受體菌安全菌感受態(tài)導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染感染2.克隆載體的選擇與構(gòu)建3.目的基因與載體連接（DN

5.重組體的篩選（1）直接選擇法

抗藥性標(biāo)志選擇amprtetrkanr

標(biāo)志補(bǔ)救α互補(bǔ)分子雜交（2）非直接選擇法

常用免疫學(xué)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高5.重組體的篩選（1）直接選擇法（2）非直接選擇法

6.克隆基因的表達(dá)

常見表達(dá)體系：（1）原核——大腸桿菌（簡單、迅速、經(jīng)濟(jì)）缺點：無轉(zhuǎn)錄后加工——適于表達(dá)cDNA

無翻譯后加工——無糖基化修飾包涵體

（2）真核——酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳類動物細(xì)胞表達(dá)有生物活性的蛋白質(zhì)6.克隆基因的表達(dá)常見表達(dá)體系：（2）真核——酵母、四、重組DNA技術(shù)的應(yīng)用1.疾病基因的發(fā)現(xiàn)鐮刀形紅細(xì)胞貧血脆性X綜合征(FMRI基因沉默)2.生物制藥

利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)有藥用價值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界上的一項重大產(chǎn)業(yè)。如生產(chǎn)干擾素、胰島素、細(xì)胞因子等。76四、重組DNA技術(shù)的應(yīng)用1.疾病基因的發(fā)現(xiàn)鐮刀形紅細(xì)胞貧3.DNA診斷

DNA診斷又稱基因診斷，是利用分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的技術(shù)和原理，在DNA水平上分析、鑒定遺傳性疾病所涉及的基因置換、缺失或插入等突變。4.基因治療

所謂基因治療就是向功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能的基因，以糾正或補(bǔ)償其基因缺陷，從而達(dá)到治療的目的。對于基因治療，人們擔(dān)心的潛在危險之一是可能會引起未知的遺傳效應(yīng)，如腫瘤等，此外還涉及社會倫理方面的爭論。5.遺傳病的預(yù)防3.DNA診斷DNA診斷又稱基因診斷，是利

本章重點

基本概念

基因表達(dá)、操縱子、DNA元件、順式作用元件、反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子）、啟動子、增強(qiáng)子、基因工程、限制性核酸內(nèi)切酶、管家基因

原核基因表達(dá)調(diào)控特點

乳糖操縱子結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制

基因表達(dá)調(diào)控的規(guī)律、方式、要素本章重點基本概念原核基因表達(dá)調(diào)控特點乳糖操縱

PCR原理及基本過程

重組DNA技術(shù)基本原理

真核基因轉(zhuǎn)錄特點

真核基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)

真核基因結(jié)構(gòu)特點PCR原理及基本過程重組DNA技術(shù)基本原理1、Geniusonlymeanshard-workingallone'slife.(Mendeleyer,RussianChemist)

天才只意味著終身不懈的努力。20.8.58.5.202011:0311:03:10Aug-2011:032、Ourdestinyoffersnotonlythecupofdespair,butthechaliceofopportunity.(RichardNixon,AmericanPresident)命運給予我們的不是失望之酒，而是機(jī)會之杯。二〇二〇年八月五日2020年8月5日星期三3、Patienceisbitter,butitsfruitissweet.(JeanJacquesRousseau,Frenchthinker)忍耐是痛苦的，但它的果實是甜蜜的。11:038.5.202011:038.5.202011:0311:03:108.5.202011:038.5.20204、Allthatyoudo,dowithyourmight;thingsdonebyhalvesareneverdoneright.----R.H.Stoddard,Americanpoet做一切事都應(yīng)盡力而為，半途而廢永遠(yuǎn)不行8.5.20208.5.202011:0311:0311:03:1011:03:105、Youhavetobelieveinyourself.That'sthesecretofsuccess.----CharlesChaplin人必須相信自己，這是成功的秘訣。-Wednesday,August5,2020August20Wednesday,August5,20208/5/20206、Almostanysituation---goodorbad---isaffectedbytheattitudewebringto.----LuciusAnnausSeneca差不多任何一種處境---無論是好是壞---都受到我們對待處境態(tài)度的影響。11時3分11時3分5-Aug-208.5.20207、Althoughtheworldisfullofsuffering,itisfullalsooftheovercomingofit.----HellenKeller,Americanwriter雖然世界多苦難，但是苦難總是能戰(zhàn)勝的。20.8.520.8.520.8.5。2020年8月5日星期三二〇二〇年八月五日8、Formanismanandmasterofhisfate.----Tennyson人就是人，是自己命運的主人11:0311:03:108.5.2020Wednesday,August5,20209、Whensuccesscomesinthedoor,itseems,loveoftengoesoutthewindow.-----JoyceBrothers成功來到門前時，愛情往往就走出了窗外。11:038.5.202011:038.5.202011:0311:03:108.5.202011:038.5.202010、Lifeismeasuredbythoughtandaction,notbytime.——Lubbock衡量生命的尺度是思想和行為，而不是時間。8.5.20208.5.202011:0311:0311:03:1011:03:1011、Tomakealastingmarriagewehavetoovercomeself-centeredness.要使婚姻長久，就需克服自我中心意識。Wednesday,August5,2020August20Wednesday,August5,20208/5/202012、Treatotherpeopleasyouhopetheywilltreatyou.你希望別人如何對待你，你就如何對待別人。11時3分11時3分5-Aug-208.5.202013、Todowhateverneedstobedoneto

preservethislastandgreatestbastionof

freedom.(RonaldReagan,AmericanPresident)為了保住這最后的、最偉大的自由堡壘，我們必須盡我們所能。20.8.520.8.5Wednesday,August5,202014、Wherethereisawill,thereisaway.(ThomasEdison,Americaninventor)有志者，事竟成。11:01:1911:01:1911:018/5/202011:01:19AM15、

Everymanisthemasterofhisownfortune.----RichardSteele每個人都主宰自己的命運。20.8.511:01:1911:01Aug-205-Aug-2016、Asselfishnessandcomplaintcloudthemind,solovewithitsjoyclearsandsharpensthevision.----HelenKeller自私和抱怨是心靈的陰暗，愉快的愛則使視野明朗開闊。11:01:1911:01:1911:01Wednesday,August5,202017、Donot,foronerepulse,giveupthepurposethatyouresolvedtoeffect.----WillianShakespeare,Britishdramatist不要只因一次失敗，就放棄你原來決心想達(dá)到的目的。20.8.520.8.511:01:1911:01:19August5,202018、Thereisnoabsolutesuccessintheworld,onlyconstantprogress.世界上的事沒有絕對成功，只有不斷的進(jìn)步。2020年8月5日星期三上午11時1分19秒11:01:1920.8.519、Nothingismorefataltohappinessthantheremembranceofhappiness.

沒有什么比回憶幸福更令人痛苦的了。2020年8月上午11時1分20.8.511:01August5,202020、Nomanishappywhodoesnotthinkhimselfso.——PubliliusSyrus認(rèn)為自己不幸福的人就不會幸福。2020年8月5日星期三11時1分19秒11:01:195August202021、Theemperortreatstalentastools,usingtheirstrongpointtohisadvantage.

君子用人如器，各取所長。上午11時1分19秒上午11時1分11:01:1920.8.5謝謝觀看THEEND1、Geniusonlymeanshard-worki

第十三---十五章基因表達(dá)調(diào)控及重組DNA技術(shù)第十三---十五章主要內(nèi)容

基因及基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)概念原核基因表達(dá)調(diào)控基本原理真核基因表達(dá)調(diào)控基本原理重組DNA技術(shù)相關(guān)概念重組DNA技術(shù)基本原理82主要內(nèi)容基因及基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)概念2

負(fù)載特定遺傳信息的DNA片段，包括：DNA編碼序列、非編碼調(diào)節(jié)序列和內(nèi)含子序列。

基因（Gene）負(fù)載特定遺傳信息的DNA片段，包括：DNA編碼序列、基因組（Genome）

來自一個遺傳體系的一整套遺傳信息原核：單個環(huán)狀染色體所含的全部基因真核：一個生物體的染色體所包含的全部

DNA，又稱染色體基因組線粒體基因組葉綠體基因組基因組（Genome）來自一個遺傳體系的一整套遺傳信息原核HumanGenomeHumanGenome人類基因組計劃（HumanGenomeProject,HGP）1985年美國提出計劃投入30億美元，15年完成

1990年正式啟動英、法、德、日、中國等先后加入中國的任務(wù)：人類3號染色體短臂上一個約30Mb區(qū)域的測序，該區(qū)域約占人類整個基因組的1％。

人類基因組計劃1985年美國提出中國的任務(wù)：年10月啟動2000年6月完成草圖2001年2月《nature》公布草圖

Nature,409(6822):860-921,2001

2004年10月《nature》公布精度>99%的測序圖人類基因數(shù)：2-2.5萬

Nature,431(7011):931-945,2004HGP的進(jìn)展Thepost-genomeeraiscoming年10月啟動HGP的進(jìn)展Thepost-ge譜主為生物學(xué)大師耗資200萬完成盼未來降價普及助提早預(yù)防疾病“生命天書”——首份個人基因圖公布

(2007.5.30)JamesWaston譜主為生物學(xué)大師“生命天書”——首份個人基因圖公布Ja

基因表達(dá)調(diào)控是指細(xì)胞生物接受環(huán)境信號刺激或適應(yīng)環(huán)境營養(yǎng)供給狀況的變化，在基因表達(dá)水平上作出應(yīng)答反應(yīng)的分子機(jī)制。重組DNA技術(shù)本質(zhì)上是一項生物技術(shù)，目的在于通過人工重組DNA的方法，獲得某一目的基因的無性繁殖系—DNA克隆，或使目的基因在一定的表達(dá)體系表達(dá)有特殊意義的蛋白質(zhì)。主要研究內(nèi)容：基因表達(dá)方式、規(guī)律、調(diào)節(jié)機(jī)理基因表達(dá)調(diào)控是指細(xì)胞生物接受環(huán)境信號刺激或適應(yīng)環(huán)境營養(yǎng)供給第一節(jié)基因表達(dá)調(diào)控90第一節(jié)基因表達(dá)調(diào)控10一、基因表達(dá)的概念*

在各種調(diào)節(jié)機(jī)制控制下，從基因激活開始，經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程產(chǎn)生具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子，從而賦予細(xì)胞一定的功能或表型，或使生物體獲得一定的遺傳性狀。91一、基因表達(dá)的概念*在各種調(diào)節(jié)機(jī)制控制下，從基因激活

DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄簡單定義：轉(zhuǎn)錄＋翻譯廣義：包括rRNA、tRNA的表達(dá)DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄簡單定義：轉(zhuǎn)錄＋翻譯廣二、基因表達(dá)調(diào)控的意義

生物體基因數(shù)量很多，但在某一特定時期只有一小部分基因處于活化狀態(tài)，能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄（例如，真核細(xì)胞約2～5％基因具轉(zhuǎn)錄活性）。因此，機(jī)體內(nèi)存在著復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。通過調(diào)控基因的表達(dá)，使生物體適應(yīng)環(huán)境、調(diào)節(jié)代謝、維持其生長與繁殖?；虮磉_(dá)調(diào)控的意義：93二、基因表達(dá)調(diào)控的意義生物體基因數(shù)量很多，但在某一特定三、基因表達(dá)的規(guī)律*

階段特異性（時間特異性）

組織特異性（空間特異性）94三、基因表達(dá)的規(guī)律*階段特異性（時間特異性）組織特

階段特異性（時間特異性）甲胎蛋白

某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按一定的時間順序發(fā)生，稱時間特異性*

多細(xì)胞生物的不同基因在不同發(fā)育階段按特定時間順序開啟和關(guān)閉，稱階段特異性*哺乳類nAChR：胚胎型α2βγδ(煙堿型乙酰膽堿受體)

成年型α2βεδ95階段特異性（時間特異性）甲胎蛋白某一特定基因的

組織特異性（空間特異性）在個體生長的某一階段，不同細(xì)胞有不同基因表達(dá)胰島素：胰島細(xì)胞血紅蛋白：紅細(xì)胞鳥氨酸循環(huán)酶類：肝細(xì)胞X

YXY

AB96組織特異性（空間特異性）在個體生長的某一階段，不同細(xì)胞四、基因表達(dá)的方式

有些基因的產(chǎn)物對于生物體的整個生命過程都是必不可少的，這類基因在生物體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，這類基因被稱為管家基因。這類基因的表達(dá)稱為基本的基因表達(dá)*

。例如：葡萄糖酵解途徑中各種酶的編碼基因基本的基因表達(dá)也是在一定機(jī)制控制下進(jìn)行（一）基本的基因表達(dá)97四、基因表達(dá)的方式有些基因的產(chǎn)物對于生物體的整個生命過（二）可調(diào)節(jié)的基因表達(dá)

與管家基因不同，另一些基因表達(dá)狀況極易受外環(huán)境變化的影響，隨外環(huán)境變化，這類基因表達(dá)水平可升高或降低,又稱適應(yīng)性表達(dá)；又稱奢侈基因。

特點：不是細(xì)胞生命必不可少的表達(dá)受外環(huán)境的影響較大，不恒定表達(dá)有間斷性和空間特異性98（二）可調(diào)節(jié)的基因表達(dá)與管家基因不同，另一些基因

誘導(dǎo)基因表達(dá)水平在特定環(huán)境中增高的現(xiàn)象這類基因叫可誘導(dǎo)基因阻遏基因?qū)Νh(huán)境信號應(yīng)答表現(xiàn)為表達(dá)水平降低這類基因叫可阻遏基因DNA損傷：DNA損傷修復(fù)酶被誘導(dǎo)色氨酸供應(yīng)充足：參與合成色氨酸的酶被阻遏誘導(dǎo)阻遏DNA損傷：DNA損傷修復(fù)酶被誘導(dǎo)五.基因表達(dá)的多級調(diào)控基因表達(dá)調(diào)控在多級水平上進(jìn)行基因激活

轉(zhuǎn)錄起始*

轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運mRNA降解

翻譯及翻譯后加工

蛋白質(zhì)降解100五.基因表達(dá)的多級調(diào)控基因表達(dá)調(diào)控在多級水平上進(jìn)行基因激活六、基因表達(dá)調(diào)控原理以mRNA轉(zhuǎn)錄為例DNA元件調(diào)節(jié)蛋白RNA聚合酶活性*調(diào)控要素（一）轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)基因表達(dá)101六、基因表達(dá)調(diào)控原理以mRNA轉(zhuǎn)錄為例DNA元件*調(diào)控

（1）DNA元件：具有調(diào)節(jié)功能的特異DNA序列操縱子：由功能上相關(guān)的一組酶或蛋白質(zhì)基因在染色體上串聯(lián)一起并共同享用同一表達(dá)調(diào)控的DNA組件所構(gòu)成的一個轉(zhuǎn)錄單位。操縱子調(diào)節(jié)序列編碼序列：編碼蛋白質(zhì)啟動序列：結(jié)合RNA聚合酶操縱序列：結(jié)合阻遏蛋白*1、原核生物（1）DNA元件：具有調(diào)節(jié)功能的特異DNA序列操縱子：由

操縱子結(jié)構(gòu)編碼序列

啟動序列

操縱序列其他調(diào)節(jié)序列(promoter)(operator)PO(codingsequence)操縱子結(jié)構(gòu)編碼序列啟動序列操縱序列其他調(diào)節(jié)序列(p

原核生物啟動序列（啟動子）RNA轉(zhuǎn)錄起始-35區(qū)-10區(qū)TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrptRNATyrlacrecAAraBADTTGACA

TATAAT一致序列原核生物啟動序列（啟動子）RNA轉(zhuǎn)錄起始-35區(qū)-10區(qū)T

（2）調(diào)節(jié)蛋白特異因子

決定RNA聚合酶特異識別并結(jié)合啟動序列的能力（σ因子）阻遏蛋白

與操縱序列結(jié)合，抑制RNA聚合酶活性

（負(fù)性調(diào)節(jié)）激活蛋白

促進(jìn)RNA聚合酶活性（正性調(diào)節(jié)）（2）調(diào)節(jié)蛋白特異因子決定RNA聚合酶特異識別并結(jié)合

（3）

RNA聚合酶活性

DNA元件與調(diào)節(jié)蛋白對轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)作用最終由RNA聚合酶活性體現(xiàn)。啟動序列或啟動子的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)蛋白的性質(zhì)對RNA聚合酶活性影響最大。（3）RNA聚合酶活性DNA元件與調(diào)節(jié)蛋白2.真核生物（1）順式作用元件：（2）反式作用因子：

（3）mRNA轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)2.真核生物（1）順式作用元件：第二節(jié)原核基因表達(dá)調(diào)控與真核基因表達(dá)調(diào)控的基本原理108第二節(jié)原核基因表達(dá)調(diào)控與真核基因表達(dá)調(diào)控的基本原理28一、原核基因表達(dá)及其調(diào)控的特點1、轉(zhuǎn)錄與翻譯兩過程緊密偶聯(lián)3、操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制中普遍存在阻遏蛋白介導(dǎo)的負(fù)性調(diào)節(jié)*2、普遍存在操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制阻遏蛋白操縱序列結(jié)合阻遏解聚結(jié)合去阻遏阻礙109一、原核基因表達(dá)及其調(diào)控的特點1、轉(zhuǎn)錄與翻譯兩過程緊密偶聯(lián)

4、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為多順反子mRNA5、轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)調(diào)控的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)*多順反子mRNA：多個功能相關(guān)的基因串聯(lián)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在一條mRNA上，翻譯產(chǎn)物為多個多肽鏈4、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為多順反子mRNA5、轉(zhuǎn)錄起始是基二、操縱子理論通常一個操縱子含有一個啟動序列及數(shù)個編碼基因（2～6個，甚至更多），還有其它調(diào)節(jié)序列。編碼序列

啟動序列

操縱序列其他調(diào)節(jié)序列(promoter)(operator)PO(codingsequence)操縱子結(jié)構(gòu)111二、操縱子理論編碼序列啟動序列操縱序列其他調(diào)節(jié)序列(乳糖操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制

阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)

CAP的正性調(diào)節(jié)協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)112乳糖操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制32

乳糖操縱子結(jié)構(gòu)CAP結(jié)合位點PIIPOZYA調(diào)控區(qū)結(jié)構(gòu)基因I:阻遏蛋白編碼基因

PI:阻遏蛋白基因啟動序列

Z:β-半乳糖苷酶Y:透酶

A:乙?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)基因O:操縱序列（阻遏蛋白結(jié)合部位）P:啟動序列CAP結(jié)合位點調(diào)控區(qū)乳糖操縱子結(jié)構(gòu)CAP結(jié)合位點PIIPOZYA調(diào)控區(qū)結(jié)

1.阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)（無乳糖）*阻遏蛋白與O序列結(jié)合,抑制轉(zhuǎn)錄,lac操縱子關(guān)閉阻遏蛋白mRNACAP結(jié)合位點PIIPOZYARNA聚合酶

1.阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)（無乳糖）*阻遏蛋白與O序列結(jié)合

誘導(dǎo)劑結(jié)合于阻遏蛋白，阻遏蛋白與O序列解離，轉(zhuǎn)錄抑制解除，lac操縱子開啟乳糖別乳糖CAP結(jié)合位點PIIPOZYAmRNA

阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)（有乳糖）*

誘導(dǎo)劑結(jié)合于阻遏蛋白，阻遏蛋白與O序列解離，轉(zhuǎn)錄抑制解除，

CAP:分解代謝基因激活蛋白

catabolitegeneactivatorprotein同二聚體cAMP

結(jié)合區(qū)

DNA

結(jié)合區(qū)CAP:分解代謝基因激活蛋白同二聚體cAMP結(jié)合區(qū)

2.CAP的正性調(diào)節(jié)（無葡萄糖）*cAMPCAP蛋白PIIPOZYACAP結(jié)合位點mRNA無葡萄糖，cAMP濃度高cAMP與CAP結(jié)合

與CAP結(jié)合位點結(jié)合轉(zhuǎn)錄活性提高約50倍

2.CAP的正性調(diào)節(jié)（無葡萄糖）*cAMPCAP蛋白P

CAP的正性調(diào)節(jié)（有葡萄糖）*cAMPCAP蛋白PIIPOZYACAP結(jié)合位點mRNA有葡萄糖，cAMP濃度低cAMP與CAP結(jié)合受阻轉(zhuǎn)錄活性下降

CAP的正性調(diào)節(jié)（有葡萄糖）*cAMPCAP蛋白PI

阻遏蛋白mRNACAP結(jié)合位點PIIPOZYARNA聚合酶

3.阻遏蛋白與CAP的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)*（1）無乳糖時,阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄，CAP無作用阻遏蛋白mRNACAP結(jié)合位點PIIPOZYARNA聚合

（2）有乳糖時,乳糖操縱子去阻遏,雖可轉(zhuǎn)錄,

但活性很低,必須由CAP的正性調(diào)節(jié)來加強(qiáng)PIIPOZYACAP結(jié)合位點mRNA

（2）有乳糖時,乳糖操縱子去阻遏,雖可轉(zhuǎn)錄,P

乳糖操縱子強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖乳糖操縱子強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性（一）真核基因結(jié)構(gòu)特點1.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子

一個基因——

一條mRNA——

一條多肽鏈2.重復(fù)序列

高度重復(fù)序列、中度重復(fù)序列、單拷貝序列3.基因不連續(xù)性

非編碼序列內(nèi)含子1235’3’三、真核基因表達(dá)調(diào)控122（一）真核基因結(jié)構(gòu)特點1.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為

（二）真核基因轉(zhuǎn)錄特點活性染色體結(jié)構(gòu)變化

對核酸酶敏感、甲基化程度降低、組蛋白乙?；揎?.正性調(diào)節(jié)占主導(dǎo)

真核RNA聚合酶對啟動子的親和力極小或根本沒有實質(zhì)的親和力，轉(zhuǎn)錄起始需依賴多種激活蛋白的作用3．轉(zhuǎn)錄與翻譯分隔進(jìn)行

轉(zhuǎn)錄在核內(nèi)進(jìn)行，翻譯在胞漿進(jìn)行（二）真核基因轉(zhuǎn)錄特點活性染色體結(jié)構(gòu)變化2.正性調(diào)節(jié)

轉(zhuǎn)錄（起始）調(diào)節(jié)實質(zhì)上是調(diào)節(jié)蛋白與DNA的相互作用

1、順式作用元件：2、反式作用因子：

3、mRNA轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)（三）真核基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)124轉(zhuǎn)錄（起始）調(diào)節(jié)實質(zhì)上是調(diào)節(jié)蛋白與DNA的相互作用1

1.順式作用元件*

指結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)或內(nèi)部具有調(diào)節(jié)功能的DNA序列，因其作用于自身分子并發(fā)揮作用，所以稱順式作用元件。

根據(jù)位置、性質(zhì)及作用方式的不同分為啟動子、增強(qiáng)子和抑制子。1.順式作用元件*指結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)或內(nèi)部具有

真核生物——順式作用元件結(jié)構(gòu)基因序列

啟動子(promoter)P

抑制子(silencer)

增強(qiáng)子(enhancer)

增強(qiáng)子(enhancer)126真核生物——順式作用元件結(jié)構(gòu)基因序列啟動子(promRNA聚合酶II啟動位點周圍一組轉(zhuǎn)錄控制組件常見組件：

TATA盒（TATAAA）-25bp~-30bp

GC盒（GGGCGG）

CAAT盒（CCAATC）CAAT盒GC盒TATA盒轉(zhuǎn)錄起始點-30bp~-110bp啟動子promoter127RNA聚合酶II啟動位點周圍一組轉(zhuǎn)錄控制組件常見組件：CA

增強(qiáng)子*

：

遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點、決定組織特異性表達(dá)、增強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄活性的特異DNA序列，其發(fā)揮作用的方式與方向、距離無關(guān)。

抑制子*

：

對啟動子轉(zhuǎn)錄活性起抑制作用的DNA序列負(fù)性調(diào)節(jié)元件增強(qiáng)子*：抑制子*：

2、反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子）轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白

基本轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄抑制因子2、反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子）

絕大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子屬于反式作用因子*真核生物：由某一基因表達(dá)后，通過DNA-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用控制另一基因的轉(zhuǎn)錄。絕大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子屬于反式作用因子*真核生物：由某一基因表達(dá)

ABAB

RNA聚合酶結(jié)合啟動子所必須的一組轉(zhuǎn)錄因子

基本轉(zhuǎn)錄因子FEBDARNA

polⅡTATADNATATATFⅡD

TFⅡA

TFⅡB

TFⅡF

TFⅡERNApolⅡRNA聚合酶結(jié)合啟動子所必須的一組轉(zhuǎn)錄因子基本轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄激活因子（正性調(diào)節(jié)因子）

通過DNA－蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用起正性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。

轉(zhuǎn)錄抑制因子（負(fù)性調(diào)節(jié)因子）

通過DNA－蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用起負(fù)性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。與增強(qiáng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子與抑制子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活因子（正性調(diào)節(jié)因子）轉(zhuǎn)錄抑制因子（真核RNA聚合酶II不能單獨識別啟動子，而是由基本轉(zhuǎn)錄因子TFIID識別并結(jié)合啟動子，形成TFIID－啟動子復(fù)合物，然后有一系列的轉(zhuǎn)錄因子（如TFIIA、TFIIB、TFIIE、TFIIF等）加入形成前起始復(fù)合物，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的起始。3．mRNA轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)134真核RNA聚合酶II不能單獨識別啟動子，而是由基本轉(zhuǎn)錄因子T第三節(jié)重組DNA技術(shù)135第三節(jié)重組DNA技術(shù)55基因重組（geneticrecombination）

自然發(fā)生的基因重排真核、原核均會發(fā)生基因變異、物種演變、生物進(jìn)化的基礎(chǔ)基因工程（geneticengineering）重組DNA技術(shù)人工進(jìn)行基因重組基因重組（geneticrecombination）自

克隆*(名詞)：就是指來自同一母本的所有副本或拷貝的集合?？寺』▌釉~）：獲取同一拷貝的過程。二、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念母本克隆clonecloning（一）克隆與克隆化137克隆*(名詞)：就是指來自同一母本

細(xì)胞克隆：從大量群體細(xì)胞中分離出某一種類型細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)增獲得這樣一類相同的細(xì)胞。在分子生物學(xué)領(lǐng)域所說的分子克隆專指

DNA克隆(DNAcloning)。

分子克?。簭谋姸嗖煌姆肿尤后w中分離到的很多相同分子的集合。細(xì)胞克隆：在分子生物學(xué)領(lǐng)域所說的分子克隆專指分子克?。海ǘ┲亟MDNA技術(shù)*

應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（目的基因或目的DNA）與載體DNA連接成復(fù)制子，然后通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞，生長、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增、提取，獲得大量目的DNA的無性繁殖系，即DNA克隆，基因工程。139（二）重組DNA技術(shù)*應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各

目的DNA載體DNA連接復(fù)制子（重組DNA）導(dǎo)入宿主細(xì)胞（轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染）轉(zhuǎn)化子細(xì)胞轉(zhuǎn)化子細(xì)胞擴(kuò)增，可獲得大量重組DNA目的DNA載體DNA連接復(fù)制子（重組DNA）導(dǎo)入宿主細(xì)

基因克隆DNA克隆重組DNA同一概念生物技術(shù)工程基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程

獲得DNA的無性繁殖系獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物重組DNA的目的

基因克隆同一概念生物技術(shù)工程基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、蛋（三）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶連接酶DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶多聚核苷酸激酶142（三）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶62

限制性核酸內(nèi)切酶*識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)部特異核苷酸序列的一類核酸酶。限制性核酸內(nèi)切酶共分三類，基因工程常用II類酶，這類酶常識別DNA的回文序列

*

。限制性核酸內(nèi)切酶*識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)部特異核苷酸序

HpaI：5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’平端PstI：5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’突出粘性末端EcoRI：5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’突出粘性末端HpaI：5’-GTTAAC-3’平端Pst

（四）目的基因targetgenecDNA(complementaryDNA)

在體外以RNA（通常為mRNA）為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的單鏈DNA?；蚪MDNA(genomicDNA)

代表一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列。目的基因又稱外源DNA（四）目的基因targetgenecDNA(c

攜帶外源DNA，實現(xiàn)外源DNA無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體：質(zhì)粒噬菌體DNA病毒DNA質(zhì)粒（1）雙鏈環(huán)狀DNA，細(xì)菌染色體外（2）2-3kb或數(shù)百kb

（3）獨立自主復(fù)制，穩(wěn)定遺傳（4）遺傳標(biāo)志(五)基因載體（克隆載體）146質(zhì)粒（1）雙鏈環(huán)狀DNA，細(xì)菌染色體外(五)基因載三、重組DNA技術(shù)的原理與基本過程*1.獲取目的基因2.選擇、構(gòu)建基因載體3.目的基因與載體連接，形成重組分子4.重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞5.篩選、擴(kuò)增6.表達(dá)目的基因147三、重組DNA技術(shù)的原理1.獲取目的基因67

+載體目的基因重組DNA分子細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染擴(kuò)增篩選+載體目的基因重組DNA分子細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染擴(kuò)增篩選（1）化學(xué)合成（4）PCR（2）基因組DNA文庫

（3）cDNA文庫1.獲取目的基因149（1）化學(xué)合成（4）PCR（2）基因組DNA文庫

組織或細(xì)胞染色體

限制性內(nèi)切酶多個DNA片段載體多種轉(zhuǎn)化子

（基因文庫）重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNAcDNA文庫組織或細(xì)胞染色體限制性內(nèi)切酶多個DNA片段載體多種轉(zhuǎn)化子聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

在有特定模板、特異DNA引物及合成DNA所需要的dNTP存在時，向DNA合成體系內(nèi)加入耐熱的DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶*

），經(jīng)反復(fù)變性、退火及延伸的多個循環(huán)反應(yīng)，生成特異DNA產(chǎn)物的過程。151聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）在有特定模板、特異DNA

變性：解開模板雙鏈DNA95℃退火：使引物與單鏈模板DNA結(jié)合

55℃延伸：DNA鏈的合成

72℃變性：解開模板雙鏈DNA退火：使引物與單鏈模板DNA結(jié)合延

2.克隆載體的選擇與構(gòu)建目的基因不能自我復(fù)制3.目的基因與載體連接（DNA連接酶*

）重組DNA4.重組DNA導(dǎo)入受體菌安全菌感受態(tài)導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染感染2.克隆載體的選擇與構(gòu)建3.目的基因與載體連接（DN

5.重組體的篩選（1）直接選擇法

抗藥性標(biāo)志選擇amprtetrkanr

標(biāo)志補(bǔ)救α互補(bǔ)分子雜交（2）非直接選擇法

常用免疫學(xué)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高5.重組體的篩選（1）直接選擇法（2）非直接選擇法

6.克隆基因的表達(dá)

常見表達(dá)體系：（1）原核——大腸桿菌（簡單、迅速、經(jīng)濟(jì)）缺點：無轉(zhuǎn)錄后加工——適于表達(dá)cDNA

無翻譯后加工——無糖基化修飾包涵體

（2）真核——酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳類動物細(xì)胞表達(dá)有生物活性的蛋白質(zhì)6.克隆基因的表達(dá)常見表達(dá)體系：（2）真核——酵母、四、重組DNA技術(shù)的應(yīng)用1.疾病基因的發(fā)現(xiàn)鐮刀形紅細(xì)胞貧血脆性X綜合征(FMRI基因沉默)2.生物制藥

利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)有藥用價值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界上的一項重大產(chǎn)業(yè)。如生產(chǎn)干擾素、胰島素、細(xì)胞因子等。156四、重組DNA技術(shù)的應(yīng)用1.疾病基因的發(fā)現(xiàn)鐮刀形紅細(xì)胞貧3.DNA診斷

DNA診斷又稱基因診斷，是利用分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的技術(shù)和原理，在DNA水平上分析、鑒定遺傳性疾病所涉及的基因置換、缺失或插入等突變。4.基因治療

所謂基因治療就是向功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能的基因，以糾正或補(bǔ)償其基因缺陷，從而達(dá)到治療的目的。對于基因治療，人們擔(dān)心的潛在危險之一是可能會引起未知的遺傳效應(yīng)，如腫瘤等，此外還涉及社會倫理方面的爭論。5.遺傳病的預(yù)防3.DNA診斷DNA診斷又稱基因診斷，是利

本章重點

基本概念

基因表達(dá)、操縱子、DNA元件、順式作用元件、反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子）、啟動子、增強(qiáng)子、基因工程、限制性核酸內(nèi)切酶、管家基因

原核基因表達(dá)調(diào)控特點

乳糖操縱子結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制

基因表達(dá)調(diào)控的規(guī)律、方式、要素本章重點基本概念原核基因表達(dá)調(diào)控特點乳糖操縱

PCR原理及基本過程

重組DNA技術(shù)基本原理

真核基因轉(zhuǎn)錄特點

真核基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)

真核基因結(jié)構(gòu)特點PCR原理及基本過程重組DNA技術(shù)基本原理1、Geniusonlymeanshard-workingallone'slife.(Mendeleyer,RussianChemist)

天才只意味著終身不懈的努力。20.8.58.5.202011:0311:03:10Aug-2011:032、Ourdestinyoffersnotonlythecupofdespair,butthechaliceofopportuni