毒理學(xué)指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)操作匯總

毒理學(xué)指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)操作匯總毒理學(xué)指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)操作匯總毒理學(xué)指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)操作匯總xxx公司毒理學(xué)指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)操作匯總文件編號(hào)：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計(jì)，管理制度藥物毒性試驗(yàn)指標(biāo)1.急性毒性試驗(yàn)一、半數(shù)致死量（LD50）的測(cè)定(一)目的:觀察受試物一次給予動(dòng)物后，所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和死亡情況。(二)動(dòng)物分組和劑量1.動(dòng)物:一般用小白鼠8周齡，體重18---22g(同次試驗(yàn)體重相差不超過2g)大白鼠6~8周齡，體重120--150g，同次試驗(yàn)體重相差不超過10g。2.受試物:溶于水的做成溶液，不溶于水的做成混懸液.(三)試驗(yàn)方法1.劑量:一般選用3一5個(gè)劑量，各劑量間劑距根據(jù)受試物情況和預(yù)試結(jié)果而定。2.給藥途徑和容積:給藥途徑:應(yīng)與臨床試驗(yàn)的途徑相一致?？诜幬飸?yīng)灌胃給藥，一、二類新藥應(yīng)采用兩種途徑給藥，其中一種應(yīng)為推薦臨床研究的給藥途徑。水溶性好的藥物還應(yīng)測(cè)定靜脈給藥的急性毒性。給藥容積:小白鼠禁食(12~16小時(shí))，不禁水，按體重計(jì)算:灌胃(ig)不超過0.4ml/10g體重。大白鼠禁食(12~16小時(shí))，不禁水、灌胃(ig)，不超過3ml/只。3.測(cè)定LD50:將動(dòng)物按體重隨機(jī)分組，每組至少10只(雌雄各半)。給受試物后立即觀察動(dòng)物反應(yīng)情況，每天觀察一次連續(xù)觀察七天。詳細(xì)逐天記錄動(dòng)物毒性反應(yīng)情況及死亡分布，并用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法(申報(bào)時(shí)應(yīng)說明方法名稱)計(jì)算出LD50值及95%可信限。4.觀察毒性反應(yīng):給受試物后應(yīng)嚴(yán)密觀察反應(yīng)情況，并記錄動(dòng)物的外觀、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、食欲(飼料消耗量)、大、小便及其顏色、被毛、膚色、呼吸、鼻、眼、口腔有無異常分泌物，體重變化以及死亡等情況。死亡動(dòng)物應(yīng)及時(shí)進(jìn)行尸檢，發(fā)現(xiàn)病變器官應(yīng)做病理組織學(xué)檢查。若發(fā)現(xiàn)中毒反應(yīng)或死亡率一與動(dòng)物的性別有明顯相關(guān)時(shí)，則應(yīng)選擇性別敏感的動(dòng)物進(jìn)行復(fù)試。(四)試驗(yàn)報(bào)告和結(jié)果評(píng)價(jià)應(yīng)詳細(xì)具體，包括試驗(yàn)日期、動(dòng)物的規(guī)格、性別、數(shù)量、受試物來源及含量、試驗(yàn)方法。LD50值及其95%可信限，以及各劑量組的死亡率，或最大耐受量的值及其相當(dāng)于臨床劑量的倍數(shù).詳細(xì)報(bào)告實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物出現(xiàn)的中毒表現(xiàn)及致死癥狀，綜合評(píng)價(jià)受試物毒性大小。二、最大耐受量（MTD）的測(cè)定方法:受試物可用臨床試驗(yàn)的給藥途徑，以動(dòng)物能耐受的最大濃度，最大容積的劑量一次或一日內(nèi)2~3次給予動(dòng)物(小白鼠至少20只，雌雄各半)。連續(xù)觀察七天，記錄動(dòng)物反應(yīng)情況，以不產(chǎn)生死亡的最大劑量為最大耐受量。計(jì)算出總給予藥量g/Kg(合生藥量g/Kg表示)，推算出相當(dāng)于臨床用藥量的倍數(shù)。測(cè)定最大耐受量，同樣也應(yīng)嚴(yán)密觀察動(dòng)物毒性反應(yīng)情況，要求與觀察單次給藥的毒性反應(yīng)相同。2.長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)一、大鼠的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)(一)目的:觀察連續(xù)重復(fù)給予受試物對(duì)大鼠所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，首先出現(xiàn)的癥狀和嚴(yán)重程度，毒副反應(yīng)的靶器官及其恢復(fù)和發(fā)展情況。確定無毒反應(yīng)劑量，為擬定人用安全劑量提供參考。(二)動(dòng)物和材料1.動(dòng)物健康大白鼠(參見總則要求)，每組至少20只。如試驗(yàn)周期為三個(gè)月以上，應(yīng)根據(jù)需要增加數(shù)量至每組30~40只。體重差異應(yīng)不超過平均體重的20%。試驗(yàn)期在三個(gè)月內(nèi)用6~8周齡大鼠。超過三個(gè)月。宜用5~6周齡大鼠，雌雄各半、隨機(jī)分組，每籠不超過5只，雌雄分籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)前至少觀察一周，記錄食量和體重等。(三)試驗(yàn)方法1.劑量和分組(1)一般設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組。高劑量組原則上要求使動(dòng)物產(chǎn)生明顯的或嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，或個(gè)別動(dòng)物死亡。中劑量組應(yīng)相當(dāng)于藥效學(xué)試驗(yàn)的高劑量.低劑量組略高于動(dòng)物的有效劑量而不出現(xiàn)毒性反應(yīng)。(2)如果急性毒性試驗(yàn)結(jié)果毒性很低，測(cè)不出LD50。也未見明顯毒性反應(yīng)，可設(shè)高、低兩個(gè)劑量組，高劑量組一般為擬用于臨床劑量50倍以上(有困難時(shí)，可適當(dāng)減少劑量)并應(yīng)高于藥效學(xué)試驗(yàn)之高劑量。(3)對(duì)照組的設(shè)置:如受試物為提取物(如浸膏)，對(duì)照物可考慮用常水;如含溶媒，對(duì)照物為溶媒;如含賦形劑，則對(duì)照物用賦形劑。如溶媒或賦形劑可能產(chǎn)生毒性時(shí)，則應(yīng)另加一空白對(duì)服組(常水)。2.給藥途徑與方法(1)給藥途徑與推薦臨床的途徑一致?？诜幬飸?yīng)經(jīng)口給藥。臨床用藥途徑為靜脈注射時(shí)，可用其它適宜的注射途徑代替。(2)口服藥大鼠一般用灌胃法，也可將受試物混在飼料、水中給予，但每只動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，采取適當(dāng)措施，保證每只動(dòng)物按規(guī)定劑量在一定時(shí)限內(nèi)服入。(3)受試物最好是每周7天連續(xù)給予，如試驗(yàn)周期在90天以上，可考慮每周給藥6天，每天定時(shí)給藥。(4)給藥容量一般為1~2ml/l100g體重，每周可根據(jù)體重情況調(diào)整給藥量，但總量不宜超過5ml/鼠/次。各劑量組用等容量不等濃度給藥。3.試驗(yàn)周期(1)長(zhǎng)毒試驗(yàn)的給藥時(shí)間應(yīng)為臨床試驗(yàn)用藥期的二~三倍，最長(zhǎng)半年。(2)若臨床用藥周期在1周以內(nèi)者，長(zhǎng)毒試驗(yàn)應(yīng)為2周;2周以內(nèi)者，應(yīng)為四周;四周以上者，長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的給藥期一般為臨床試驗(yàn)用藥期的兩倍以上。(四)檢查項(xiàng)目1.一般觀察:進(jìn)食量、體重、外觀體征和行為活動(dòng)、糞便性狀等，發(fā)現(xiàn)有中毒反應(yīng)的動(dòng)物應(yīng)取出單籠飼養(yǎng)，重點(diǎn)觀察。發(fā)現(xiàn)死亡或?yàn)l死動(dòng)物應(yīng)及時(shí)尸檢。2.檢測(cè)項(xiàng)目;(1)血液學(xué)指標(biāo):紅細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類、血小板計(jì)數(shù)、凝血時(shí)間。(2)血液生化學(xué)指標(biāo):天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT),堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN),總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血澹(GLU)、總膽紅素(T-BIL)、肌醉(Grea)、總膽固醇(T-CHO)。(3)系統(tǒng)尸解和病理組織學(xué)檢查:①系統(tǒng)尸解:應(yīng)全面細(xì)致，發(fā)現(xiàn)異常器官應(yīng)重點(diǎn)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。②臟器稱重和勝器系數(shù);剖解后取出心、肝、腎、脾、肺、腎上腺、甲狀腺、攀丸、卵巢、子宮、腦、前列腺。③病理組織學(xué)檢查:高劑量組對(duì)照組動(dòng)物及尸檢發(fā)現(xiàn)異常器官檢查要詳細(xì)。其他劑量組可取材保存。在高劑量組發(fā)現(xiàn)有異常病變時(shí)才進(jìn)行檢查。檢查內(nèi)容除一類其他各類新藥:心、肝、腎、脾、肺、腎上腺、甲狀腺、胃、胸腺、肇丸(和附肇)Y前列腺、卵巢和子宮和可能的靶器官。3.可逆性觀察最后一次給藥后24小時(shí)，每組活殺部分動(dòng)物(2/3~1/2)，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，余下動(dòng)物停藥，繼續(xù)觀察2~4周。如24小時(shí)后的病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)有異常變化，應(yīng)將余下動(dòng)物活殺剖檢，重點(diǎn)觀察毒性反應(yīng)器官，以了解毒性反應(yīng)的可逆程度和可能出現(xiàn)的遲緩性毒性。4.指標(biāo)觀察時(shí)間一般狀況和癥狀的觀察，每天觀察一次。每周記錄飼料消耗和體重一次。試驗(yàn)周期在三個(gè)月以內(nèi)的，一般在最后一次給藥后24小時(shí)和恢復(fù)期結(jié)束時(shí)各進(jìn)行一次各項(xiàng)指標(biāo)的全面檢測(cè).必要時(shí)，在試驗(yàn)中間檢測(cè)指標(biāo)一次。試驗(yàn)周期在三個(gè)月以上的，可在試驗(yàn)中期活殺少量動(dòng)物(高劑量組和對(duì)照組)全面檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。對(duì)瀕死或死亡動(dòng)物應(yīng)及時(shí)檢查。二、犬的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)?zāi)康?觀察連續(xù)重復(fù)給予受試物對(duì)犬所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，首先出現(xiàn)的癥狀和嚴(yán)重程度，提供毒副反應(yīng)的靶器官及其恢復(fù)和發(fā)展情況，確定無毒反應(yīng)劑量，為擬定人用安全劑量提供參考。3.皮膚用藥毒性試驗(yàn)?zāi)康?觀察動(dòng)物完整皮膚及破損皮膚短時(shí)期接觸受試物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。4.粘膜用藥的毒性試驗(yàn)?zāi)康?觀察動(dòng)物跟睛接觸受試物后所產(chǎn)生的刺激反應(yīng)情況和恢復(fù)情況。5.特殊毒性試驗(yàn)根據(jù)《新藥審批辦法》及《有關(guān)中藥部分的修訂和補(bǔ)充規(guī)定冷各類型中藥新藥在特殊毒性實(shí)驗(yàn)方面應(yīng)做項(xiàng)目如下:1.一類新藥必須進(jìn)行特殊毒理研究。2.保胎藥與影響胎兒子代發(fā)育的藥物，除按一般毒理學(xué)要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)外，還應(yīng)增做生殖毒性試驗(yàn)。3.其它類新藥如在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有影響生殖或致癌的可疑性時(shí)，應(yīng)補(bǔ)做相應(yīng)的特殊毒性試驗(yàn)。一、致突變?cè)囼?yàn)中藥一類新藥，除按藥理、毒理學(xué)要求進(jìn)行試驗(yàn)外，還需做基因突變?cè)囼?yàn)，染色體畸變?cè)囼?yàn)及動(dòng)物微核試驗(yàn)。由于中藥制劑有其特殊性，如含有生藥粉的制劑，不溶物較多;或因成分復(fù)雜，溶解度較差，以及pH等間題的研究，難以進(jìn)行體外試驗(yàn)者，可只做體內(nèi)試驗(yàn)。(一)基因突變實(shí)驗(yàn)基因突變?cè)囼?yàn)的目的是反映受試物在基因水平上的致突變作用。主要方法有三種:其中微生物回復(fù)突變?cè)囼?yàn)適合于化學(xué)純度高的藥物，較為常用;中藥粗制品不宜做微生物回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞突變?cè)囼?yàn)適用于受試物本身具有抗微生物作用的藥品;果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)是整體動(dòng)物的基因突變?cè)囼?yàn)，準(zhǔn)確性較高，在上述二法有某些陽(yáng)性或可疑陽(yáng)性時(shí)較為適用。果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)1.果蠅:Oregon一R雄蠅等和Muller一5雌蠅。2.給藥途徑:口服或其他接近臨床用藥的途徑。3.劑量:至少二個(gè)劑量。最高劑量為最大耐受劑量或產(chǎn)生某些毒性指征的劑量，通常以1/2LD50為基準(zhǔn)，低劑量為1/4LD50，無毒物最大給藥量可用最大耐受量。對(duì)照馭用溶劑及陽(yáng)性對(duì)照。4.試驗(yàn):(1)毒性試驗(yàn):求出半數(shù)致死量。(2)繁殖力試驗(yàn)觀察受孕與不育情況。如有不育，可調(diào)低劑量。(3)樣本的大小:受試染色體總數(shù)實(shí)驗(yàn)和陰性對(duì)照組6000以上，陽(yáng)性對(duì)照組300以上，觀察給藥的雄果蠅和處女蠅交配，每2一3天更新處女蠅，記錄雌性子代的致死作用。5.報(bào)告將數(shù)據(jù)列成表，包括受試染色體數(shù)，給藥的和無生育力的雄性數(shù)，F(xiàn)2代培養(yǎng)群的數(shù)目，每一生殖細(xì)胞期檢測(cè)的帶有致死基因的染色體數(shù)。6.判定:(1)一支培養(yǎng)管中，F(xiàn):代合計(jì)有2(i只以上雌、雄蠅而末發(fā)現(xiàn)有野生型紅眼雄蠅者為陽(yáng)性:反之，有2只以上雄蠅者為陰性。(2)在一支培養(yǎng)管中，F(xiàn):代雌、雄蠅合計(jì)少于}a只，或只有一只紅眼雄蠅者為可疑，需觀察F3代。(3)僅存雌、雄蠅親本而無仔蠅者為不育。7，統(tǒng)計(jì)處理及評(píng)價(jià):致死突變率%=致死管數(shù)/受試染色體數(shù)×100%(1)致死突變率大于自發(fā)突變率的2倍并有劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)記為陽(yáng)性。(2)或?qū)⒔o藥組與對(duì)照組的致死突變率進(jìn)行比較，如對(duì)照組與給藥組的突變總數(shù)小于1}},按}astenbaum-Bowman方法統(tǒng)計(jì)，總數(shù)大于iaa按}z統(tǒng)計(jì)。(二)染色體畸變?cè)囼?yàn)染色體畸變?cè)囼?yàn)的目的是反映受試物在染色體水平上的致突變作用，其中培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)是體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)受試物的純度及理化性質(zhì)要求較高，而精原細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)及嚙齒動(dòng)物顯性致死實(shí)驗(yàn)均為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，前者需用小鼠數(shù)較少，實(shí)驗(yàn)周性較短，后者雖然工作量較大，但同時(shí)可獲得受孕率，死胎數(shù)，含死胎孕鼠百分率等較多信息.嚙齒類動(dòng)物顯性致死試驗(yàn):1甲動(dòng)物;性成熟小鼠。每組至少15只雄鼠，孕鼠20只以上。2.劑量:一般采用3個(gè)劑量。受試物的最高劑量應(yīng)導(dǎo)致毒性癥狀或減少繁殖力，低毒物最大劑量可用最大耐受量對(duì)照用溶劑及陽(yáng)性對(duì)照。3.給藥途徑與方法盡可能和臨床擬用途徑相同。一般采用一天一次，連續(xù)五天給藥或其它適宜的給藥方式。4.交配方法:3.骨髓采樣時(shí)間:通過預(yù)試，在12-72h不同時(shí)間內(nèi)，取5個(gè)作用點(diǎn)，找出合適采樣時(shí)間，如無差別一般采用24h采樣。4.劑量及劑量級(jí):至少采用3個(gè)劑量，最高劑量以1/2LD50或最大耐受量為基準(zhǔn)，否則應(yīng)說明選定劑量的理由。對(duì)照組:用溶媒及陽(yáng)性對(duì)照。5.標(biāo)本制作:取骨髓、涂片、Giernsa或叮吮橙熒光染色鏡檢:每只動(dòng)物至少計(jì)數(shù)100個(gè)多染紅細(xì)胞，Giemsa染色，觀察其微核出現(xiàn)的頻度及多染紅細(xì)胞和正常紅細(xì)胞的比率。吖啶橙熒光染色，則直接觀察微核出現(xiàn)