病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷

病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷第1頁，共37頁。什么是病毒？病毒（virus）是一類體積微小、結(jié)構(gòu)簡單、有嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生性的非細(xì)胞型微生物。第2頁，共37頁。

特點(diǎn)：體積微小，只能在電鏡下觀察，能通過濾菌器無完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)衣殼＋核酸核心只有一種類型核酸：RNA或DNA有嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生性，只能在活細(xì)胞內(nèi)生長以核酸復(fù)制的方式增殖，不能進(jìn)行二分裂繁殖抵抗力特殊：耐冷不耐熱，對(duì)化學(xué)因素的抵抗力較一般比細(xì)菌強(qiáng)，耐甘油，對(duì)抗生素及磺胺類藥物不敏感，干擾素可抑制病毒復(fù)制。第3頁，共37頁。病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷方法病原學(xué)診斷

病毒分離培養(yǎng)顯微鏡檢查抗原檢測核酸檢測血清學(xué)診斷

抗體檢測IgM、IgG第4頁，共37頁。一、標(biāo)本采集、運(yùn)送和處理（一）標(biāo)本采集采集時(shí)間：盡早采集（越早越好）標(biāo)本種類：根據(jù)感染的部位、可能感染的病毒類型選擇標(biāo)本種類無菌采集標(biāo)本：必要時(shí)用抗生素或抗真菌藥處理抑制細(xì)菌生長100U/ml青霉素＋100μg/ml鏈霉素抑制真菌生長2.5μg/ml二性霉素B或40μg/ml制霉菌素血清學(xué)檢查標(biāo)本：雙份血清第5頁，共37頁。（二）標(biāo)本的運(yùn)送與保存1.低溫送檢4℃可保存數(shù)小時(shí)，-70℃可長期保存-10～-20℃下病毒易滅活，不可用于保存病毒標(biāo)本對(duì)冷凍標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融2.保濕送檢50%甘油鹽水保存送檢病毒轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基（virustransportmedium，VTM）含0.5%明膠或牛血清白蛋白的Hank’s液3.無菌送檢抑制細(xì)菌生長100U/ml青霉素＋100μg/ml鏈霉素抑制真菌生長2.5μg/ml二性霉素B或40μg/ml制霉菌素第6頁，共37頁。二、病毒的形態(tài)學(xué)檢查1.光學(xué)顯微鏡檢查

主要觀察病變組織中的包涵體，某些大病毒也通過光學(xué)顯微鏡觀察。簡便、快速，但敏感性低，有些病毒感染細(xì)胞后不形成包涵體

狂犬病毒胞漿內(nèi)包涵體（內(nèi)基小體）巨細(xì)胞病毒胞核內(nèi)包涵體（貓頭鷹眼）第7頁，共37頁。2.電鏡及免疫電鏡檢查直接檢查標(biāo)本中的病毒顆粒，快速，可確診。但敏感性低（＞106/ml）免疫電鏡敏感性高，但只能用于已知病毒的檢測）乙型肝炎病毒電鏡圖輪狀病毒電鏡圖第8頁，共37頁。三、病毒的分離與鑒定動(dòng)物接種組織培養(yǎng)標(biāo)本采集標(biāo)本處理后接種雞胚接種卵黃囊膜尿囊液羊膜腔液絨毛尿囊膜觀察囊膜病變血凝試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)CPEEM包涵體空斑試驗(yàn)紅細(xì)胞吸附中和試驗(yàn)觀察發(fā)病抗原檢測抗體檢測病理檢查第9頁，共37頁。（一）病毒的分離組織培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)動(dòng)物接種第10頁，共37頁。1.組織培養(yǎng)將人或動(dòng)物離體的活組織或分散的活細(xì)胞在體外人工控制的條件下使其生長繁殖的一種技術(shù)。組織培養(yǎng)的類型:（1）組織塊培養(yǎng)（2）器官培養(yǎng)人胚氣管－呼吸道病毒；人胚腸－腸道病毒（3）細(xì)胞培養(yǎng)最常用原代和次代細(xì)胞培養(yǎng)二倍體細(xì)胞培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)第11頁，共37頁。動(dòng)物新鮮組織（人胚腎等）→胰酶消化→營養(yǎng)液培養(yǎng)→單層細(xì)胞（原代細(xì)胞）原代細(xì)胞→胰酶消化→轉(zhuǎn)種培養(yǎng)（次代培養(yǎng)細(xì)胞）對(duì)病毒敏感，但制備費(fèi)時(shí)費(fèi)力，只能傳2～3代。原代和次代培養(yǎng)細(xì)胞第12頁，共37頁。二倍體細(xì)胞株原代細(xì)胞反復(fù)傳代（50～70代）仍保持二倍體染色體特性。病毒分離和疫苗制備的首選細(xì)胞株。傳代細(xì)胞株

來源于腫瘤細(xì)胞或突變的二倍體細(xì)胞，能在體外無限增殖。增殖快，不易衰老，易于傳代保存。常用于病毒的分離鑒定，但不能用于制備疫苗。第13頁，共37頁。優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞來源廣、敏感細(xì)胞株多不受機(jī)體免疫因素的影響，個(gè)體差異小病變結(jié)果易于觀察可用于病毒的分離鑒定和制備疫苗及抗原缺點(diǎn)條件要求相對(duì)較高，有細(xì)胞培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)室才能做第14頁，共37頁。2.雞胚培養(yǎng)新鮮受精卵接種病毒38～39℃7～13d卵黃囊接種（流行性腦炎病毒）羊膜腔接種（流感病毒）尿囊腔接種（傳代培養(yǎng)）絨毛尿囊膜接種（痘類病毒）第15頁，共37頁。絨毛尿囊膜表現(xiàn)有痘病毒的特異性損傷第16頁，共37頁。優(yōu)點(diǎn)雞胚來源充足，操作簡便，有多種接種途徑病毒增殖快，可收獲大量病毒雞胚本身是無菌的，對(duì)接種的病毒不產(chǎn)生抗體缺點(diǎn)易感病毒少，目前主要用于流感病毒、腮腺炎病毒、皰疹病毒和痘類病毒的分離培養(yǎng)。某些病毒在雞胚內(nèi)傳代后，其毒力下降第17頁，共37頁。3.動(dòng)物接種常用動(dòng)物小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病毒對(duì)動(dòng)物的敏感性不同，根據(jù)病毒種類加以選擇。接種途徑按病毒侵襲部位選擇相應(yīng)的接種途徑：乙型腦炎病毒及狂犬病毒小鼠腦內(nèi)接種柯薩奇病毒乳鼠腹腔接種乙肝病毒黑猩猩靜脈注射流感病毒鼻腔滴種用途分離鑒定病毒，制備疫苗，制備抗血清第18頁，共37頁。優(yōu)點(diǎn)方法簡單、結(jié)果易于觀察選擇適當(dāng)?shù)慕臃N途徑，可出現(xiàn)類似人類的感染癥狀，有利于發(fā)病機(jī)制的研究缺點(diǎn)可自然帶毒或隱性感染，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果有個(gè)體差異很多病毒無敏感動(dòng)物，或感染后不出現(xiàn)明顯癥狀第19頁，共37頁。（二）病毒的鑒定病毒的初步鑒定動(dòng)物感染：敏感動(dòng)物范圍、潛伏期及發(fā)病情況雞胚接種：病毒對(duì)雞胚的敏感性、特殊病灶（如痘皰等）細(xì)胞培養(yǎng)：病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)理化性質(zhì)的測定：主要用于新病毒的鑒定病毒的最后鑒定血清學(xué)鑒定:中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)等。分離的新病毒，必須進(jìn)行系統(tǒng)的全面鑒定第20頁，共37頁。病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)1.細(xì)胞代謝作用改變（培養(yǎng)液顏色變化）正常細(xì)胞代謝：培養(yǎng)液由紅變黃病毒增殖，抑制細(xì)胞代謝：培養(yǎng)液顏色不變或更紅第21頁，共37頁。

病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖后，使宿主細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生不同程度改變，稱為細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathiceffect，CPE）。2.細(xì)胞形態(tài)改變細(xì)胞變圓、融合、腫脹、細(xì)胞空泡、核濃縮、形成嗜酸性或嗜堿性包涵體等。

某些病毒感染細(xì)胞后不出現(xiàn)CPE第22頁，共37頁。第23頁，共37頁。第24頁，共37頁。第25頁，共37頁。3.干擾現(xiàn)象（interference）當(dāng)兩種不同的病毒同時(shí)或先后感染同一細(xì)胞時(shí)，其中一種病毒可抑制另一種病毒的增殖，稱為病毒的干擾現(xiàn)象。干擾現(xiàn)象也可被相應(yīng)特異性抗體抑制，稱為干擾抑制現(xiàn)象鼻Ｖ.無CPE鼻V.＋Poli.V無CPEPoli.V有CPE第26頁，共37頁。4.紅細(xì)胞吸附及吸附抑制試驗(yàn)受感染的宿主細(xì)胞膜含病毒抗原（血凝素），可吸附雞、豚鼠或猴紅細(xì)胞。如果在培養(yǎng)瓶中加入相應(yīng)的血凝素抗血清，則不出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，即紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)陽性第27頁，共37頁。病毒的理化性質(zhì)測定主要用于新病毒的鑒定1.病毒的大小及形態(tài)：電鏡直接觀察及測量2.核酸類型:用RNA酶或DNA酶處理病毒。3.乙醚敏感試驗(yàn):

有包膜病毒對(duì)乙醚敏感，經(jīng)乙醚作用后，失去感染性4.耐酸試驗(yàn)

腸道病毒耐酸，在pH3的環(huán)境下穩(wěn)定，鼻病毒不耐酸，在pH3的環(huán)境下被滅活第28頁，共37頁。病毒的血清學(xué)鑒定對(duì)初步鑒定為陽性的標(biāo)本均需要用血清學(xué)方法做最后鑒定。方法：血凝抑制試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)、ELISA等。第29頁，共37頁。四、病毒的血清學(xué)診斷用已知病毒抗原檢測患者血清中的相應(yīng)抗體，可協(xié)助診斷病毒感染。雙份血清IgG測定4倍以上增長，有診斷意義單份血清IgM測定可用于早期診斷，但部分病人可能陰性，少數(shù)病人產(chǎn)生的特異性IgM抗體也可在體內(nèi)持續(xù)存在1～2年。第30頁，共37頁。病毒血清學(xué)試驗(yàn)常用方法（一）中和試驗(yàn)

原理抗體與相應(yīng)病毒結(jié)合后，能夠使病毒失去感染性。V.＋Ab→失去感染易感細(xì)胞的能力

一定量抗體可中和一定量病毒根據(jù)抗體的效價(jià)對(duì)待測病毒液進(jìn)行半定量檢測。中和試驗(yàn)的必要條件：1.活病毒2.敏感細(xì)胞、雞胚或動(dòng)物第31頁，共37頁。中和試驗(yàn)的特點(diǎn)：特異、敏感，既可檢測抗體，也可測定抗原（定屬、定型）。既可用細(xì)胞培養(yǎng)做，也可用動(dòng)物或雞胚接種，以細(xì)胞培養(yǎng)法最常用。檢測IgG，不能用于早期診斷，常用于流行病學(xué)調(diào)查。第32頁，共37頁。（二）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測IgM，常用于早期診斷。不需活細(xì)胞，比中和試驗(yàn)簡單，省時(shí)。（三）IF及ELISA方法簡單、快速、敏感性高。檢測特異性IgM，有助于某些病毒感染的早期診斷，如：孕婦羊水中檢測IgM型特異抗體：胎兒先天性感染抗HBcIgM：作為急性HBV感染的指標(biāo)第33頁，共37頁。（四）血凝及血凝抑制試驗(yàn)含有血凝素的病毒能吸附一定種類的哺乳動(dòng)物或禽類的紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞凝集。該現(xiàn)象可被相應(yīng)的血凝素抗體抑制，稱為血凝抑制試驗(yàn)，可用于病毒的分型。第34頁，共37頁。五、病毒抗原檢查DFA、IFA、IEA等?？蓹z測細(xì)胞內(nèi)、外的游離病毒抗原。敏感、特異，簡便、快速。適用于多種病毒性疾病的早期快速診斷。InfluenzavirusA培養(yǎng)物DFA染色陽性生殖道HSV-2涂片DFA染色陽性第35頁，共37頁。六、病毒的分子生物學(xué)檢測分子生物學(xué)方法可檢測以不同形式存在的病毒基因片斷。方法敏感、特異、簡便、快速。核酸電泳技術(shù)核酸雜交技術(shù)PCR基因芯片技術(shù)第36頁，共37頁。內(nèi)容梗概病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷。有嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生性，只能在活細(xì)胞內(nèi)生長。采集時(shí)間：盡早采集（越早越好）。4℃可保存數(shù)小時(shí)，-70℃可長期保存。主要觀察病變組織中的包涵體，某些大病毒也通過光學(xué)顯微鏡觀察。簡便、快速，但敏感性低，有些病毒感染細(xì)胞后不形成包涵體。2.電鏡及免疫電鏡檢查。（2）器官培養(yǎng)人胚氣管－呼吸道病毒。二倍體細(xì)胞株原代細(xì)胞反復(fù)傳代（50～70代）仍保持二倍體染色體特性。條件要求相對(duì)較高，有細(xì)胞培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)室才能做。病毒增殖快，可收獲大量病毒。雞胚本身是無菌的，對(duì)接種的病毒不產(chǎn)生抗體。不同病毒對(duì)動(dòng)物的敏感性不同，根據(jù)病毒種類加以選擇。動(dòng)物感染：敏感動(dòng)物范圍、潛伏期及發(fā)病情況。雞胚接種：