膠原蛋白提取

學(xué)院：生物科學(xué)與工程學(xué)院專業(yè)：生物工程姓名：李秀莉?qū)W號：120302214外文出處：FoodChemistry190(2023)186-193附件：1.外文資料翻譯譯文；2.外文原文。指導(dǎo)教師評語：該同學(xué)外語水平好，翻譯流暢，專業(yè)知識及漢語水平較好，翻譯用心。希望今后能更多閱讀英文文獻。簽名：周曉輝2023年4月28日附件1：外文資料翻譯譯文響應(yīng)面優(yōu)化蛋殼膜中胃蛋白酶溶性膠原蛋白提取工藝關(guān)鍵詞：蛋殼膜、響應(yīng)面優(yōu)化法、胃蛋白酶溶性膠原蛋白摘要：本文利用響應(yīng)面優(yōu)化法（RSM）確定了自變量對蛋殼膜中胃蛋白酶溶性膠原蛋白（PSC）提取產(chǎn)率的影響。采用中心復(fù)合設(shè)計（CCD）的實驗設(shè)計和結(jié)果分析方法，選取最有可能的條件范圍進行了優(yōu)化實驗：NaOH濃度（X1：0.4-1.2mol/L）,堿處理時間（X2：6-30h），酶濃度（X3：15-75U/mg）以及水解時間（X4：12-60h）。實驗數(shù)據(jù)用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法通過多元線性回歸分析得到一個二階多項式方程，分析表明最佳提取條件為：NaOH濃度為0.76mol/L，堿處理時間為18h，酶濃度為50U/mg，水解時間為43.42h。在最佳提取條件下的提取率實驗值是30.049%，這與預(yù)測值30.054%高度一致。1.前言膠原蛋白是脊椎動物的主要結(jié)構(gòu)蛋白，大約占一個動物總蛋白的30%（Muyonga,Cole,&Duodo,2004)。膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)由三個多肽α-鏈扭曲在一起形成的一個三股螺旋體。在所有膠原蛋白的“膠原域”都發(fā)現(xiàn)了(Gly-X-Y)n重復(fù)。X和Y的位置往往分別被脯氨酸和羥脯氨酸占用（Gelse,Poschl,&Aigener,2003）。目前，至少已有27中膠原蛋白類型已確定，其氨基酸序列、分子結(jié)構(gòu)和功能明顯不同（Canty&Kadler,2005;Cheng,Hsu,Chang,Lin,&Sakata,2023）。膠原蛋白已被廣泛用作醫(yī)藥、化妝品、生物醫(yī)學(xué)和食品行業(yè)的材料（Chengetal.,2023）。一般來說，工業(yè)應(yīng)用的膠原蛋白的主要來源是牛與豬的皮膚和骨頭。然而，阮病毒疾病的爆發(fā)，如海綿腦?。˙SE），傳染性海綿腦?。═SE）和口蹄疫（FMD），以及禽流感，導(dǎo)致一些消費者對從這些動物體提取的膠原蛋白和膠原蛋白產(chǎn)品的擔(dān)憂。此外，以豬為原料提取膠原蛋白不能被猶太人和穆斯林接收（Liu,Liang,Regenstein,&Zhou,2023;Regenstein&Zhou,2007）。因此，全球?qū)δz原蛋白的代替原料的需求增加了，如水生動物。但是，關(guān)于膠原蛋白提取的其他來源的信息是有限的。蛋殼作為副產(chǎn)品大約占了一個雞蛋總重量（60g）的10%（Nys,Bain,&Immerseel,2023）。據(jù)估計每年在伊朗蛋制品工業(yè)都產(chǎn)生100000噸的蛋殼。蛋殼膜存在于白色液體和固體蛋殼內(nèi)表面之間。膠原蛋白占蛋殼膜總蛋白含量的10%（MacNeil,2006）。在蛋殼膜中已經(jīng)確定含有Ⅰ型、Ⅴ型和Ⅹ型膠原蛋白（Ariasetal.,1992）。經(jīng)生化、細(xì)胞毒性與基因毒性檢測，在自身免疫性風(fēng)險和消費的過敏反應(yīng)中蛋殼膜膠原蛋白是安全的（Ruff,Endres,Clewell,Szabo,&Schauss,2023）。因此，蛋殼膜加工的副產(chǎn)品，是膠原蛋白的重要來源，有可能取代哺乳動物來源。通過優(yōu)化提取工藝獲得高收益的蛋殼膜膠原蛋白是很重要的。乙酸和蛋白酶濃度、反應(yīng)時間、PH值包括NaOH濃度、堿處理時間和提取溫度都是影響膠原蛋白提取率以及提取的膠原蛋白功能性質(zhì)的重要變量。響應(yīng)面法（RSM）可以用來進行提取方法的優(yōu)化。RSM是一種集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計技術(shù)于一身并廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)評估預(yù)測獨立變量和相關(guān)變量之間關(guān)系的方法（Box&Wilson,1951）。RSM的主要優(yōu)勢是在需要評估多個變量及其交互作用時減少實驗的數(shù)量，因此RSM比其他方法更省時省力（Wu,Cui,Tang,&Gu,2007）。關(guān)于從水生動物中提取膠原蛋白優(yōu)化的研究早有報道（Wang,Yang,Du,Yang,&Liu,2023;Woo,Yua,Cho,Lee,&Kim,2023）。這些研究表明，RSM在提取膠原蛋白的最佳條件的研究上是有效的。至今還沒有關(guān)于蛋殼膜膠原蛋白提取優(yōu)化的報道。因此，本工作的目的就是用RSM對蛋殼膜中酶溶性膠原蛋白（PSC）提取條件的優(yōu)化。本研究調(diào)查的是關(guān)鍵處理變量（NaOH濃度、堿處理時間、酶濃度和水解時間）對PSC提取率的影響，并確定從蛋殼膜中提取PSC的最佳條件。2.材料與方法2.1.材料和化學(xué)試劑未加工的蛋殼膜來源于商業(yè)。仔細(xì)的手動去除外膜并用蒸餾水洗凈。酶活為750U/mg的胃蛋白酶是從SigmaAldrichCo.（St.Louis,US）購買的。NaCl、乙酸、NaOH和三（羥甲基）氨基甲烷是從Merck(Darmstadt,Germany)購買的。本研究中所使用的所有試劑均為分析級。2.2.蛋殼膜中酶溶性膠原蛋白的提取PSC是從蛋殼膜中用Kittiphattanabawon,Benjiakul,Visessanguan,Nagai,andTanaka(2005)andLiuetal.(2023)提出的方法并稍加改進之后提取出來的。準(zhǔn)確稱取5g的新鮮蛋殼膜。蛋殼膜用10倍質(zhì)量體積比（V/W）的堿性溶液（0.2-1.2mol/LNaOH）攪拌處理6-36h，每2h更換一次堿液，除去雜蛋白。然后棄上清，堿處理過的樣品用蒸餾水清洗直至PH成中性。提取PSC時，將預(yù)處理的蛋殼膜浸泡在0.5mol/L的乙酸與胃蛋白酶（15-90U/mg）抽提液中攪拌處理12-72h。胃蛋白酶的量以酶活計?；旌衔镉脙蓪蛹啿歼^濾以除去未溶解的碎片。該溶液用0.05mol/L的Tris(PH=7.0)以及終濃度2mol/L的NaCl鹽析。在30000g的離心力下5℃左右離心40min得到沉淀；然后用10倍質(zhì)量體積比的0.5mol/L的醋酸溶解沉淀。最終的溶液用分子量12KDa的透析膜在4℃的冷水中透析12h，每4h換一次透析液。然后將溶液用凍干機冷凍干燥（ALPHA2-4;Christ,Harz,Germany）。從這個角度講提取物為胃蛋白酶溶性膠原蛋白（PSC）。PSC的得率是在蛋殼膜清洗后的重量基礎(chǔ)上的百分比。PSC的得率計算式如下：（1）2.3.實驗設(shè)計與統(tǒng)計分析首先，通過改變單一因素影響PSC的總收率來確定提取的初步范圍變量：NaOH濃度、堿處理時間、酶濃度和水解時間。然后，用RSM對提取參數(shù)進行優(yōu)化。為確定獨立變量對反應(yīng)的交互影響，做四因素五水平的中心復(fù)合設(shè)計（CCD）。自變量的范圍以及水平已由Table1給出。自變量及其水平的選擇以初步實驗的結(jié)果為基礎(chǔ)。提取率為因變量。對于統(tǒng)計計算，變量進行編碼之后根據(jù)方程：（2）是變量的編碼值；是變量的實際值；是在中心水平的實際值；是階躍變量。如表2所示，實驗設(shè)計的CCD的30個實驗點是隨機組成的（16個因子點、8個軸向點和6個中心點）。設(shè)計中心的六次重復(fù)（處理時間25-30h）是被用來估計純誤差的平方和的。以CCD數(shù)據(jù)進行多元線性回歸分析符合下列二次多項式：（3）代表因變量（膠原蛋白產(chǎn)量，%）；是一個常數(shù)；、和是回歸系數(shù)；和是自變量水平。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)線性回歸可得到響應(yīng)面圖和等高線圖的回歸模型。這些響應(yīng)面和等高線圖能夠直觀的反應(yīng)每一個實驗因素水平與反應(yīng)之間的關(guān)系，并確定最優(yōu)條件（Lu,Engelmann,Lila,&Erdman,2023）。Design-Expert8.1.3(trialversion,State-EaseInc.,Minneapolis,USA)是一款用于計算二次多項式模型和優(yōu)化的系數(shù)的軟件。當(dāng)P值小于0.05時認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。每個數(shù)據(jù)都要測定三次取平均值。3.結(jié)果與討論3.1.單因素實驗結(jié)果3.1.1.NaOH濃度對膠原蛋白提取率的影響NaOH濃度對PSC提取率的影響如Fig.1a所示。提取時其他條件一定：酶濃度45U/mg、水解時間36h、堿處理時間18h，而以NaOH濃度（0.2，0.4，0.6，0.8，1和1.2mol/L）為變量進行。隨著NaOH濃度的增加，提取率迅速增加，在0.7-0.8mol/L時達到高峰。然后提取率顯著下降（在0.8mol/l以上），可能是由于結(jié)構(gòu)的破壞和PSC的分解。因此，本文取0.8mol/L的NaOH濃度進行下一步實驗。3.1.2.堿處理時間對膠原蛋白提取率的影響堿處理時間對PSC的提取率的影響如Fig.1b所示。堿處理時間分別被設(shè)定為6，12，18，24，30和36h；其他實驗條件固定如下：NaOH濃度為0.8mol/L，酶濃度45U/mg，水解時間36h。從Fig.1b中可以看出在6~18h內(nèi)產(chǎn)量隨堿處理時間增加而增加，緊接著隨堿處理時間的增加而減少。因此，18h時獲得PSC的最大提取率。3.1.3.酶濃度對膠原蛋白提取率的影響為了研究酶濃度對PSC提取率的影響，提取使用不同的酶濃度進行：15，30，45，60，75和90U/mg。其他三個提取參數(shù)固定：NaOH濃度0.8mol/L，水解時間36h，堿處理時間18h（Fig.1c）。當(dāng)酶濃度從15到45U/mg增加時PSC的提取率從22.5%顯著增加到30.9%，然后當(dāng)酶濃度超過45U/mg后提取率智慧稍微增加。在酶濃度為45U/mg時PSC提取率依然很高，但是增加沒弄都會導(dǎo)致工業(yè)提取工藝成本提高（Ye&Jiang，2023）。所以，45-60U/mg被認(rèn)為是PSC提取的最佳條件。3.1.4.水解時間對膠原蛋白提取率的影響水解時間對膠原蛋白提取率的影響可能是當(dāng)胃蛋白酶打開專門的蛋殼膜膠原蛋白肽區(qū)時時間有利于PSC暴露于抽提介質(zhì)。這一作用可以溶解膠原蛋白，并使其從材料中擴散出來。Fig.2d顯示水解時間對PSC提取率的影響。其他提取參數(shù)設(shè)定如下：NaOH濃度0.8mol/L，酶濃度45U/mg，堿處理時間為18h。在水解時間從12增加到48h時，提取率的方差相對快速而且PSC產(chǎn)量高達29.6%；提取過程將在這個水平進行。因此，36-48h的范圍被認(rèn)為是提取的最佳水解時間?；|(zhì)中的質(zhì)量傳遞速率是決定提取率的關(guān)鍵因素。換句話說，膠原蛋白從蛋殼膜基質(zhì)中到大量抽提介質(zhì)中的釋放率是與時間有關(guān)的。因此，預(yù)計PSC的產(chǎn)率將繼續(xù)隨著時間的延長而升高。這就解釋了水解時間從36到48h對膠原蛋白產(chǎn)量的正效應(yīng)。換句話說，PSC飽和溶劑導(dǎo)致了酶活性的降低進而導(dǎo)致了水解時間48h以后提取率的降低。根據(jù)單因子實驗，NaOH濃度選0.4-1.2mol/L,堿處理時間選6-30h，酶濃度選15-75U/mg，水解時間選12-60h進行RSM實驗。3.2.膠原蛋白提取參數(shù)的優(yōu)化3.2.1.模型擬合四個獨立變量的范圍和中心點的值都是基于單因子實驗結(jié)果的。在當(dāng)前的符合設(shè)計中有四個過程變量（，NaOH濃度；，堿處理時間；，酶濃度；，水解時間）總共30個運行命令，如Table2所示。此外，實驗結(jié)果證明，膠原蛋白的提取率從14.8%到30.1%不等。膠原蛋白最高產(chǎn)量（30.1%）的實驗條件是：NaOH濃度0.8mol/L，堿處理時間18h，酶濃度75U/mg，水解時間36h。通過對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，響應(yīng)產(chǎn)量和測試變量呈相關(guān)性，表示為二階多項式方程：（4）其中是酸溶性膠原蛋白的產(chǎn)量，而，，和分別是變量NaOH濃度、堿處理時間、酶濃度和水解時間的編碼。所選擇的二次預(yù)測模型的提取率（）的擬合統(tǒng)計顯示在Table4。對二次回歸模型進行方差分析（ANOVA）得決定系數(shù)（）表明，只有0.38%不能用模型來解釋。然而，一個較大的值并不總是意味著回歸模型是好的。調(diào)整后的確定系數(shù)（Adj）也證實該模型是非常好的，這表明膠原蛋白產(chǎn)量的實驗值與預(yù)測值高度契合。誤差分析的結(jié)果表明，缺乏適合性檢驗（0.5821）是不重要的，95%的可信度完全可以證實模型的有效性。同時，一個相對低的變異系數(shù)（）代表一個非常高的精度高度可靠的實驗值（Songetal.，2023）。因此，該模型的P值（）非常低（<0.00001），表明該模型是有意義的。足夠高精度的S/N（信噪比），大于4代表模型足夠的識別力（Myers,Montgomery,&Anderson-Cook,2023）。66.832的實驗比表示一個足夠的信號。所有這些統(tǒng)計參數(shù)都表明模型的可靠性。Table3顯示了方程（4）的回歸系數(shù)。對于該模型中的每一項，一個小的P值（P<0.05）和一個大的F值意味著對提取率的影響更為顯著（Quanhong&Caili,2005）。該表顯示有一個非常小的P值（P<0.05），表明線性系數(shù)（,,和）、二次系數(shù)（,,和）和交互系數(shù)（,,和）是顯著的。另一項系數(shù)對提取率無顯著影響（P>0.05）。3.2.2.膠原蛋白提取條件大優(yōu)化響應(yīng)面法是用來說明NaOH濃度、堿處理時間、酶濃度和水解時間對反應(yīng)的影響的?；貧w模型可以預(yù)測四個參數(shù)對產(chǎn)量的影響。四個實驗變量之間的交互作用和反應(yīng)與每個變量實驗水平之間的關(guān)系可用三圍響應(yīng)面和二維等高線圖說明（Liu,Mei,Wang,Shao,&Tao,2023）。一個圓形的等高線圖表明相應(yīng)的變量之間的交互作用是可以忽略不計的，而橢圓形的等高線圖則恰恰相反（Muralidhar,Chirumamil,Marchant,&Nigam,2001）。在堿性介質(zhì)中（NaOH）毀容劫匪膠原蛋白，而且酶的作用會大打折扣（Satoetal.,2003）。Fig.2aweiNaOH濃度和堿處理時間對產(chǎn)量綜合影響的三維響應(yīng)面和等高線圖。這些圖中顯示的是使其他變量保持在他們的中值（實驗范圍的中間值）時兩個影響因素的響應(yīng)值。彎曲的響應(yīng)面和橢圓形的等高線圖表示兩個影響因素之間存在較強的交互作用。當(dāng)NaOH濃度在0.7和0.8mol/L之間，堿處理時間在12和18h之間時得到膠原蛋白的高收益。隨著NaOH濃度（0.8-1.2mol/L）和堿處理時間（18-36h）的繼續(xù)增加提取率下降。這表明NaOH濃度（）和堿處理時間（）對提取率的交互影響很顯著，這一結(jié)果與Table4相吻合。NaOH濃度（）和酶濃度（）對提取率的交互影響顯示在Fig.2b。響應(yīng)面實驗的最大預(yù)測值被包含在等高線圖中最小的橢圓里。等高線圖中最小的橢圓環(huán)表明獨立變量之間有一個顯著的交互影響（Muralidharetal.,2001）。如圖所示，提取率隨著胃蛋白酶濃度一直增加到50U/mg而增加，之后在高濃度時略有增加。PSC的產(chǎn)量隨著NaOH濃度一直增加到0.8mol/L而增加。交互效果是通過NaOH濃度和酶濃度的同時作用觀察到的。Fig.2c顯示的是在固定酶濃度和堿處理時間（0水平）而NaOH濃度（）和水解時間（）不同的條件下得到的三位響應(yīng)面和等高線圖。Fig.2c表明，當(dāng)NaOH濃度和水解時間處于閾值水平式，即分別為0.7-0.8mol/L和36-48h時，PSC的提取率可以達到最大。堿處理時間（）和酶濃度（）對膠原蛋白產(chǎn)量（）的影響如Fig.2d所示。如圖所示，提取率隨酶濃度從15到60U/mg增加而迅速增加，但超過60U/mg后提取率隨著酶濃度的增加而緩慢增加。PSC提取率隨著堿處理時間從12到18h增加而增加，之后歲堿處理時間增加而下降。Fig.2e顯示了酶濃度（）和NaOH濃度（）分別固定在45U/mg和0.8mol/L前提下堿處理時間（）和水解時間（）的交互作用。PSC提取率隨水解時間從從12到48h增加而上升，但之后不再隨水解時間進一步增加而上升；它還還隨堿處理時間從6到18h增加而上升，之后隨之從18到30h增加而下降。Fig.2f為不同酶濃度和水解時間而固定NaOH濃度（0.8mol/L）和堿處理時間（18h）的條件下得到的三維響應(yīng)面和等高線圖。當(dāng)酶濃度在50-75U/mg的范圍內(nèi)時PSC產(chǎn)量逐漸增加，并且在水解時間48h時達到最大，之后將不再進一步變化。應(yīng)該指出的是：酶溶發(fā)生在較高的酶水平（75U/mg以上）和較長的水解時間（48h以上）時并不總能達到一個理想的響應(yīng)值，這可能表明高分子量的肽片段不能通過鹽析得到。我們的結(jié)果與Wang,Yang,Wang,andDua(2023)報道的通過增加胃蛋白酶量來提高草魚中膠原蛋白產(chǎn)率的結(jié)果相符。結(jié)果表明：用0.5mol/L乙酸提取蛋殼膜中的膠原蛋白分子并沒有完全溶解（數(shù)據(jù)未顯示）。該現(xiàn)象最有可能被膠原蛋白分子在膠原鏈肽區(qū)域極易共價交聯(lián)或分子間交聯(lián)從而導(dǎo)致膠原分子在乙酸溶液中的低溶解度這一事實解釋（Ahmad&Benjakul,2023;Jongjareonrak,Benjakul,Visessanguan,Nagai,&Tanaka,2005;Zangetal.,2007）。胃蛋白酶處理能夠在不損害膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)完整性的前提下專門得打通蛋殼膜中膠原蛋白的非螺旋端肽。因此，部分裂解的膠原蛋白的產(chǎn)量會增加（Huang,Shiau,&Chen,2023;Nalinanon,Benjakul,Visessanguan,&Kishimura,2007）。分析表明,在四個獨立