微陣列比較基因組雜交分析18等臂雙著絲粒染色體胎兒全基因

微陣列比較基因組雜交分析18等臂雙著絲粒染色體胎兒全基因組拷貝數(shù)變化的實驗研究張艷亮1，戴勇1，涂植光1，李啟運2，吳瑛2，曾君2，林秀華2，張麗2（1重慶醫(yī)科大學，教育部臨床檢驗診斷學重點實驗室，重慶400016，2暨南大學第二臨床醫(yī)學院（深圳市人民醫(yī)院），深圳518082）摘要：目的了解18q等臂雙著絲粒染色體[idic(18)(p11→qter)]胎兒全基因組拷貝數(shù)變化的情況，確定idic(18)(p11→qter)的結(jié)構(gòu)和組成，探討微陣列比較基因組雜交在分子細胞遺傳診斷中運用的可行性和優(yōu)越性。方法運用微陣列比較基因組雜交芯片對一被傳統(tǒng)G顯帶和熒光原位雜交診斷為idic(18)(p11→qter)的胎兒進行全基因組高分辯率掃描和分析。結(jié)果微陣列比較基因組雜交顯示胎兒存在18p11.21→pter缺失，18p11.21→qter復制，斷裂點位于12104527和12145199（距離18p端粒），確定idic(18)(p11→qter)是idic(18)(p11.21→qter)。另外，還檢測出了21個亞顯微拷貝數(shù)變化。結(jié)論與傳統(tǒng)的細胞遺傳分析方法相比，微陣列比較基因組雜交不僅能準確、高分辯率和高通量地檢測出基因組拷貝數(shù)變化，還能高分辯率地確定拷貝數(shù)變化的斷裂點。關鍵詞：微陣列比較基因組雜交；18等臂雙著絲粒染色體；拷貝數(shù)變化中圖法分類號:R394-3文獻標識碼：AExperimentalstudyofwholegenomiccopynumbervariationsinafetuswithadenovoisodicentricchromosome18byarray-basedcomparativegenomichybridizationZHANGYan-liang1,DAIYong1,2,TUZhi-guang1,LIQi-yun2,WUYing2,ZENGJun2,LINXiu-hua2,ZHANGLi2(1KeyLaboratoryofLaboratoryMedicalDiagnostics,MinistryofEducation,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China,2TheSecondClinicalMedicalCollege(ShenzhenPeople’sHospital),JinanUniversity,Shenzhen518020,China)Abstract:ObjectiveTounderstandgenomiccopynumbervariations(CNVs)inafetuswithadenovoisodicentricchromosome18q[idic(18)(p11→qter)],identifyorganizationandcomponentsoftheidic(18)(p11→qter),andinvestigatepossibilityandsuperiorityofarray-basedcomparativegenomichybridization(array-CGH)inmolecularcytogeneticdiagnosis.MethodsThewholegenomeofafetuswithidic(18)(p11→qter)diagnosedbyG-bandingandfluorescenceinsituhybridizationwasscannedandanalysedbyarray-CGH.ResultsTheresultsofarray-CGHshoweddeletionof18p11.21→pterandduplicationof18p11.21→qter,thebreakpointwasbetween12104527and12145199(fromthetelomereof18p),whichindicatedtheidic(18)(p11→qter)wasidic(18)(p11.21→qter)actually.Furthermore,21submicroscopicgenomicCNVswereidentified.ConclusionComparingwithconventionalcytogeneticanalysis,array-CGHcannotonlydetectgenomicCNVswithhighaccuracy,highresolution,andhigh-throughput,butalsoidentifybreakpointsofCNVswithhighresolution.Keywords:array-basedcomparativegenomichybridization;isodicentricchromosome18;copynumberalterations基因組拷貝數(shù)變化（copynumbervariations，CNVs）用來描述患者與正常參考之間基因組DNA拷貝數(shù)的差異，以及導致微缺失和微復制綜合征的基因組不平衡[1]。最近的研究表明，CNVs的發(fā)生率至少是SNPs的3倍，在許多人類疾?。ㄈ缒[瘤、遺傳性疾病、心血管疾病及糖尿?。┑陌l(fā)生、發(fā)展中起重要作用。許多細胞遺傳分析技術，如染色體顯帶技術、熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）、作者簡介：張艷亮，男，云南省瑞麗市人，博士研究生，主要從事分子細胞遺傳診斷方面的研究，電話E-mail：zylyh2007@..通信作者:戴勇，電話：（0755）25533018-2780,E-mail:daiyong22@收稿日期：2008-07-17；修回日期：2008-09-17實時定量PCR（real-timequantitativePCR，RT-qPCR）、多重連接介導的探針擴增（multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA）和比較基因組雜交（comparativegenomichybridization,CGH）等都能用于CNVs的檢測和描述，但這些技術要么由于分辯率低，難以檢測亞顯微CNVs，更難以確定CNVs的大小和斷裂點；要么由于低通量性，僅能對有限的基因組位點進行分析，無法對整個基因組進行篩查。最近，微陣列比較基因組雜交（array-basedcomparativegenomichybridization，array-CGH）作為一種新型的強大的細胞遺傳分析方法出現(xiàn)了，為細胞遺傳診斷和研究提供了一個新的平臺。Array-CGH與傳統(tǒng)CGH的原理相似，但用吸附于固體載體（如玻片）上的大量DNA探針取代了中期染色體，分辨率達到了空前的高度。因此，Array-CGH結(jié)合了傳統(tǒng)CGH高通量和FISH高分辨率等優(yōu)點，一次檢測相當于對基因組同時進行了成千上萬個獨立的FISH。本研究運用array-CGH對一嚴重四肢畸形和心臟缺陷、傳統(tǒng)細胞遺傳診斷為18q等臂雙著絲粒染色體[idic(18)(p11→qter)]的胎兒進行全基因組掃描，了解胎兒全基因組CNVs的情況，探討array-CGH在分子細胞遺傳診斷中運用的可行性和優(yōu)越性。1材料與方法1.1病例資料28歲孕3產(chǎn)0漢族孕婦，此次妊娠26周時，超聲檢查顯示胎兒雙側(cè)橈骨缺失并雙手畸形，雙側(cè)肱骨較短，右側(cè)足內(nèi)翻，Taussing-Bing綜合征（室間隔缺損，肺動脈騎跨），雙側(cè)脈絡膜囊腫，頸項軟組織增厚。否認近親結(jié)婚，否認高血壓、糖尿病、腎病、肝炎、結(jié)核病等病史，否認家族遺傳病史。G顯帶染色體分析結(jié)果為：46,XY,-18,+der(?)。FISH顯示衍生染色體可能是18q等臂雙著絲粒染色體[idic(18)(p11→qter)]，確切的斷裂點尚無法確定。父母的核型均正常。1.2細胞收集收集經(jīng)G顯帶染色體檢查后剩余的胎兒細胞懸液，-20℃保存。收集一核型和表型均正常的男性個體的外周血細胞培養(yǎng)懸液作為正常對照，-201.3Array-CGH分析運用AgilentTechnologiesArrayCGHKits(SantaClara,USA)進行array-CGH分析，此芯片平臺的探針是60-mer的寡核苷酸，能以~20kb(kit244A)的分辯率進行全基因組掃描。DNeasyBlood&TissueKit(Qiagen,Germany)提取胎兒和對照標本的基因組DNA，片段化。用GenomePlex?(Sigma,USA)進行全基因組擴增，純化。用GenomicDNALabelingKitPLUS(Agilent,USA)通過隨機引物法對兩樣本進行標記，用Cy5-dUTP和Cy3-dUTP分別標記胎兒和對照標本。純化標記產(chǎn)物并檢測標記效率，將標記產(chǎn)物和50μgCot-1DNA混合、變性和預退火后，于65℃與芯片旋轉(zhuǎn)雜交40h。沖洗2次后，用AgilentScannerandFeatureExtractionV.9.5(Agilent,USA)對雜交結(jié)果進行掃描，所得數(shù)據(jù)由CGHAnalytics3.4(Agilent,USA)進行分析。CNVs的篩選標準：相鄰的4個探針向同一方向變化，且log2待測/對照比值≤-0.5或≥1.4RT-qPCR為了驗證array-CGH檢測結(jié)果的準確性，選擇2個亞顯微CNVs(一個微復制和一個微缺失)，按照Qiao等[2]所用的方法在復制（22q11.23）和缺失（14q11.1-q11.2）的基因組區(qū)域中選擇非多態(tài)性片段進行RT-qPCR檢測。復制區(qū)域的引物：F:5'-GGCCTTGTCTGTTCTGTTGTT-3'，R:5'-TTCTTTCCATTCGGTATCCAC-3'；缺失區(qū)域的引物：F:5'-TACAGCCTCAGCACAATACCG-3'，R:5'-TAACAAACCTCCTCCTTCCAGT-3'；以GAPDH為內(nèi)參：F:5'-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3'，R:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。反應條件為：95℃，5min；40個PCR循環(huán)（95℃，10s；59℃20s）。通過比較患者與對照樣本同一位點的CT值來計算病人此位點拷貝數(shù)的相對變化，數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析。2結(jié)果2.1Array-CGH分析結(jié)果對胎兒進行全基因組array-CGH掃描分析后，顯示18p11.21→pter缺失，18p11.21→qter復制，斷裂點位于12104527和12145199之間（距離18p端粒）（圖1），表明idic(18)(p11→qter)實際上是18等臂雙著絲粒染色體[idic(18)(p11.21→qter)]。由于父母的核型均正常，因此，idic(18)(p11.21→qter)是新生成的。另外，從其它13條染色體中共檢測出了21個亞顯微CNVs并被分為兩組（表1）。A組含有13個公共病理性CNVs數(shù)據(jù)庫[theDatabaseofChromosomalImbalanceandPhenotypeinHumansusingEnsemblResources(DECIPHER,http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/)]已報道過的CNVs，且大都是已報道的CNVs片段當中的一個區(qū)段。B組中的8個CNVs與公共良性CNVs數(shù)據(jù)庫[theDatabaseofGenomicVariants（http://projects.tcag.ca/variation/）中的CNVs相重疊。13個CNVs（A組有7個，B組有6個）是微復制。最小的CNV僅13.91kb。在21個亞顯微CNVs中，9個（A組有8個）含有OMIM數(shù)據(jù)庫列出的基因（N＝12），分別涉及人類免疫、代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、解毒和腫瘤發(fā)生等生物功能。圖118染色體的array-CGH掃描圖左邊，是18染色體的模式圖。右邊，是18染色體探針的log2比值以及在染色體上所處的位置。每一個點代表array-CGH芯片上的一個探針?？截悢?shù)缺失(18p11.21→pter)的log2比值≤-0.5，移向左邊；拷貝數(shù)復制(18p11.21→qter)的log2比值≥0.5，移向右邊；無CNVs區(qū)域的log2比值為0。2.2RT-qPCR2個亞顯微CNVs（一個微復制和一個微缺失）的RT-qPCR檢測結(jié)果與array-CGH的檢測結(jié)果相吻合（表2，3）。表1Array-CGH鑒定出的所有亞顯微CNVs染色體區(qū)帶起點和終點大小(kb)復制缺失OMIM列出的基因生物功能A組B組4q13.24q31.226p21.337p14.17q31.110q21.111q1111q2513q12.1117q1219q13.1122q11.2322q13.12p123q26.16p21.326p21.3211p15.414q11.1-q11.216q12.216p13.369073931-69163102145186300-14525547729967450-3003023238276360-38340209110772120-11084778357140052-5727133355123519-55203906133658268-13371677819856522-1998870131448491-3163566539872173-3992259322683573-2272124237685701-3771324875843629-75896398164009121-16410825332564961-3266866732723444-327429995745129-576472718539664-1949461654356504-543769871079625-109353789.1769.1862.7863.8575.66131.2880.3458.51132.18187.1750.4237.6727.5552.7799.1362.7819.5619.6954.9520.4813.91+++++++++++++--------UGT2B17HLA-AIMMP2LCRYL1CCL4,CCL3L1,CCL3L3ZNF181GSTT1APOBEC3A,APOBEC3BHLA-DRB5類固醇代謝介導免疫反應蛋白代謝蛋白代謝HIV-1免疫反應性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)解毒腫瘤發(fā)生介導免疫反應表2患者微復制(22q11.23)的RT-qPCR檢測結(jié)果樣本CT(GAPDH)CT(22q11.23)CT(22q11.23)-CT(GAPDH)△△CT=[CT(22q11.23)-CT(GAPDH)]（其他樣本）-[CT(22q11.23)-CT(GAPDH)]（對照）2-△△CT對照病人18.4818.0425.7223.647.245.60(7.24-7.24)-1.64(5.6-7.24)1.003.12注：計算結(jié)果表明對照樣本中22q11.23的拷貝數(shù)為1，則在患者樣本中的拷貝數(shù)為3.12表3患者微缺失(14q11.1-q11.2)的RT-qPCR檢測結(jié)果樣本CT(GAPDH)CT(14q11.1-q11.2)CT(14q11.1-q11.2)-CT(GAPDH)△△CT=[CT(14q11.1-q11.2)-CT(GAPDH)]（其他樣本）-[CT(14q11.1-q11.2)-CT(GAPDH)]（對照）2-△△CT對照病人18.4818.0426.5427.158.069.110(8.06-8.06)1.05(9.11-8.06)1.000.48注：計算結(jié)果表明參照樣本中14q11.1-q11.2的拷貝數(shù)為1，則在患者樣本中的拷貝數(shù)為0.48。3討論1條染色體的兩臂在形態(tài)與遺傳上相同并借一個或兩個著絲粒連接在一起,稱為等臂染色體。根據(jù)著絲粒的來源，雙著絲粒染色體可以分為3種類型[3]：①異源雙著絲粒染色體，著絲粒來源于非同源染色體；②同源雙著絲粒染色體，著絲粒來源于兩條同源染色體；③等臂雙著絲粒染色體，著絲粒來源于同一染色體，在遺傳上完全一致，兩臂成鏡像關系。等臂雙著絲粒染色體的形成機制包括[3]：①在S或G2期，姐妹染色單體發(fā)生等位U型交換（姐妹染色單體等位斷裂后于斷裂點處重接）；②染色體在G1發(fā)生缺失，缺失后的染色體進行復制，隨后，姐妹染色單體于斷裂點處發(fā)生U型重接。18等臂染色體[i(18q)ori(18p)]是一種罕見的細胞遺傳異常。由于僅靠顯帶分析，很難確定雙著絲粒模式，所以18長臂和短臂等臂雙著絲粒染色體取代一正常18染色體的報道更加罕見。到目前為止，僅報道過幾例斷裂點位于18p的18假等臂雙著絲粒染色體病例[4,5,6,7,8,9,10,11]。由于q臂的三體和p臂的單體，單著絲粒18q[i18(q)]等臂染色體患者通常同時表現(xiàn)出Edwards綜合征和18p單體綜合征的特征。而如果是idic(18)(p11→qter)，則可能只表現(xiàn)出Edwards綜合征的特征[12]。本病例是idic(18)(p11.21→qter)，存在18p11.21→pter缺失和18p11.21→qter復制，也僅表現(xiàn)出Edwards綜合征的特征。因為缺乏18p-綜合征的特征，本病例支持18p-相關的Turner樣特征可能是由18p11的單體所決定[7]，并推斷關鍵區(qū)域可能位于18p11→18p11.21之間。另外，18p-綜合征的缺乏，也可能是由于18p單體的表型較輕微，常被Edwards綜合征嚴重的表型所掩蓋。至于多余的著絲粒究竟如何抑制18p單體綜合征表型的出現(xiàn)以及18p-相關的Turner樣特征是否由18p11→18p11.21的單體所決定有待進一步研究。本病例存在嚴重的四肢畸形，定位于18p的SALL3的劑量不平衡可能是導致橈骨缺失的原因[13]。盡管本病例與Wulfsberg等[7]報道的病例間的核型十分相似，但表型卻有很大差異。這除了缺失或復制染色體片段的大小和位置不同外，基因組其它位點的亞顯微CNVs、遺傳修飾因子和閾值[14]的影響也可能是造成表型差異的原因。傳統(tǒng)的G顯帶分析由于分辯率不高，很難確定衍生染色體畸變片段的大小、斷裂點和來源，因此難以判斷衍生染色體是idic(18)(p11.21→qter)，更無法檢測其它染色體的亞顯微CNVs。通過FISH分析，雖然證明了衍生染色體是idic(18)(p11→qter)，但仍無法確定斷裂點的位置、缺失和擴增片段的大小以及其它的CNVs。通過array-CGH進行全基因組掃描后，不僅把idic(18)(p11→qter)確定為idic(18)(p11.21→qter)，而且把斷裂點定位于12104527和12145199之間（距離18p端粒），表明18p并未完全缺失，尚存在18p11→18p11.21的復制。另外，還發(fā)現(xiàn)了21個亞顯微CNVs，最小的一個僅13.91kb。有9個CNVs（A組有8個）含有OMIM列出的基因，這些基因分別介導免疫反應(HLA-A,HLA-DRB5,CCL4L2,TBC1D3C和CCL3L1)，代謝(UGT2B17,IMMP2L和CRYL1)，解毒(GSTT1)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(ZNF181)和腫瘤發(fā)生(APOBEC3A和APOBEC3B)等生物功能。因為A組和B組的CNVs分別與公共病理性和良性CNVs數(shù)據(jù)庫中的CNVs重疊，且A組中有8個CNVs含有OMIM列出的基因，因此，A組的13個CNVs可能是病理性的，B組的8個CNVs可能是良性的。這些含有基因的CNVs對本病例的畸形表型是否有影響、以及不含基因或OMIM列出基因的CNVs有何臨床意義有待進一步研究。通過RT-qPCR對2個亞顯微CNVs進行了驗證，結(jié)果證明array-CGH的檢測結(jié)果是準確的。此研究表明,作為一種新型的分子細胞遺傳分析方法，array-CGH能夠準確、高分辯率和高通量地檢測等臂染色體和傳統(tǒng)顯帶分析無法檢測到的亞顯微CNVs,并把結(jié)果直接定位于基因組，與相應的基因聯(lián)系起來，為全面和準確地檢測和描述染色體畸變以及基因型-表型相互關系的研究提供了一種強大的分析方法。相信，不遠的將來，array-CGH可能成為一種常規(guī)的細胞遺傳分析方法用于臨床診斷。參考文獻:[1]LeeC,IafrateAJ,ArthurRB.Copynumbervariationsandclinicalcytogeneticdiagnosisofconstitutionaldisorders[J].Nat.Genet,2007,39(7Suppl):48–54.[2]QiaoY,LiuX,HarvardC,NolinSL,etal.Large-scalecopynumbervariants(CNVs):distributioninnormalsubjectsandFISH/real-timeqPCRanalysis[J].BMCGenomics,2007,8:167.[3]LinCC,LiYC,LiuPP,etal.Identificationandcharacterizationofanewtypeofasymmetricaldicentricchromosomederivedfromasinglematernalchromosome18[J].CytogenetGenomeRes,2007,119(3-4):291–296.[4]LaurentC,BiemontMC,PhilipT,etal.Translocationstermino-terminalesdenovoentredeuxchromosomes18.Aproposdedeuxobservations46,XY,terrea(18;18)(pter;pter)[J].AnnGenet,1978,21:78–82.[5]WardBE,BradleyCM,CooperJB,etal.Homodicentricchromosomes:adistinctivetypeofdicentricchromosome[J].Med.Genet18,1981,18(1):54–58.[6]FiorettiG,StabileM,PaganoL,etal.AcaseofEdwards’syndromewithpseudodicentricisochromosome18:46,XY,idic(18)(p11::p11)[J].Ann.Genet,1982,25:116–118.[7]WulfsbergEA,SparkesRS,KlisakIJ,etal.Trisomy18phenotypeinapatientwithanisopseudodicentric18chromosome[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