淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)

淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)

淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)共14頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!前言分子定向進(jìn)化又稱實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化或進(jìn)化生物技術(shù)，它在體外模擬自然進(jìn)化機(jī)制，使進(jìn)化朝著人們需要的方向發(fā)展。近年來，分子定向進(jìn)化技術(shù)研究和應(yīng)用的領(lǐng)域逐漸擴(kuò)大，涉及基因治療、醫(yī)學(xué)診斷、食品和化學(xué)工業(yè)等各方面。隨著各種新型突變技術(shù)和新型檢測(cè)系統(tǒng)的出現(xiàn)，分子定向進(jìn)化技術(shù)研究將向縱深發(fā)展。淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)共14頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!一.分子定向進(jìn)化技術(shù)1.分子定向進(jìn)化技術(shù)的定義分子定向進(jìn)化(moleculardirectedevolution)是在分子水平研究所需生物的特定基因或蛋白質(zhì)，可以在試管里進(jìn)行無性繁殖或有性繁殖，其實(shí)質(zhì)是達(dá)爾文進(jìn)化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用，是在體外模擬突變、重組和選擇的自然進(jìn)化機(jī)制，使進(jìn)化朝著人們需要的方向發(fā)展。淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)共14頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!二.分子定向進(jìn)化的選擇策略1.致錯(cuò)PCR(error—pronePCR，epPCR)技術(shù)是指在利用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因的同時(shí)引入堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變。2..盒式突變(cassettemutagenesis)技術(shù)即寡核苷酸介導(dǎo)的誘變技術(shù)，是用一段人工合成具有突變序列的DNA片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列。淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)共14頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!4.高通量篩選技術(shù)(High-ThroughputScreening，HTS)表面展示技術(shù)是篩選蛋白質(zhì)突變體庫的高通量篩選方法，特別在抗體的研究當(dāng)中應(yīng)用非常普遍，具有高效、高靈敏度等特點(diǎn)。目前，表面展示技術(shù)有：噬菌體表面展示技術(shù)，細(xì)菌表面展示技術(shù)，酵母表面展示技術(shù)，酵母雙雜交系統(tǒng)，核糖體展示技術(shù)．蛋白質(zhì)片斷互補(bǔ)試驗(yàn).淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)共14頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!（2）.細(xì)菌細(xì)胞表面展示技術(shù)(BacterialCellSurfaceDisplay)結(jié)合熒光激活細(xì)胞篩選儀(Fluo．rescenceActivatedCellSorting，F(xiàn)ACS)或流式細(xì)胞篩選儀(flowcytometry)是非常有效的高通量篩選方法.該技術(shù)是目前惟一能夠定量檢測(cè)單細(xì)胞水平和大量突變體酶催化活性的方法。它能夠決定突變體庫中每個(gè)克隆的功能特性。淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)共14頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!2.分子定向技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用農(nóng)業(yè)飼料酶制劑中的應(yīng)用：通過易錯(cuò)PCR和DNA改組技術(shù)，獲得高比活和低pH淀粉酶；堿耐受性和在堿性條件下高活性的纖維素酶；耐高溫的纖維素酶；水解二糖的能力較野生型高31％葡聚糖內(nèi)切酶；溫度耐受性超過90℃，最適pH為酸性的木聚糖酶。淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)共14頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!四.展望伴隨著分子生物學(xué)新理論和新技術(shù)的發(fā)展，分子定向進(jìn)化的新方法和新技術(shù)必將會(huì)不斷涌現(xiàn)，層出不窮，必將會(huì)出現(xiàn)更多更好的新方法，解決更具體的問題，取得更大的進(jìn)步。淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)共14頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!2.原理在待進(jìn)化酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用TaqDNA多聚酶不具有3’一5‘校對(duì)功能的性質(zhì)，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。分子定向進(jìn)化其實(shí)是突變加篩選／選擇的重復(fù)循環(huán)，且整個(gè)進(jìn)化過程完全是在人為控制下進(jìn)行的。淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)共14頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!3.DNA改組(DNAshuffling)技術(shù)，又稱有性PCR(sexualPCR)或分子育種(molecularbreeding)，即DNA分子的體外重組。通過DNAshufling技術(shù)，既可對(duì)單基因或DNA片段進(jìn)行改組，也可對(duì)基因組或染色體等進(jìn)行改組。淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)共14頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!（1）.噬菌體展示技術(shù)(PhageDisplay)噬菌體展示技術(shù)是個(gè)真正用于體外高通量篩選的方法。人們利用這一技術(shù)可以將各種自然界或人工合成的DNA整合到絲狀噬菌體基因中，以融合蛋白的形式表達(dá)在噬菌體表面，利用噬菌體展示庫所固有的基因型和表現(xiàn)型之間的直接關(guān)聯(lián)進(jìn)行檢測(cè)。如抗原抗體反應(yīng)，生物素結(jié)合反應(yīng)等，根據(jù)反應(yīng)的性質(zhì)進(jìn)行分離，從中篩選出人們所需的突變蛋白質(zhì)。

淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)共14頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!三.分子定向進(jìn)化技術(shù)的應(yīng)用1.在治理環(huán)境生物污染方面的應(yīng)用有機(jī)磷的降解，Cho等通過兩輪的DNA改組和篩選，分離得到可提高降解甲基對(duì)硫磷的突變體，其中典型的突變體為22A11，水解甲基對(duì)硫磷的能力較野生型提高了25倍。諸如此類還有對(duì)三氯丙烷、三氯乙烯、五氯苯酚的降解.淺談分子定向進(jìn)化技術(shù)共14頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!3.在蛋白質(zhì)藥物上的應(yīng)用對(duì)酶類藥物的定向進(jìn)化，主要體現(xiàn)在提高活性和增強(qiáng)穩(wěn)定性上。使用DNA改組技術(shù)對(duì)人DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的碳末端進(jìn)行定向進(jìn)化。篩選到的突變體，對(duì)喜樹堿的敏感性比野生型的提高了22～28倍。對(duì)血纖維蛋白溶酶原催化抑制1(plasminogenactivatorinhibitortype1．PAI一1)進(jìn)行改組，篩選到的突變體的半衰期比野生型的