第八章真核基因轉錄調控培訓課程課件

第八章真核基因轉錄調控第八章真核基因轉錄調控1優(yōu)選第八章真核基因轉錄調控優(yōu)選第八章真核基因轉錄調控2真核生物和原核生物由于基本生活方式不同所決定基因表達調控上的巨大差別。原核生物的調控系統(tǒng)就是要在一個特定的環(huán)境中為細胞創(chuàng)造高速生長的條件，或使細胞在受到損傷時，盡快得到修復，所以，原核生物基因表達的開關經常是通過控制轉錄的起始來調節(jié)的。

真核生物和原核生物由于基本生活方式不同所決定基因表達調控上的3真核生物（除酵母、藻類和原生動物等單細胞類之外）主要由多細胞組成，每個真核細胞所攜帶的基因數量及總基因組中蘊藏的遺傳信息量都大大高于原核生物。人類細胞單倍體基因組就包含有3×109bp總DNA，約為大腸桿菌總DNA的1000倍，是噬菌體總DNA的10萬倍左右！真核生物（除酵母、藻類和原生動物等單細胞類之外）主要由多細胞4真核基因表達調控的最顯著特征是能在特定時間、特定的細胞中激活特定的基因，從而實現"預定"的、有序的、不可逆轉的分化、發(fā)育過程，并使生物的組織和器官在一定的環(huán)境條件范圍內保持正常功能。真核基因表達調控的最顯著特征是能在特定時間、特定的細胞中激活5真核生物基因調控，根據其性質可分為兩大類：

第一類是瞬時調控或稱可逆性調控，它相當于原核細胞對環(huán)境條件變化所做出的反應，包括某種底物或激素水平升降及細胞周期不同階段中酶活性和濃度的調節(jié)。

真核生物基因調控，根據其性質可分為兩大類：

第一類是6第二類是發(fā)育調控或稱不可逆調控，是真核基因調控的精髓部分，它決定了真核細胞生長、分化、發(fā)育的全部進程。第二類是發(fā)育調控或稱不可逆調控，是真核基因調控的精髓7原核生物真核生物

操縱元調控。

多樣化調控，更為復雜。

基因組小，大腸桿菌：總長4.6×106bp,編碼4288個基因,每個基因約1100bp。

基因組大，人類基因組全長3×109bp，編碼10萬個基因，其余為重復序列。

基因分布在同一染色體上，操縱元控制。

DNA與組蛋白結合成染色質，染色質的變化調控基因表達；基因分布在不同的染色體上，存在不同染色體間基因的調控問題。

適應外界環(huán)境，操縱元調控表達。

基因差別表達是細胞分化和功能的核心。

轉錄和翻譯同時進行，大部分為轉錄水平調控。

轉錄和翻譯在時間和空間上均不同，從DNA到蛋白質的各層次上都有調控，但多數為轉錄水平調控真核生物與原核生物的調控差異原核生物真核生物操縱元調控。多樣化調控，更為復雜。8一、真核基因表達調控的特點(一)真核基因表達調控的環(huán)節(jié)更多基因表達是基因經過轉錄、翻譯、產生有生物活性的蛋白質的整個過程。同原核生物一樣，轉錄依然是真核生物基因表達調控的主要環(huán)節(jié)。但真核基因轉錄發(fā)生在細胞核(線粒體基因的轉錄在線粒體內)，翻譯則多在胞漿，兩個過程是分開的，因此其調控增加了更多的環(huán)節(jié)和復雜性，轉錄后的調控占有了更多的分量。

一、真核基因表達調控的特點9第八章真核基因轉錄調控培訓課程課件10但真核啟動子間不像原核那樣有明顯共同一致的序列，而且單靠RNA聚合酶難以結合DNA而起動轉錄，而是需要多種蛋白質因子的相互協(xié)調作用?；虿顒e表達是細胞分化和功能的核心。第三節(jié)反式作用因子

(transactingfactors)這類蛋白激酶使底物蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化。適應外界環(huán)境，操縱元調控表達。類型3：不同剪接方式雞輸卵管細胞的染色質中被DNA酶I優(yōu)先降解的是卵清蛋白基因，而不是β-血紅蛋白基因。這樣，一個前體mRNA就可因剪接方式不同產生多種mRNA，轉譯出多個不同蛋白質.適應外界環(huán)境，操縱元調控表達。有實驗用序列相同但甲基化水平不同的DNA為材料，比較其作為RNA聚合酶轉錄模板的活性，發(fā)現甲基的引入不利于模板與RNA聚合酶的結合，降低了其體外轉錄活性。糾正某些移碼突變；②將模板固定在細胞核內特定位置，如連接在核基質上，有利于DNA拓撲異構酶改變DNA雙螺旋結構的張力，促進RNA聚合酶II在DNA鏈上的結合和滑動；人類細胞單倍體基因組就包含有3×109bp總DNA，約為大腸桿菌總DNA的1000倍，是噬菌體總DNA的10萬倍左右！活躍進行轉錄的染色質區(qū)域受DNaseⅠ消化常出現100－200bp的DNA片段，且長短不均一，說明其DNA受組蛋白掩蓋的結構有變化，出現了對DNaseⅠ高敏感點(hypersensitivesite)。真核DNA中的胞嘧啶約有5%被甲基化為5-甲基胞嘧啶(5methylcytidine,m5C)，而活躍轉錄的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常較低。這類蛋白激酶使底物蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化。(二)真核基因的轉錄與染色質的結構變化相關。真核基因組DNA絕大部分都在細胞核內與組蛋白等結合成染色質。染色質的結構、染色質中DNA和組蛋白的結合狀態(tài)都影響轉錄，有以下特點：1.染色質結構影響基因轉錄染色體結構復雜由DNA、組蛋白、非組蛋白等大分子組成；DNA序列重復；基因不連續(xù)性，真核生物基因的不連續(xù)性和轉錄后加工是真核基因有別于原核基因的重要特征。但真核啟動子間不像原核那樣有明顯共同一致的序列，而且單靠RN112、存在許多基因家族(genefamily)

來源相同、結構相似、功能相關的基因組成單一的基因簇或稱基因家族。同一家族中的成員有時緊密地排列在一起，成為一個基因簇；更多的時候，它們卻分散在同一染色體的不同部位，甚至位于不同的染色體上，具有各自不同的表達調控模式。2、存在許多基因家族(genefamily)

來源相同、結123、組蛋白的作用：組蛋白與DNA結合阻止DNA上基因的轉錄，去除組蛋白基因又能夠轉錄。組蛋白是堿性蛋白質，帶正電荷，可與DNA鏈上帶負電荷的磷酸基相結合，從而遮蔽了DNA分子，妨礙了轉錄，可能扮演了非特異性阻遏蛋白的作用；染色質中的非組蛋白成分具有組織細胞特異性，可能消除組蛋白的阻遏，起到特異性的去阻遏促轉錄作用。

3、組蛋白的作用：組蛋白與DNA結合阻止DNA上基因的轉錄，134.轉錄活躍的區(qū)域也常缺乏核小體的結構。這表明核小體結構影響基因轉錄。

5.轉錄活躍區(qū)域對核酸酶作用敏感度增加。

活躍進行轉錄的染色質區(qū)域受DNaseⅠ消化常出現100－200bp的DNA片段，且長短不均一，說明其DNA受組蛋白掩蓋的結構有變化，出現了對DNaseⅠ高敏感點(hypersensitivesite)。這種高敏感點常出現在轉錄基因的5′側區(qū)、3′末端或在基因上，多在調控蛋白結合位點的附近，分析該區(qū)域核小體的結構發(fā)生變化，可能有利于調控蛋白結合而促進轉錄。4.轉錄活躍的區(qū)域也常缺乏核小體的結構。146.DNA堿基修飾變化：真核DNA中的胞嘧啶約有5%被甲基化為5-甲基胞嘧啶(5methylcytidine,m5C)，而活躍轉錄的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常較低。這種甲基化最常發(fā)生在某些基因5′側區(qū)的CG序列中實驗表明這段序列甲基化可使其后的基因不能轉錄，甲基化可能阻礙轉錄因子與DNA特定部位的結合從而影響轉錄。如果用基因打靶的方法除去主要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常發(fā)育而死亡，可見DNA的甲基化對基因表達調控是重要的。由此可見，染色質中的基因轉錄前先要有一個被激活的過程，但目前對激活機制還缺乏認識。6.DNA堿基修飾變化：15(三)真核基因表達以正性調控為主真核RNA聚合酶對啟動子的親和力很低，基本上不依靠自身來起始轉錄，需要依賴多種激活蛋白的協(xié)同作用。真核基因調控中雖然也發(fā)現有負性調控元件，但其存在并不普遍；(三)真核基因表達以正性調控為主16雞輸卵管細胞的染色質中被DNA酶I優(yōu)先降解的是卵清蛋白基因，而不是β-血紅蛋白基因。交替剪接（alternativesplicing)：來自同一個基因的前體mRNA中某個內含子5’端供點又可在特定條件下與另一個內含子的3’端受點進行剪接，從而刪除這兩個內含子及其中間的全部外顯子和內含子。更多的時候，它們卻分散在同一染色體的不同部位，甚至位于不同的染色體上，具有各自不同的表達調控模式。每個螺旋區(qū)長15一16個氨基酸，其中有幾個氨基酸殘基是保守的。②阻遏蛋白特異結合：

如鐵蛋白的翻譯調控，鐵蛋白的功能是貯存鐵。激素誘導模式：真核生物內的調控信號來自體內激素，這些可擴散的物質稱反式作用因子。真核基因的順式調控元件是基因周圍能與特異轉錄因子結合而影響轉錄的DNA序列。根據底物蛋白質被磷酸化的氨基酸殘基的種類可分為三大類：

1、絲氨酸/蘇氨酸型。X染色體失活是發(fā)育過程中獨特的調節(jié)機制。最常見的哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子中的元件序列見下表。如果某個蛋白是體外轉錄系統(tǒng)中起始RNA合成所必需的，它就是轉錄復合物的一部分。第二類是發(fā)育調控或稱不可逆調控，是真核基因調控的精髓部分，它決定了真核細胞生長、分化、發(fā)育的全部進程。一旦發(fā)生X染色體失活，這個信息便能夠穩(wěn)定地傳遞給子代細胞，使該細胞有絲分裂所產生的后代都保持同一條X染色體失活。不同基因具有不同的上游啟動子元件，其位置也不相同，這使得不同的基因表達分別有不同的調控。轉錄和翻譯同時進行，大部分為轉錄水平調控。DNA與組蛋白結合成染色質，染色質的變化調控基因表達；組成型剪接：大多數前體mRNA都含有多個內含子，他們常被有序的逐一切除，形成一個由各外顯子連接而成的成熟mRNA，這種剪接方式稱~。目前對這種在基因轉錄降低或關閉中起作用的序列研究還不多。真核基因組DNA絕大部分都在細胞核內與組蛋白等結合成染色質。真核基因轉錄表達的調控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有兩種作用者，但總的是以激活蛋白的作用為主。即多數真核基因在沒有調控蛋白作用時是不轉錄的，需要表達時就要有激活的蛋白質來促進轉錄。因此，真核基因表達以正性調控為主導。雞輸卵管細胞的染色質中被DNA酶I優(yōu)先降解的是卵清蛋白基因，17三、真核基因轉錄水平的調控真核細胞的三種RNA聚合酶(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)中，只有RNA聚合酶Ⅱ能轉錄生成mRNA，以下主要討論RNA聚合酶Ⅱ的轉錄調控。(一)順式作用元件(cisactingelements)真核基因的順式調控元件是基因周圍能與特異轉錄因子結合而影響轉錄的DNA序列。其中主要是起正性調控作用的順式作用元件，包括啟動子(promoter)、增強子(enhancer)；近年又發(fā)現起負性調控作用的元件靜止子(silencer)三、真核基因轉錄水平的調控181.啟動子與原核啟動子的含義相同，是指RNA聚合酶結合并啟動轉錄的DNA序列。但真核啟動子間不像原核那樣有明顯共同一致的序列，而且單靠RNA聚合酶難以結合DNA而起動轉錄，而是需要多種蛋白質因子的相互協(xié)調作用。不同蛋白質因子又能與不同DNA序列相互作用；不同基因轉錄起始及其調控所需的蛋白因子也不完全相同，因而不同啟動子序列也很不相同，要比原核更復雜、序列也更長。

1.啟動子19真核啟動子一般包括轉錄起始點及其上游約100－200bp序列，包含有若干具有獨立功能的DNA序列元件，每個元件約長7－30bp。最常見的哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子中的元件序列見下表。真核啟動子一般包括轉錄起始點及其上游約100－200bp序列20元件名稱共同序列結合的蛋白因子名稱分子量結合DNA長度TATAboxTATAAAATBP30,000～10bpGCboxGGGCGGSP-1105,000～20bpCAATboxGGCCAATCTCTF/NF160,000～22bpOctamerATTTGCATOct-176,000～10bp

Oct-253,000～20bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000～10bpATFGTGACGTAFT?20bp哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子中的元件序列元件名稱共同序列結合的蛋白因子名稱分子量結合DNA長度TA21啟動子中的元件可以分為兩種：①核心啟動子元件(corepromoterelement)指RNA聚合酶起始轉錄所必需的最小的DNA序列，包括轉錄起始點及其上游－25/－30bp處的TATA盒。核心元件單獨起作用時只能確定轉錄起始位點和產生基礎水平的轉錄。啟動子中的元件可以分為兩種：22②上游啟動子元件(upstreampromoterelement)包括通常位于－70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距轉錄起始點更遠的上游元件。這些元件與相應的蛋白因子結合能提高或改變轉錄效率。不同基因具有不同的上游啟動子元件，其位置也不相同，這使得不同的基因表達分別有不同的調控。②上游啟動子元件(upstreampromoterele232.增強子

是一種能夠提高轉錄效率的順式調控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現的長約200bp的一段DNA，可使旁側的基因轉錄提高100倍。其后在多種真核生物，甚至在原核生物中都發(fā)現了增強子。增強子通常占100－200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構成，基本核心組件常為8－12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。2.增強子24V、C和J基因片段在胚胎細胞中相隔較遠。最早在酵母中發(fā)現，以后在T淋巴細胞的T抗原受體基因的轉錄和重排中證實這種負調控順式元件的存在。②上游啟動子元件(upstreampromoterelement)增強子可能有如下3種作用機制：真核生物（除酵母、藻類和原生動物等單細胞類之外）主要由多細胞組成，每個真核細胞所攜帶的基因數量及總基因組中蘊藏的遺傳信息量都大大高于原核生物。因為甲基化對轉錄的抑制強度與MeCPl（methylCpG-bindingproteinl）結合DNA的能力成正相關，甲基化CpG的密度和啟動子強度之間的平衡決定了該啟動子是否具有轉錄活性。調節(jié)機制：

①mRNA加尾過程：

卵細胞中mRNA僅具有20個核苷酸的多聚Ａ(polyA)尾端序列，在生物發(fā)育適宜時期，尾端序列加長至幾百個核苷酸序列，并翻譯成蛋白質。真核生物和原核生物由于基本生活方式不同所決定基因表達調控上的巨大差別。交替剪接（alternativesplicing)：來自同一個基因的前體mRNA中某個內含子5’端供點又可在特定條件下與另一個內含子的3’端受點進行剪接，從而刪除這兩個內含子及其中間的全部外顯子和內含子。轉錄和翻譯同時進行，大部分為轉錄水平調控?！盁羲⑿汀比旧w只有在兩棲類動物卵細胞發(fā)生減數分裂時才能被觀察到，它是染色體充分伸展時的一種形態(tài)。②增強子作用與其序列的正反方向無關，將增強子方向倒置依然能起作用。蛋白質的磷酸化反應是生物體內存在的一種普遍的調節(jié)方式，在細胞信號的傳遞過程中占有極其重要的地位。DNA堿基修飾變化：雞輸卵管細胞的染色質中被DNA酶I優(yōu)先降解的是卵清蛋白基因，而不是β-血紅蛋白基因。同一家族中的成員有時緊密地排列在一起，成為一個基因簇；但真核啟動子間不像原核那樣有明顯共同一致的序列，而且單靠RNA聚合酶難以結合DNA而起動轉錄，而是需要多種蛋白質因子的相互協(xié)調作用。轉錄和翻譯同時進行，大部分為轉錄水平調控。5-甲基胞嘧啶在DNA上并不是隨機分布的，基因的5‘端和3’端往往富含甲基化位點，而啟動區(qū)DNA分子上的甲基化密度與基因轉錄受抑制的程度密切相關。反式作用因子在轉錄調節(jié)中具有特殊的重要性。轉錄和翻譯同時進行，大部分為轉錄水平調控。增強子的作用有以下特點：①增強子提高同一條DNA鏈上基因轉錄效率，可以遠距離作用，通常可距離1－4kb、個別情況下離開所調控的基因30kb仍能發(fā)揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。②增強子作用與其序列的正反方向無關，將增強子方向倒置依然能起作用。而將啟動子倒就不能起作用，可見增強子與啟動子是很不相同的。V、C和J基因片段在胚胎細胞中相隔較遠。增強子的作用有以下特25③增強子要有啟動子才能發(fā)揮作用，沒有啟動子存在，增強子不能表現活性。但增強子對啟動子沒有嚴格的專一性，同一增強子可以影響不同類型啟動子的轉錄。例如當含有增強子的病毒基因組整合入宿主細胞基因組時，能夠增強整合區(qū)附近宿主某些基因的轉錄；當增強子隨某些染色體段落移位時，也能提高移到的新位置周圍基因的轉錄。使某些癌基因轉錄表達增強，可能是腫瘤發(fā)生的因素之一。③增強子要有啟動子才能發(fā)揮作用，沒有啟動子存在，增強子不能表26④增強子的作用機理雖然還不明確，但與其他順式調控元件一樣，必須與特定的蛋白質結合后才能發(fā)揮增強轉錄的作用。增強子一般具有組織或細胞特異性，許多增強子只在某些細胞或組織中表現活性，是由這些細胞或組織中具有的特異性蛋白質因子所決定的。④增強子的作用機理雖然還不明確，但與其他順式調控元件一樣，必27增強子可能有如下3種作用機制：①影響模板附近的DNA雙螺旋結構，導致DNA雙螺旋彎折或在反式因子的參與下，以蛋白質之間的相互作用為媒介形成增強子與啟動子之間“成環(huán)”連接，活化基因轉錄；增強子可能有如下3種作用機制：28②將模板固定在細胞核內特定位置，如連接在核基質上，有利于DNA拓撲異構酶改變DNA雙螺旋結構的張力，促進RNA聚合酶II在DNA鏈上的結合和滑動；③增強子區(qū)可以作為反式作用因子或RNA聚合酶II進入染色質結構的“入口”。②將模板固定在細胞核內特定位置，如連接在核基質上，有利于DN293.靜止子

最早在酵母中發(fā)現，以后在T淋巴細胞的T抗原受體基因的轉錄和重排中證實這種負調控順式元件的存在。靜止子的作用可不受序列方向的影響，也能遠距離發(fā)揮作用，并可對異源基因的表達起作用。目前對這種在基因轉錄降低或關閉中起作用的序列研究還不多。3.靜止子30第二節(jié)真核生物DNA水平上的基因表達調控第二節(jié)真核生物DNA水平上的基因表達調控31一、真核生物DNA水平上的基因表達調控特點

分子生物學的最新研究表明，在個體發(fā)育過程中，用來合成RNA的DNA模板也會發(fā)生規(guī)律性變化，從而控制基因表達和生物體的發(fā)育。

一、真核生物DNA水平上的基因表達調控特點32高度重復基因的形成通常與個體分化階段DNA的某些變化有關。例如，一個成熟的紅細胞能產生大量的可翻譯出成熟珠蛋白的mRNA，而其前體細胞卻不產生珠蛋白。許多情況下，這種變化是由于基因本身或它的拷貝數發(fā)生了永久性變化。

高度重復基因的形成通常與個體分化階段DNA的某些變化有關33

這種DNA水平的調控是真核生物發(fā)育調控的一種形式，它包括了基因丟失、擴增、重排和移位等方式，通過這些方式可以消除或變換某些基因并改變它們的活性。這些調控方式與轉錄及翻譯水平的調控是不同的，因為它使基因組發(fā)生了改變。這種DNA水平的調控是真核生物發(fā)育調控的一種形34二、“開放”型活性染色質（activechromatin）結構對轉錄的影響

真核基因的活躍轉錄是在常染色質上進行的。轉錄發(fā)生之前，染色質常常會在特定的區(qū)域被解旋松弛，形成自由DNA。這種變化可能包括核小體結構的消除或改變，DNA本身局部結構的變化等，這些變化可導致結構基因暴露，促進轉錄因子與啟動區(qū)DNA的結合，誘發(fā)基因轉錄。二、“開放”型活性染色質（activechromatin）35用DNA酶I處理各種組織的染色質時，發(fā)現處于活躍狀態(tài)的基因比非活躍狀態(tài)的DNA更容易被DNA酶I所降解。雞成紅細胞（erythroblast）染色質中，β-血紅蛋白基因比卵清蛋白基因更容易被DNA酶I切割降解。雞輸卵管細胞的染色質中被DNA酶I優(yōu)先降解的是卵清蛋白基因，而不是β-血紅蛋白基因。用DNA酶I處理各種組織的染色質時，發(fā)現處于活躍狀態(tài)的基因比36存在于“燈刷型”染色體（lampbrush）上的環(huán)形結構可能與基因的活性轉錄有關?！盁羲⑿汀比旧w只有在兩棲類動物卵細胞發(fā)生減數分裂時才能被觀察到，它是染色體充分伸展時的一種形態(tài)。高倍電鏡下觀察發(fā)現，燈刷型染色體上存在許多突起的“泡”狀或“環(huán)”狀結構，有時還能看到RNP沿著這些突起結構移動，表明這些DNA正在被RNA聚合酶所轉錄。存在于“燈刷型”染色體（lampbrush）上的環(huán)形結構可37第八章真核基因轉錄調控培訓課程課件38三、基因擴增

基因擴增是指某些基因的拷貝數專一性大量增加的現象，它使細胞在短期內產生大量的某個基因產物以滿足生長發(fā)育的需要，是基因活性調控的一種方式。三、基因擴增

基因擴增是指某些基因的拷貝數專一性大量增加的現39

兩棲類和昆蟲卵母細胞rRNA基因的擴增非洲爪蟾的染色體上有約450拷貝編碼18SrRNA和28SrRNA的DNA，在卵母細胞中它們的拷貝數擴大了1000倍。一旦卵母細胞成熟，多余的rDNA就沒有用了，將被逐漸降解。受精之后，染色體DNA開始復制，并通過有絲分裂的方式，不斷擴大細胞群體。在此期間，多余的rDNA繼續(xù)被降解，直到分裂產生幾百個細胞時，rDNA的過剩現象就不復存在了。第八章真核基因轉錄調控培訓課程課件40四、基因重排

將一個基因從遠離啟動子的地方移到距它很近的位點從而啟動轉錄，這種方式被稱為基因重排。真核生物最典型的例子是免疫球蛋白在成熟過程中的重排以及酵母的交配型轉變。四、基因重排

將一個基因從遠離啟動子的地方移到距它很近41V、C和J基因片段在胚胎細胞中相隔較遠。編碼產生免疫球蛋白的細胞發(fā)育分化時，通過染色體內DNA重組把4個相隔較遠的基因片段連接在一起，從而產生了具有表達活性的免疫球蛋白基因。V、C和J基因片段在胚胎細胞中相隔較遠。編碼產生免疫42五、DNA甲基化與基因活性的調控1、DNA的甲基化DNA甲基化是最早發(fā)現的修飾途徑之一，它可能存在于所有高等生物中并與基因表達調控密切相關。研究表明，DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。DNA甲基化能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達。CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化導致了人體1/3以上由于堿基轉換而引起的遺傳病。五、DNA甲基化與基因活性的調控1、DNA的甲基化43DNA甲基化修飾現象廣泛存在于多種有機體中。實驗證明，這個過程不但與DNA復制起始及錯誤修正時的定位有關，還通過改變基因的表達參與細胞的生長、發(fā)育過程及X染色體失活等的調控。DNA甲基化修飾現象廣泛存在于多種有機體中。44真核DNA中的胞嘧啶約有5%被甲基化為5-甲基胞嘧啶(5methylcytidine,m5C)，而活躍轉錄的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常較低。交替剪接類型2：不同3‘末端類型3：不同剪接方式組蛋白是堿性蛋白質，帶正電荷，可與DNA鏈上帶負電荷的磷酸基相結合，從而遮蔽了DNA分子，妨礙了轉錄，可能扮演了非特異性阻遏蛋白的作用；該區(qū)的具體功能不詳，但它的存在保證了轉錄的高效進行。存在于“燈刷型”染色體（lampbrush）上的環(huán)形結構可能與基因的活性轉錄有關。（1）具有一些與DNA結合的螺旋區(qū)轉錄和翻譯同時進行，大部分為轉錄水平調控。二、反式作用因子可以分為3類適應外界環(huán)境，操縱元調控表達。第五節(jié)基因轉錄后水平的調控其逆轉過程是由蛋白質磷酸酶催化的，稱為蛋白質脫磷酸化。分子生物學的最新研究表明，在個體發(fā)育過程中，用來合成RNA的DNA模板也會發(fā)生規(guī)律性變化，從而控制基因表達和生物體的發(fā)育。人類細胞單倍體基因組就包含有3×109bp總DNA，約為大腸桿菌總DNA的1000倍，是噬菌體總DNA的10萬倍左右！用DNA酶I處理各種組織的染色質時，發(fā)現處于活躍狀態(tài)的基因比非活躍狀態(tài)的DNA更容易被DNA酶I所降解。真核基因表達調控的最顯著特征是能在特定時間、特定的細胞中激活特定的基因，從而實現"預定"的、有序的、不可逆轉的分化、發(fā)育過程，并使生物的組織和器官在一定的環(huán)境條件范圍內保持正常功能。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出現在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中。③與特異調控序列結合的轉錄因子。轉錄和翻譯同時進行，大部分為轉錄水平調控。高倍電鏡下觀察發(fā)現，燈刷型染色體上存在許多突起的“泡”狀或“環(huán)”狀結構，有時還能看到RNP沿著這些突起結構移動，表明這些DNA正在被RNA聚合酶所轉錄。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鳥嘌呤（7-mG）。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出現在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中。因為高等生物CpG二核苷酸序列中的C通常是甲基化的，極易自發(fā)脫氨，生成胸腺嘧啶。由于這些CpG二核苷酸通常成串出現在DNA上，這段序列往往被稱為CpG島。真核DNA中的胞嘧啶約有5%被甲基化為5-甲基胞嘧啶(5m452、真核生物細胞內存在兩種甲基化酶活性：一種為日常型甲基轉移酶、另一種是從頭合成型甲基轉移酶日常型主要在甲基化母鏈（模板鏈）指導下使處于半甲基化的DNA雙鏈分子上與甲基胞嘧啶相對應的胞嘧啶甲基化。該酶催化特異性極強，對半甲基化的DNA有較高的親和力，使新生的半甲基化DNA迅速甲基化，從而保證DNA復制及細胞分裂后甲基化模式不變。從頭合成型甲基轉移酶催化未甲基化的CpG成為mCpG，它不需要母鏈指導，但速度很慢。2、真核生物細胞內存在兩種甲基化酶活性：46第八章真核基因轉錄調控培訓課程課件473、DNA甲基化抑制基因轉錄的機理DNA甲基化導致某些區(qū)域DNA構象變化，從而影響了蛋白質與DNA的相互作用，抑制了轉錄因子與啟動區(qū)DNA的結合效率。當組蛋白H1與含CCGG序列的甲基化或非甲基化DNA分別形成復合體時，DNA的構型存在著很大的差別，甲基化達到一定程度時會發(fā)生從常規(guī)的B-DNA向Z-DNA的過渡。由于Z-DNA結構收縮，螺旋加深，使許多蛋白質因子賴以結合的元件縮入大溝而不利于基因轉錄的起始。3、DNA甲基化抑制基因轉錄的機理DNA甲基化導致某些區(qū)域D48有實驗用序列相同但甲基化水平不同的DNA為材料，比較其作為RNA聚合酶轉錄模板的活性，發(fā)現甲基的引入不利于模板與RNA聚合酶的結合，降低了其體外轉錄活性。有實驗用序列相同但甲基化水平不同的DNA為材料，比較其作為R49

5-甲基胞嘧啶在DNA上并不是隨機分布的，基因的5‘端和3’端往往富含甲基化位點，而啟動區(qū)DNA分子上的甲基化密度與基因轉錄受抑制的程度密切相關。

5-甲基胞嘧啶在DNA上并不是隨機分布的，基50對于弱啟動子來說，稀少的甲基化就能使其完全失去轉錄活性。當這一類啟動子被增強時（帶有增強子），即使不去甲基化也可以恢復其轉錄活性。若進一步提高甲基化密度，即使增強后的啟動子仍無轉錄活性。因為甲基化對轉錄的抑制強度與MeCPl（methylCpG-bindingproteinl）結合DNA的能力成正相關，甲基化CpG的密度和啟動子強度之間的平衡決定了該啟動子是否具有轉錄活性。對于弱啟動子來說，稀少的甲基化就能使其完全失去轉514、DNA甲基化與X染色體失活

X染色體失活是發(fā)育過程中獨特的調節(jié)機制。雌性胎生哺乳類動物細胞中兩條X染色體之一在發(fā)育早期隨機失活，以確保與只有一條X染色體的雄性個體內X染色體基因的劑量相同。一旦發(fā)生X染色體失活，這個信息便能夠穩(wěn)定地傳遞給子代細胞，使該細胞有絲分裂所產生的后代都保持同一條X染色體失活。4、DNA甲基化與X染色體失活

X染色體失活是發(fā)育過程中獨特52第三節(jié)反式作用因子

(transactingfactors)

第三節(jié)反式作用因子

(transactingfacto53一、反式作用因子(transactingfactors)由不同染色體上基因座位編碼的、能直接或間接地識別或結合在各順式作用元件8－12bp核心序列上并參與調控靶基因轉錄效率的這些結合蛋白，稱作反式作用因子(transactingfactor)。一、反式作用因子(transactingfactors)54反式作用因子在轉錄調節(jié)中具有特殊的重要性。這類DNA結合蛋白有多種，能特異性識別這類蛋白的序列也有多種。正是不同的DNA結合蛋白與不同識別序列之間在空間結構上的相互作用，以及蛋白質與蛋白質之間的相互作用，構成了復雜的基因轉錄調控機制的基礎。反式作用因子在轉錄調節(jié)中具有特殊的重要性。這類DNA結合蛋白55

真核生物啟動子和增強子是由若干DNA序列元件組成的，由于它們常與特定的功能基因連鎖在一起，因此被稱為順式作用元件。這些序列組成基因轉錄的調控區(qū)，影響基因的表達。

反式作用因子是能直接或間接地識別或結合在各類順式作用元件核心序列上，參與調控靶基因轉錄效率的蛋白質。真核生物啟動子和增強子是由若干DNA序列元件組成的，由于56如果某個蛋白是體外轉錄系統(tǒng)中起始RNA合成所必需的，它就是轉錄復合物的一部分。根據各個蛋白成分在轉錄中的作用，將整個復合物分為3部分：①參與所有或某些轉錄階段的RNA聚合酶亞基，不具有基因特異性。如果某個蛋白是體外轉錄系統(tǒng)中起始RNA合成所必需的，它就是轉57因為甲基化對轉錄的抑制強度與MeCPl（methylCpG-bindingproteinl）結合DNA的能力成正相關，甲基化CpG的密度和啟動子強度之間的平衡決定了該啟動子是否具有轉錄活性。這些元件與相應的蛋白因子結合能提高或改變轉錄效率。一旦卵母細胞成熟，多余的rDNA就沒有用了，將被逐漸降解。蛋白質的磷酸化反應是生物體內存在的一種普遍的調節(jié)方式，在細胞信號的傳遞過程中占有極其重要的地位。鐵蛋白的mRNA翻譯取決于鐵的供應。高倍電鏡下觀察發(fā)現，燈刷型染色體上存在許多突起的“泡”狀或“環(huán)”狀結構，有時還能看到RNP沿著這些突起結構移動，表明這些DNA正在被RNA聚合酶所轉錄。從頭合成型甲基轉移酶催化未甲基化的CpG成為mCpG，它不需要母鏈指導，但速度很慢。真核生物和原核生物由于基本生活方式不同所決定基因表達調控上的巨大差別。②與轉錄的起始或終止有關的輔助因子，不具有基因特異性。②與轉錄的起始或終止有關的輔助因子，不具有基因特異性?；蚪M小，大腸桿菌：總長4.調節(jié)機制：

①mRNA加尾過程：

卵細胞中mRNA僅具有20個核苷酸的多聚Ａ(polyA)尾端序列，在生物發(fā)育適宜時期，尾端序列加長至幾百個核苷酸序列，并翻譯成蛋白質。真核基因組DNA絕大部分都在細胞核內與組蛋白等結合成染色質。轉錄和翻譯同時進行，大部分為轉錄水平調控。這樣，一個前體mRNA就可因剪接方式不同產生多種mRNA，轉譯出多個不同蛋白質.第二節(jié)真核生物DNA水平上的基因表達調控雞輸卵管細胞的染色質中被DNA酶I優(yōu)先降解的是卵清蛋白基因，而不是β-血紅蛋白基因。翻譯多肽過程的調控：一、蛋白質磷酸化、信號轉導及基因表達轉錄發(fā)生之前，染色質常常會在特定的區(qū)域被解旋松弛，形成自由DNA。轉錄和翻譯同時進行，大部分為轉錄水平調控。②與轉錄的起始或終止有關的輔助因子，不具有基因特異性。③與特異調控序列結合的轉錄因子。它們中有些被認為是轉錄復合物的一部分，因為所有或大部分基因的啟動區(qū)都含有這一特異序列。更多的則是基因或啟動子特異性結合調控蛋白，它們是起始某個（類）基因轉錄所必需的。因為甲基化對轉錄的抑制強度與MeCPl（methylCpG58二、反式作用因子可以分為3類

(1)

通用反式作用因子，主要識別啟動子的核心啟動成分（2）特殊組織與細胞中的反式作用因子（3）和反應性元件（responseelenents）相結合的反式作用因子。如HSE（熱休克反應元件，heatshockresponseelement），GRE（糖皮質激素反應元件glucocorticoidresponseelement）；MRE（金屬反應元件，metalresponseelement）；TRE（腫瘤誘導劑反應元件，tumorgenicagentresponseelement);二、反式作用因子可以分為3類(1)

通用反式作用因子，59三、DNA結合蛋白的共同特性：（1）具有一些與DNA結合的螺旋區(qū)（2）能形成二聚體（3）有一個共同的基本序列三、DNA結合蛋白的共同特性：（1）具有一些與DNA60DNA結合蛋白基本序列由40—50個氨基酸組成，含有2個兩親的(既有極性基也有非極性基)螺旋，由2個長度不等的連接區(qū)(環(huán))相連。通過兩條螺旋對應位置上的疏水性氨基酸殘基之間的相互作用，可以生成同源二聚體或異源二聚體。每個螺旋區(qū)長15一16個氨基酸，其中有幾個氨基酸殘基是保守的。兩個螺旋區(qū)之間的環(huán)使兩個螺旋區(qū)可以彼此獨立地相互作用。DNA結合蛋白基本序列由40—50個氨基酸組成，含有2個兩親61DNA結合蛋白DNA結合蛋白62第四節(jié)真核基因轉錄調控的主要模式第四節(jié)真核基因轉錄調控的主要模式63一、蛋白質磷酸化、信號轉導及基因表達

蛋白質的磷酸化是指由蛋白質激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基轉移到底物蛋白質氨基酸殘基上的過程，其逆轉過程是由蛋白質磷酸酶催化的，稱為蛋白質脫磷酸化。

一、蛋白質磷酸化、信號轉導及基因表達

蛋白質的磷酸化64蛋白質的磷酸化蛋白質的磷酸化反應是生物體內存在的一種普遍的調節(jié)方式，在細胞信號的傳遞過程中占有極其重要的地位。已經發(fā)現在人體內有多達2000個左右的蛋白質激酶和1000個左右的蛋白質磷酸酶基因。蛋白質的磷酸化蛋白質的磷酸化反應是生物體內存在的一種65蛋白質的磷酸化與去磷酸化過程是生物體內普遍存在的信息傳導調節(jié)方式，幾乎涉及所有的生理及病理過程，如糖代謝、光合作用、細胞的生長發(fā)育、神經遞質的合成與釋放甚至癌變等等。蛋白質的磷酸化與去磷酸化過程是生物體內普遍存在的信息傳導調節(jié)66蛋白激酶的種類根據底物蛋白質被磷酸化的氨基酸殘基的種類可分為三大類：

1、絲氨酸/蘇氨酸型。這類蛋白激酶使底物蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化。2、酪氨酸型。被磷酸化的是底物的酪氨酸殘基。

蛋白激酶的種類根據底物蛋白質被磷酸化的氨基酸殘基的種類可分為673、是“雙重底物特異性蛋白激酶（dual-specificityproteinkinase），既可使絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化又可使酪氨酸殘基磷酸化。細胞受刺激以后，通過蛋白質磷酸化及一系列級聯放大過程將胞外信號轉化為細胞內信號，從而引起廣泛的生理反應。3、是“雙重底物特異性蛋白激酶（dual-specifici68增強子一般具有組織或細胞特異性，許多增強子只在某些細胞或組織中表現活性，是由這些細胞或組織中具有的特異性蛋白質因子所決定的。每個螺旋區(qū)長15一16個氨基酸，其中有幾個氨基酸殘基是保守的。是一種能夠提高轉錄效率的順式調控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現的長約200bp的一段DNA，可使旁側的基因轉錄提高100倍。真核DNA中的胞嘧啶約有5%被甲基化為5-甲基胞嘧啶(5methylcytidine,m5C)，而活躍轉錄的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常較低。類型3：不同剪接方式實驗表明這段序列甲基化可使其后的基因不能轉錄，甲基化可能阻礙轉錄因子與DNA特定部位的結合從而影響轉錄。定義：轉錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基插入，缺失或轉換的現象。DNA甲基化導致某些區(qū)域DNA構象變化，從而影響了蛋白質與DNA的相互作用，抑制了轉錄因子與啟動區(qū)DNA的結合效率。組成型剪接：大多數前體mRNA都含有多個內含子，他們常被有序的逐一切除，形成一個由各外顯子連接而成的成熟mRNA，這種剪接方式稱~。調節(jié)機制：

①mRNA加尾過程：

卵細胞中mRNA僅具有20個核苷酸的多聚Ａ(polyA)尾端序列，在生物發(fā)育適宜時期，尾端序列加長至幾百個核苷酸序列，并翻譯成蛋白質。MRE（金屬反應元件，metalresponseelement）；意義：人類細胞單倍體基因組就包含有3×109bp總DNA，約為大腸桿菌總DNA的1000倍，是噬菌體總DNA的10萬倍左右！基因擴增是指某些基因的拷貝數專一性大量增加的現象，它使細胞在短期內產生大量的某個基因產物以滿足生長發(fā)育的需要，是基因活性調控的一種方式。(一)順式作用元件(cisactingelements)定義：轉錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基插入，缺失或轉換的現象。糾正某些移碼突變；5-甲基胞嘧啶在DNA上并不是隨機分布的，基因的5‘端和3’端往往富含甲基化位點，而啟動區(qū)DNA分子上的甲基化密度與基因轉錄受抑制的程度密切相關。組成型剪接、交替剪接；二、激素的調控作用：激素誘導模式：真核生物內的調控信號來自體內激素，這些可擴散的物質稱反式作用因子。許多類固醇激素（如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮質激素和雄激素）以及一般代謝性激素（如胰島素）的調控作用都是通過啟始基因轉錄而實現的。增強子一般具有組織或細胞特異性，許多增強子只在某些細胞或組織69

三、作用機制：

靶細胞具有專一的細胞質受體，可與激素形成復合物，導致三維結構甚至化學性質的變化。經修飾的受體與激素復合物通過核膜進入細胞核內，并與染色質的特定區(qū)域相結合，導致基因轉錄的起始或關閉。研究發(fā)現，體內存在的許多糖皮質類激素應答基因都有一段大約20bp的順式作用元件（激素應答元件），該序列具有類似增強子的作用，其活性受激素制約。

三、作用機制：70靶細胞中含有大量激素受體蛋白，而非靶細胞中沒有或很少有這類受體，這是激素調節(jié)轉錄組織特異性的根本原因。所有固醇類激素的受體蛋白分子都有相同的結構框架，包括保守性極高的、位于分子中央的DNA結合區(qū)，位于C端的有較強同源性的激素結合區(qū)和保守性較小的N端。該區(qū)的具體功能不詳，但它的存在保證了轉錄的高效進行。靶細胞中含有大量激素受體蛋白，而非靶細胞中沒有或很少有這類受71研究還發(fā)現，如果糖皮質激素受體蛋白激素結合區(qū)的某個部分丟失，就變成一種永久型的活性分子，即無需激素誘導也有激活基因轉錄的作用。研究還發(fā)現，如果糖皮質激素受體蛋白激素結合區(qū)的某個部分丟失，72第五節(jié)基因轉錄后水平的調控第五節(jié)基因轉錄后水平的調控73一、不同剪接方式可產生不同的mRNA：

組成型剪接、交替剪接；組成型剪接：大多數前體mRNA都含有多個內含子，他們常被有序的逐一切除，形成一個由各外顯子連接而成的成熟mRNA，這種剪接方式稱~。一、不同剪接方式可產生不同的mRNA：74交替剪接（alternativesplicing)：來自同一個基因的前體mRNA中某個內含子5’端供點又可在特定條件下與另一個內含子的3’端受點進行剪接，從而刪除這兩個內含子及其中間的全部外顯子和內含子。這樣，一個前體mRNA就可因剪接方式不同產生多種mRNA，轉譯出多個不同蛋白質.剪接方式有3類類型1：不同5‘末端交替剪接類型2：不同3‘末端類型3：不同剪接方式交替剪接（alternativesplicing)：來自同75二、RNA編輯：定義：轉錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基插入，缺失或轉換的現象。意義：糾正某些移碼突變；構建或刪除起始密碼子、終止密碼子；增減核苷酸擴充遺傳信息。二、RNA編輯：76三、基因翻譯水平的調控1.翻譯多肽過程的調控：

真核生物的許多組織或細胞中，經轉錄mRNA受抑制不能翻譯成多肽，以失活的狀態(tài)貯存。如植物種子在發(fā)芽的早期階段，雖沒有mRNA的合成，但有蛋白質的合成。海膽卵內mRNA在受精前不能進行翻譯，受精后的蛋白質合成速率猛增。三、基因翻譯水平的調控77調節(jié)機制：

①mRNA加尾過程：

卵細胞中mRNA僅具有20個核苷酸的多聚Ａ(polyA)尾端序列，在生物發(fā)育適宜時期，尾端序列加長至幾百個核苷酸序列，并翻譯成蛋白質。

調節(jié)機制：

①mRNA加尾過程：

卵細胞中mRNA僅具有78②阻遏蛋白特異結合：

如鐵蛋白的翻譯調控，鐵蛋白的功能是貯存鐵。鐵蛋白的mRNA翻譯取決于鐵的供應。當細胞沒有鐵時，阻遏蛋白與鐵蛋白mRNA啟動子區(qū)域鐵反應元結合，阻止翻譯進行；當有鐵存在時，阻遏物不再與IRE結合，翻譯順利進行。②阻遏蛋白特異結合：

如鐵蛋白的翻譯調控，鐵蛋白的功能是貯79四、蛋白質加工過程的調控：⑴蛋白質的折疊：

蛋白質在一定的條件下，才能折疊成一定的空間構型并具有生物學功能。四、蛋白質加工過程的調控：80⑵蛋白酶的切割：①末端切割：有些分泌蛋白對細胞有毒害作用，常以無活性的前體蛋白形式貯存于細胞內，需要這種蛋白時，由蛋白酶切割加工成有功能的蛋白。如，蜜蜂在叮咬動物時注入蜜毒素，引起細胞溶解，蜜毒素也能使蜜蜂自身的細胞溶解。翻譯后以前體形式儲存于細胞內，能被細胞間隙的一種蛋白酶識別和切割，釋放出有活性的蜜毒素。⑵蛋白酶的切割：81

例如，脊椎動物的胰島素加工過程：

最初前胰島素原有105個氨基酸，加工中先將N端的24個氨基酸殘基切除，形成前體胰島素，然后切除中間一段氨基酸序列，留下21個氨基酸殘基的Ａ鏈和30個氨基酸殘基的B鏈，由二硫鍵連接兩條肽鏈。

例如，脊椎動物的胰島素加工過程：

最初前胰島素原有82第八章真核基因轉錄調控培訓課程課件83第八章真核基因轉錄調控第八章真核基因轉錄調控84優(yōu)選第八章真核基因轉錄調控優(yōu)選第八章真核基因轉錄調控85真核生物和原核生物由于基本生活方式不同所決定基因表達調控上的巨大差別。原核生物的調控系統(tǒng)就是要在一個特定的環(huán)境中為細胞創(chuàng)造高速生長的條件，或使細胞在受到損傷時，盡快得到修復，所以，原核生物基因表達的開關經常是通過控制轉錄的起始來調節(jié)的。

真核生物和原核生物由于基本生活方式不同所決定基因表達調控上的86真核生物（除酵母、藻類和原生動物等單細胞類之外）主要由多細胞組成，每個真核細胞所攜帶的基因數量及總基因組中蘊藏的遺傳信息量都大大高于原核生物。人類細胞單倍體基因組就包含有3×109bp總DNA，約為大腸桿菌總DNA的1000倍，是噬菌體總DNA的10萬倍左右！真核生物（除酵母、藻類和原生動物等單細胞類之外）主要由多細胞87真核基因表達調控的最顯著特征是能在特定時間、特定的細胞中激活特定的基因，從而實現"預定"的、有序的、不可逆轉的分化、發(fā)育過程，并使生物的組織和器官在一定的環(huán)境條件范圍內保持正常功能。真核基因表達調控的最顯著特征是能在特定時間、特定的細胞中激活88真核生物基因調控，根據其性質可分為兩大類：

第一類是瞬時調控或稱可逆性調控，它相當于原核細胞對環(huán)境條件變化所做出的反應，包括某種底物或激素水平升降及細胞周期不同階段中酶活性和濃度的調節(jié)。

真核生物基因調控，根據其性質可分為兩大類：

第一類是89第二類是發(fā)育調控或稱不可逆調控，是真核基因調控的精髓部分，它決定了真核細胞生長、分化、發(fā)育的全部進程。第二類是發(fā)育調控或稱不可逆調控，是真核基因調控的精髓90原核生物真核生物

操縱元調控。

多樣化調控，更為復雜。

基因組小，大腸桿菌：總長4.6×106bp,編碼4288個基因,每個基因約1100bp。

基因組大，人類基因組全長3×109bp，編碼10萬個基因，其余為重復序列。

基因分布在同一染色體上，操縱元控制。

DNA與組蛋白結合成染色質，染色質的變化調控基因表達；基因分布在不同的染色體上，存在不同染色體間基因的調控問題。

適應外界環(huán)境，操縱元調控表達。

基因差別表達是細胞分化和功能的核心。

轉錄和翻譯同時進行，大部分為轉錄水平調控。

轉錄和翻譯在時間和空間上均不同，從DNA到蛋白質的各層次上都有調控，但多數為轉錄水平調控真核生物與原核生物的調控差異原核生物真核生物操縱元調控。多樣化調控，更為復雜。91一、真核基因表達調控的特點(一)真核基因表達調控的環(huán)節(jié)更多基因表達是基因經過轉錄、翻譯、產生有生物活性的蛋白質的整個過程。同原核生物一樣，轉錄依然是真核生物基因表達調控的主要環(huán)節(jié)。但真核基因轉錄發(fā)生在細胞核(線粒體基因的轉錄在線粒體內)，翻譯則多在胞漿，兩個過程是分開的，因此其調控增加了更多的環(huán)節(jié)和復雜性，轉錄后的調控占有了更多的分量。

一、真核基因表達調控的特點92第八章真核基因轉錄調控培訓課程課件93但真核啟動子間不像原核那樣有明顯共同一致的序列，而且單靠RNA聚合酶難以結合DNA而起動轉錄，而是需要多種蛋白質因子的相互協(xié)調作用?；虿顒e表達是細胞分化和功能的核心。第三節(jié)反式作用因子

(transactingfactors)這類蛋白激酶使底物蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化。適應外界環(huán)境，操縱元調控表達。類型3：不同剪接方式雞輸卵管細胞的染色質中被DNA酶I優(yōu)先降解的是卵清蛋白基因，而不是β-血紅蛋白基因。這樣，一個前體mRNA就可因剪接方式不同產生多種mRNA，轉譯出多個不同蛋白質.適應外界環(huán)境，操縱元調控表達。有實驗用序列相同但甲基化水平不同的DNA為材料，比較其作為RNA聚合酶轉錄模板的活性，發(fā)現甲基的引入不利于模板與RNA聚合酶的結合，降低了其體外轉錄活性。糾正某些移碼突變；②將模板固定在細胞核內特定位置，如連接在核基質上，有利于DNA拓撲異構酶改變DNA雙螺旋結構的張力，促進RNA聚合酶II在DNA鏈上的結合和滑動；人類細胞單倍體基因組就包含有3×109bp總DNA，約為大腸桿菌總DNA的1000倍，是噬菌體總DNA的10萬倍左右！活躍進行轉錄的染色質區(qū)域受DNaseⅠ消化常出現100－200bp的DNA片段，且長短不均一，說明其DNA受組蛋白掩蓋的結構有變化，出現了對DNaseⅠ高敏感點(hypersensitivesite)。真核DNA中的胞嘧啶約有5%被甲基化為5-甲基胞嘧啶(5methylcytidine,m5C)，而活躍轉錄的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常較低。這類蛋白激酶使底物蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化。(二)真核基因的轉錄與染色質的結構變化相關。真核基因組DNA絕大部分都在細胞核內與組蛋白等結合成染色質。染色質的結構、染色質中DNA和組蛋白的結合狀態(tài)都影響轉錄，有以下特點：1.染色質結構影響基因轉錄染色體結構復雜由DNA、組蛋白、非組蛋白等大分子組成；DNA序列重復；基因不連續(xù)性，真核生物基因的不連續(xù)性和轉錄后加工是真核基因有別于原核基因的重要特征。但真核啟動子間不像原核那樣有明顯共同一致的序列，而且單靠RN942、存在許多基因家族(genefamily)

來源相同、結構相似、功能相關的基因組成單一的基因簇或稱基因家族。同一家族中的成員有時緊密地排列在一起，成為一個基因簇；更多的時候，它們卻分散在同一染色體的不同部位，甚至位于不同的染色體上，具有各自不同的表達調控模式。2、存在許多基因家族(genefamily)

來源相同、結953、組蛋白的作用：組蛋白與DNA結合阻止DNA上基因的轉錄，去除組蛋白基因又能夠轉錄。組蛋白是堿性蛋白質，帶正電荷，可與DNA鏈上帶負電荷的磷酸基相結合，從而遮蔽了DNA分子，妨礙了轉錄，可能扮演了非特異性阻遏蛋白的作用；染色質中的非組蛋白成分具有組織細胞特異性，可能消除組蛋白的阻遏，起到特異性的去阻遏促轉錄作用。

3、組蛋白的作用：組蛋白與DNA結合阻止DNA上基因的轉錄，964.轉錄活躍的區(qū)域也常缺乏核小體的結構。這表明核小體結構影響基因轉錄。

5.轉錄活躍區(qū)域對核酸酶作用敏感度增加。

活躍進行轉錄的染色質區(qū)域受DNaseⅠ消化常出現100－200bp的DNA片段，且長短不均一，說明其DNA受組蛋白掩蓋的結構有變化，出現了對DNaseⅠ高敏感點(hypersensitivesite)。這種高敏感點常出現在轉錄基因的5′側區(qū)、3′末端或在基因上，多在調控蛋白結合位點的附近，分析該區(qū)域核小體的結構發(fā)生變化，可能有利于調控蛋白結合而促進轉錄。4.轉錄活躍的區(qū)域也常缺乏核小體的結構。976.DNA堿基修飾變化：真核DNA中的胞嘧啶約有5%被甲基化為5-甲基胞嘧啶(5methylcytidine,m5C)，而活躍轉錄的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常較低。這種甲基化最常發(fā)生在某些基因5′側區(qū)的CG序列中實驗表明這段序列甲基化可使其后的基因不能轉錄，甲基化可能阻礙轉錄因子與DNA特定部位的結合從而影響轉錄。如果用基因打靶的方法除去主要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常發(fā)育而死亡，可見DNA的甲基化對基因表達調控是重要的。由此可見，染色質中的基因轉錄前先要有一個被激活的過程，但目前對激活機制還缺乏認識。6.DNA堿基修飾變化：98(三)真核基因表達以正性調控為主真核RNA聚合酶對啟動子的親和力很低，基本上不依靠自身來起始轉錄，需要依賴多種激活蛋白的協(xié)同作用。真核基因調控中雖然也發(fā)現有負性調控元件，但其存在并不普遍；(三)真核基因表達以正性調控為主99雞輸卵管細胞的染色質中被DNA酶I優(yōu)先降解的是卵清蛋白基因，而不是β-血紅蛋白基因。交替剪接（alternativesplicing)：來自同一個基因的前體mRNA中某個內含子5’端供點又可在特定條件下與另一個內含子的3’端受點進行剪接，從而刪除這兩個內含子及其中間的全部外顯子和內含子。更多的時候，它們卻分散在同一染色體的不同部位，甚至位于不同的染色體上，具有各自不同的表達調控模式。每個螺旋區(qū)長15一16個氨基酸，其中有幾個氨基酸殘基是保守的。②阻遏蛋白特異結合：

如鐵蛋白的翻譯調控，鐵蛋白的功能是貯存鐵。激素誘導模式：真核生物內的調控信號來自體內激素，這些可擴散的物質稱反式作用因子。真核基因的順式調控元件是基因周圍能與特異轉錄因子結合而影響轉錄的DNA序列。根據底物蛋白質被磷酸化的氨基酸殘基的種類可分為三大類：

1、絲氨酸/蘇氨酸型。X染色體失活是發(fā)育過程中獨特的調節(jié)機制。最常見的哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子中的元件序列見下表。如果某個蛋白是體外轉錄系統(tǒng)中起始RNA合成所必需的，它就是轉錄復合物的一部分。第二類是發(fā)育調控或稱不可逆調控，是真核基因調控的精髓部分，它決定了真核細胞生長、分化、發(fā)育的全部進程。一旦發(fā)生X染色體失活，這個信息便能夠穩(wěn)定地傳遞給子代細胞，使該細胞有絲分裂所產生的后代都保持同一條X染色體失活。不同基因具有不同的上游啟動子元件，其位置也不相同，這使得不同的基因表達分別有不同的調控。轉錄和翻譯同時進行，大部分為轉錄水平調控。DNA與組蛋白結合成染色質，染色質的變化調控基因表達；組成型剪接：大多數前體mRNA都含有多個內含子，他們常被有序的逐一切除，形成一個由各外顯子連接而成的成熟mRNA，這種剪接方式稱~。目前對這種在基因轉錄降低或關閉中起作用的序列研究還不多。真核基因組DNA絕大部分都在細胞核內與組蛋白等結合成染色質。真核基因轉錄表達的調控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有兩種作用者，但總的是以激活蛋白的作用為主。即多數真核基因在沒有調控蛋白作用時是不轉錄的，需要表達時就要有激活的蛋白質來促進轉錄。因此，真核基因表達以正性調控為主導。雞輸卵管細胞的染色質中被DNA酶I優(yōu)先降解的是卵清蛋白基因，100三、真核基因轉錄水平的調控真核細胞的三種RNA聚合酶(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)中，只有RNA聚合酶Ⅱ能轉錄生成mRNA，以下主要討論RNA聚合酶Ⅱ的轉錄調控。(一)順式作用元件(cisactingelements)真核基因的順式調控元件是基因周圍能與特異轉錄因子結合而影響轉錄的DNA序列。其中主要是起正性調控作用的順式作用元件，包括啟動子(promoter)、增強子(enhancer)；近年又發(fā)現起負性調控作用的元件靜止子(silencer)三、真核基因轉錄水平的調控1011.啟動子與原核啟動子的含義相同，是指RNA聚合酶結合并啟動轉錄的DNA序列。但真核啟動子間不像原核那樣有明顯共同一致的序列，而且單靠RNA聚合酶難以結合DNA而起動轉錄，而是需要多種蛋白質因子的相互協(xié)調作用。不同蛋白質因子又能與不同DNA序列相互作用；不同基因轉錄起始及其調控所需的蛋白因子也不完全相同，因而不同啟動子序列也很不相同，要比原核更復雜、序列也更長。

1.啟動子102真核啟動子一般包括轉錄起始點及其上游約100－200bp序列，包含有若干具有獨立功能的DNA序列元件，每個元件約長7－30bp。最常見的哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子中的元件序列見下表。真核啟動子一般包括轉錄起始點及其上游約100－200bp序列103元件名稱共同序列結合的蛋白因子名稱分子量結合DNA長度TATAboxTATAAAATBP30,000～10bpGCboxGGGCGGSP-1105,000～20bpCAATboxGGCCAATCTCTF/NF160,000～22bpOctamerATTTGCATOct-176,000～10bp

Oct-253,000～20bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000～10bpATFGTGACGTAFT?20bp哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子中的元件序列元件名稱共同序列結合的蛋白因子名稱分子量結合DNA長度TA104啟動子中的元件可以分為兩種：①核心啟動子元件(corepromoterelement)指RNA聚合酶起始轉錄所必需的最小的DNA序列，包括轉錄起始點及其上游－25/－30bp處的TATA盒。核心元件單獨起作用時只能確定轉錄起始位點和產生基礎水平的轉錄。啟動子中的元件可以分為兩種：105②上游啟動子元件(upstreampromoterelement)包括通常位于－70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距轉錄起始點更遠的上游元件。這些元件與相應的蛋白因子結合能提高或改變轉錄效率。不同基因具有不同的上游啟動子元件，其位置也不相同，這使得不同的基因表達分別有不同的調控。②上游啟動子元件(upstreampromoterele1062.增強子

是一種能夠提高轉錄效率的順式調控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現的長約200bp的一段DNA，可使旁側的基因轉錄提高100倍。其后在多種真核生物，甚至在原核生物中都發(fā)現了增強子。增強子通常占100－200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構成，基本核心組件常為8－12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。2.增強子107V、C和J基因片段在胚胎細胞中相隔較遠。最早在酵母中發(fā)現，以后在T淋巴細胞的T抗原受體基因的轉錄和重排中證實這種負調控順式元件的存在。②上游啟動子元件(upstreampromoterelement)增強子可能有如下3種作用機制：真核生物（除酵母、藻類和原生動物等單細胞類之外）主要由多細胞組成，每個真核細胞所攜帶的基因數量及總基因組中蘊藏的遺傳信息量都大大高于原核生物。因為甲基化對轉錄的抑制強度與MeCPl（methylCpG-bindingproteinl）結合DNA的能力成正相關，甲基化CpG的密度和啟動子強度之間的平衡決定了該啟動子是否具有轉錄活性。調節(jié)機制：

①mRNA加尾過程：

卵細胞中mRNA僅具有20個核苷酸的多聚Ａ(polyA)尾端序列，在生物發(fā)育適宜時期，尾端序列加長至幾百個核苷酸序列，并翻譯成蛋白質。真核生物和原核生物由于基本生活方式不同所決定基因表達調控上的巨大差別。交替剪接（alternativesplicing)：來自同一個基因的前體mRNA中某個內含子5’端供點又可在特定條件下與另一個內含子的3’端受點進行剪接，從而刪除這兩個內含子及其中間的全部外顯子和內含子。轉錄和翻譯同時進行，大部分為轉錄水平調控?！盁羲⑿汀比旧w只有在兩棲類動物卵細胞發(fā)生減數分裂時才能被觀察到，它是染色體充分伸展時的一種形態(tài)。②增強子作用與其序列的正反方向無關，將增強子方向倒置依然能起作用。蛋白質的磷酸化反應是生物體內存在的一種普遍的調節(jié)方式，在細胞信號的傳遞過程中占有極其重要的地位。DNA堿基修飾變化：雞輸卵管細胞的染色質中被DNA酶I優(yōu)先降解的是卵清蛋白基因，而不是β-血紅蛋白基因。同一家族中的成員有時緊密地排列在一起，成為一個基因簇；但真核啟動子間不像原核那樣有明顯共同一致的序列，而且單靠RNA聚合酶難以結合DNA而起動轉錄，而是需要多種蛋白質因子的相互協(xié)調作用。轉錄和翻譯同時進行，大部分為轉錄水平調控。5-甲基胞嘧啶在DNA上并不是隨機分布的，基因的5‘端和3’端往往富含甲基化位點，而啟動區(qū)DNA分子上的甲基化密度與基因轉錄受抑制的程度密切相關。反式作用因子在轉錄調節(jié)中具有特殊的重要性。轉錄和翻譯同時進行，大部分為轉錄水平調控。增強子的作用有以下特點：①增強子提高同一條DNA鏈上基因轉錄效率，可以遠距離作用，通?？删嚯x1－4kb、個別情況下離開所調控的基因30kb仍能發(fā)揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。②增強子作用與其序列的正反方向無關，將增強子方向倒置依然能起作用。而將啟動子倒就不能起作用，可見增強子與啟動子是很不相同的。V、C和J基因片段在胚胎細胞中相隔較遠。增強子的作用有以下特108③增強子要有啟動子才能發(fā)揮作用，沒有啟動子存在，增強子不能表現活性。但增強子對啟動子沒有嚴格的專一性，同一增強子可以影響不同類型啟動子的轉錄。例如當含有增強子的病毒基因組整合入宿主細胞基因組時，能夠增強整合區(qū)附近宿主某些基因的轉錄；當增強子隨某些染色體段落移位時，也能提高移到的新位置周圍基因的轉錄。使某些癌基因轉錄表達增強，可能是腫瘤發(fā)生的因素之一。③增強子要有啟動子才能發(fā)揮作用，沒有啟動子存在，增強子不能表109④增強子的作用機理雖然還不明確，但與其他順式調控元件一樣，必須與特定的蛋白質結合后才能發(fā)揮增強轉錄的作用。增強子一般具有組織或細胞特異性，許多增強子只在某些細胞或組織中表現活性，是由這些細胞或組織中具有的特異性蛋白質因子所決定的。④增強子的作用機理雖然還不明確，但與其他順式調控元件一樣，必110增強子可能有如下3種作用機制：①影響模板附近的DNA雙螺旋結構，導致DNA雙螺旋彎折或在反式因子的參與下，以蛋白質之間的相互作用為媒介形成增強子與啟動子之間“成環(huán)”連接，活化基因轉錄；增強子可能有如下3種作用機制：111②將模板固定在細胞核內特定位置，如連接在核基質上，有利于DNA拓撲異構酶改變DNA雙螺旋結構的張力，促進RNA聚合酶II在DNA鏈上的結合和滑動；③增強子區(qū)可以作為反式作用因子或RNA聚合酶II進入染色質結構的“入口”。②將模板固定在細胞核內特定位置，如連接在核基質上，有利于DN1123.靜止子

最早在酵母中發(fā)現，以后在T淋巴細胞的T抗原受體基因的轉錄和重排中證實這種負調控順式元件的存在。靜止子的作用可不受序列方向的影響，也能遠距離發(fā)揮作用，并可對異源基因的表達起作用。目前對這種在基因轉錄降低或關閉中起作用的序列研究還不多。3.靜止子113第二節(jié)真核生物DNA水平上的基因表達調控第二節(jié)真核生物DNA水平上的基因表達調控114一、真核生物DNA水平上的基因表達調控特點

分子生物學的最新研究表明，在個體發(fā)育過程中，用來合成RNA的DNA模板也會發(fā)生規(guī)律性變化，從而控制基因表達和生物體的發(fā)育。

一、真核生物DNA水平上的基因表達調控特點115高度重復基因的形成通常與個體分化階段DNA的某些變化有關。例如，一個成熟的紅細胞能產生大量的可翻譯出成熟珠蛋白的mRNA，而其前體細胞卻不產生珠蛋白。許多情況下，這種變化是由于基因本身或它的拷貝數發(fā)生了永久性變化。

高度重復基因的形成通常與個體分化階段DNA的某些變化有關116

這種DNA水平的調控是真核生物發(fā)育調控的一種形式，它包括了基因丟失、擴增、重排和移位等方式，通過這些方式可以消除或變換某些基因并改變它們的活性。這些調控方式與轉錄及翻譯水平的調控是不同的，因為它使基因組發(fā)生了改變。這種DNA水平的調控是真核生物發(fā)育調控的一種形117二、“開放”型活性染色質（activechromatin）結構對轉錄的影響

真核基因的活躍轉錄是在常染色質上進行的。轉錄發(fā)生之前，染色質常常會在特定的區(qū)域被解旋松弛，形成自由DNA。這種變化可能包括核小體結構的消除或改變，DNA本身局部結構的變化等，這些變化可導致結構基因暴露，促進轉錄因子與啟動區(qū)DNA的結合，誘發(fā)基因轉錄。二、“開放”型活性染色質（activechromatin）118用DNA酶I處理各種組織的染色質時，發(fā)現處于活躍狀態(tài)的基因比非活躍狀態(tài)的DNA更容易被DNA酶I所降解。雞成紅細胞（erythroblast）染色質中，β-血紅蛋白基因比卵清蛋白基因更容易被DNA酶I切割降解。雞輸卵管細胞的染色質中被DNA酶I優(yōu)先降解的是卵清蛋白基因，而不是β-血紅蛋白基因。用DNA酶I處理各種組織的染色質時，發(fā)現處于活躍狀態(tài)的基因比119存在于“燈刷型”染色體（lampbrush）上的環(huán)形結構可能與基因的活性轉錄有關?！盁羲⑿汀比旧w只有在兩棲類動物卵細胞發(fā)生減數分裂時才能被觀察到，它是染色體充分伸展時的一種形態(tài)。高倍電鏡下觀察發(fā)現，燈刷型染色體上存在許多突起的“泡”狀或“環(huán)”狀結構，有時還能看到RNP沿著這些突起結構移動，表明這些DNA正在被RNA聚合酶所轉錄。存在于“燈刷型”染色體（lampbrush）上的環(huán)形結構可120第八章真核基因轉錄調控培訓課程課件121三、基因擴增

基因擴增是指某些基因的拷貝數專一性大量增加的現象，它使細胞在短期內產生大量的某個基因產物以滿足生長發(fā)育的需要，是基因活性調控的一種方式。三、基因擴增

基因擴增是指某些基因的拷貝數專一性大量增加的現122

兩棲