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第二章DNA的復(fù)制,修復(fù)和重組1.DNA的代謝過(guò)程包括復(fù)制,修復(fù)和重組2.大腸桿菌遺傳圖整個(gè)圖分為100分鐘,每分鐘約40,000bp。基因名稱基本反映基因的功能,用3個(gè)斜體字母表示,如mut,誘變相關(guān)基因;pol,DNA多聚酶基因;rec,重組相關(guān)基因等等。第二章DNA的復(fù)制,修復(fù)和重組1.DNA的代謝過(guò)程包括復(fù)1DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件2作為基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)名稱則用第一個(gè)字母為大寫(xiě)的正體字,如“RecA蛋白”。第一節(jié)DNA復(fù)制
一.關(guān)于模板的概念(template)
模板分子的概念產(chǎn)生于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)建立之前,能指導(dǎo)子代生物大分子按特定順序合成的母鏈稱模板。二.DNA復(fù)制的基本規(guī)律
a.DNA復(fù)制是半保留的;作為基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)名稱則用第一個(gè)字母為大寫(xiě)的正體字,3DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件4b.DNA復(fù)制在一個(gè)原點(diǎn)(orgin)開(kāi)始,雙向進(jìn)行;DNA分子復(fù)制的起點(diǎn)稱原點(diǎn),大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)稱OriC,終點(diǎn)區(qū)是ter。DNA復(fù)制點(diǎn)呈分叉狀,分叉狀復(fù)制區(qū)域稱復(fù)制叉。
c.DNA復(fù)制是半不連續(xù)的;
I.岡崎片斷(Okazakifragments);II.復(fù)制叉上的前導(dǎo)鏈(leadingstrand)和滯后鏈(laggingstrand);b.DNA復(fù)制在一個(gè)原點(diǎn)(orgin)開(kāi)始,雙向進(jìn)行5DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件6DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件7三.依賴于DNA的DNA聚合酶1.E.coliDNApolymeraseI的發(fā)現(xiàn),ArthurKornberg,1955,單肽鏈,Mr=103,000。2.DNA聚合酶酶促反應(yīng)機(jī)制(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi
引物任意脫核延長(zhǎng)一個(gè)焦磷酸苷三磷酸核苷酸殘基
DNA聚合反應(yīng)的關(guān)鍵是生長(zhǎng)鏈的末端核苷酸的游離3’羥基對(duì)下一個(gè)參加聚合三.依賴于DNA的DNA聚合酶8
反應(yīng)的脫氧核苷三磷酸中的α-磷原子發(fā)動(dòng)親核進(jìn)攻,建立酯鍵,釋放出焦磷酸。
DNA聚合酶催化反應(yīng)的基本規(guī)律:所有DNA聚合酶都需要模板;所有DNA聚合酶都需要引物(primer);引物:互補(bǔ)于模板鏈的一個(gè)寡核苷酸片斷,它帶有一個(gè)游離的3’-OH,以便建立新的磷酸二酯鍵。所有的核酸鏈聚合反應(yīng)都從5‘——3’方向進(jìn)行。
9四.DNA多聚化的熱力學(xué)
DNA聚合酶(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+Ppippi焦磷酸酶2pi+2KJ/mol-30KJ/mol-28KJ/molΔG0’=-28KJ/mol
四.DNA多聚化的熱力學(xué)10但由DNA聚合酶催化的上述反應(yīng)在無(wú)焦磷酸酶參與下仍能繼續(xù)進(jìn)行。聚合反應(yīng)導(dǎo)致多重弱相互作用的形成,它們釋放的能量促進(jìn)多聚化反應(yīng):
C-H約100KJ/mol;OH…O=C約4-5KJ/mol;vanderWaal’s約1KJ/mol。但由DNA聚合酶催化的上述反應(yīng)在無(wú)焦磷酸酶參與下仍能繼11DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件12五.DNA聚合酶催化DNA聚合反應(yīng)的精確性
E.coli
中的實(shí)際錯(cuò)誤率10-9-10-10;
E.coli
基因組4.7×106bp;1.復(fù)制的堿基配對(duì)可以達(dá)到10-4-10-5的錯(cuò)誤率。這錯(cuò)誤率相當(dāng)于堿基上功能基團(tuán)的互變異構(gòu)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。2.DNA多聚酶3‘-5’外切酶活性對(duì)堿基配對(duì)的校對(duì)作用(proofreading),可以提高精度102-103倍,距離細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制精度還差102。校對(duì)作用不是合成的逆反應(yīng),兩種活性是獨(dú)立的。五.DNA聚合酶催化DNA聚合反應(yīng)的精確性13以上兩個(gè)過(guò)程復(fù)制和校對(duì),都依賴堿基配對(duì)中的非共價(jià)相互作用,這是提高信息分子復(fù)制高保真度的根本方法。六.大腸桿菌有多種DNA聚合酶1.DNApolymeraseI的特性5’-3’聚合酶活性;3’-5’外切酶活性;5’-3’外切酶活性。DNA合成速度不及復(fù)制叉移動(dòng)速度的1/20,16-20nt/s;連續(xù)性太低;以上兩個(gè)過(guò)程復(fù)制和校對(duì),都依賴堿基配對(duì)中的非共價(jià)相互作14遺傳學(xué)證據(jù)證明polA-細(xì)胞也能存活;2.II型DNA聚合酶和III型DNA聚合酶
II型參加SOS修復(fù);
III型是主要的DNA復(fù)制酶;3.E.coliI型DNA聚合酶的兩個(gè)主要應(yīng)用
a.“Nicktranslation”(切口移位技術(shù)),I型DNA聚合酶具有以雙鏈DNA的一個(gè)切口開(kāi)始,用5‘-3’的外切酶活性降解這條舊鏈,并合成一條新鏈代替舊鏈,用這種技術(shù)在試管內(nèi)把放射性核苷酸導(dǎo)入DNA,用于探針?lè)派湫缘臉?biāo)記。遺傳學(xué)證據(jù)證明polA-細(xì)胞也能存活;15DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件16
b.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR,polymerasechainreaction),在試管內(nèi)擴(kuò)增一個(gè)特定基因組片斷的一個(gè)方法。4.E.coli
三種DNA聚合酶的比較b.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR,polymerasech17DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件18DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件19七.復(fù)制復(fù)合物(replisome,復(fù)制體)復(fù)制體含有20種以上的蛋白質(zhì)和酶類,如DNA解螺旋酶(helicases),ssb(單鏈結(jié)合蛋白,singlestrandbindingprotein),primase(引物酶),DNApolymeraseIII,DNApolymeraseI,DNAligase(DNA連接酶),DNA拓?fù)涿?。?大腸桿菌染色體DNA復(fù)制的三個(gè)階段生物大分子的合成都可以分成三個(gè)階段:起始(initiation),延長(zhǎng)(elongation),終止(termination)。七.復(fù)制復(fù)合物(replisome,復(fù)制體)201.DNA合成的起始a.大腸桿菌復(fù)制原點(diǎn),OriC1.DNA合成的起始21DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件22Consensussequence(交感順序):一個(gè)理想化了的DNA順序,這種順序中的每個(gè)位置上的堿基代表著被比較的同功能的許多順序中最常出現(xiàn)的堿基。b.起始復(fù)合物(或預(yù)引復(fù)合物,preprimingcomplex)DnaA蛋白(20copies,結(jié)合于9bp序列,以打開(kāi)串聯(lián)13bp序列);
DnaB(helicase)DNA解螺旋;
DnaC蛋白促進(jìn)DnaB蛋白的結(jié)合;Consensussequence(交感順序):一個(gè)理想化23HU類組蛋白,刺激起始;
DnaG(primase)引物酶,合成RNA物;
SSB單鏈DNA結(jié)合蛋白;
RNApolymerase促進(jìn)DnaA的活性;
DNATopoisomeraseII釋放由DNA解螺旋產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)力(torsinalstrain);c.復(fù)制起始的調(diào)節(jié)HU類組蛋白,刺激起始;24DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件252.復(fù)制中DNA鏈的延長(zhǎng)
a.前導(dǎo)鏈的延長(zhǎng)兩條鏈合成共同需要的酶:
DNAhelicase,DNATopoisomerase,SSB,DNApolymeraseIII,primase。b.滯后鏈的延長(zhǎng)引物體(primosome)含有DnaB,DnaADnaG等七種蛋白,引物體間隔性地迫使引物酶合成含10-60核苷酸殘基長(zhǎng)地RNA引物,DNApolymeraseIII加接脫氧核苷2.復(fù)制中DNA鏈的延長(zhǎng)26圖12-9圖12-10圖12-927酸,DNApolymeraseI除去RNA引物,并合成DNA鏈代替,所留下的nick(切口)由DNA連接酶連接。
c.DNA連接酶連接具有5’-磷酸和3’-OH的切口形成磷酸二酯鍵,連接酶以NAD或ATP為能源。3.終止在原核細(xì)胞中,兩個(gè)方向相反的復(fù)制叉在染色體對(duì)相遇時(shí)復(fù)制的終止過(guò)程開(kāi)始。酸,DNApolymeraseI除去RNA引物28八.真核細(xì)胞DNA的復(fù)制1.真核細(xì)胞染色體上有許多復(fù)制原點(diǎn)(起點(diǎn)),稱自體復(fù)制順序(autonomouslyreplicatingsequences,ARS),長(zhǎng)約150bp,在yeast中,400ARS,in17chr。2.復(fù)制叉移動(dòng)速度僅及細(xì)菌的1/10。3.有多個(gè)DNA聚合酶(α,ε,δ等)。八.真核細(xì)胞DNA的復(fù)制29第二節(jié)DNA修復(fù)(repair)一.關(guān)于突變的一些概念1.天然突變和誘變天然突變:如堿基的互變異構(gòu),宇宙線造成的突變。天然突變率稱突變的本底水平(background)。
誘導(dǎo)突變(inducedmutation):補(bǔ)加誘變劑誘發(fā)的突變。誘變劑:引起突變的任何物理因子或化學(xué)因子稱誘變劑或誘變因子。第二節(jié)DNA修復(fù)(repair)30DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件31一些生物學(xué)過(guò)程也引起突變,如病毒的感染(在染色體上的整合等)。2.突變的分類點(diǎn)突變:用一個(gè)堿基對(duì)替換另一個(gè)堿基對(duì)的突變。插入(insertion)和缺失(deletion):插入和缺失都可以造成基因的框移突變(frameshiftmutation)。
無(wú)意義突變(nonsensemutation):有意義密碼改變成終止密碼的突變。一些生物學(xué)過(guò)程也引起突變,如病毒的感染(在染色體上的整32DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件333.點(diǎn)突變的滲漏性a.沉默突變(silentmutation)突變不改變氨基酸殘基,CUX對(duì)應(yīng)Leu,CCX對(duì)應(yīng)Pro;改變氨基酸殘基但不影響基因產(chǎn)物的活性,如PheTyr,LeuIle;正向突變滅活一個(gè)基因的突變稱正向突變(forwardmutation)。突變的回復(fù)3.點(diǎn)突變的滲漏性34能克服原始突變?cè)斐傻挠绊懙牡诙瓮蛔兎Q回復(fù)突變(reversionmutation)真回復(fù)truereversion第二點(diǎn)回復(fù):回復(fù)突變發(fā)生在同一基因內(nèi)的第二個(gè)位點(diǎn)。4.突變的抑制作用(suppression)a.基因內(nèi)抑制(或基因內(nèi)回復(fù),intragenicreversion),指一個(gè)補(bǔ)償突變恢復(fù)了原突變蛋白的活性構(gòu)象;或在一個(gè)框移突變之后恢復(fù)正確的讀碼框架。能克服原始突變?cè)斐傻挠绊懙牡诙瓮蛔兎Q回復(fù)突變(rev35DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件36b.突變的基因間回復(fù)(或基因間的抑制)第二個(gè)基因的突變排除或抑制了第一個(gè)基因突變的影響,如抑制子tRNA抑制無(wú)意義突變和錯(cuò)義突變。二.腫瘤發(fā)生和Ames檢測(cè)
DNA核苷酸順序的永久性改變稱為突變,突變的積累導(dǎo)致動(dòng)物腫瘤的發(fā)生。一般的說(shuō)誘變劑是致癌物。Ames檢測(cè)法檢出致癌物:利用一株沙門(mén)氏桿菌組氨酸合成酶缺陷株。誘變劑(致癌物)可導(dǎo)致基因突變的回復(fù),使之成為野生型,這原理可用檢出誘變劑。b.突變的基因間回復(fù)(或基因間的抑制)37DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件38DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件39三.細(xì)胞中的DNA修復(fù)系統(tǒng)細(xì)胞有多個(gè)DNA修復(fù)系統(tǒng),為遺傳信息的完整性不惜代價(jià)。DNA修復(fù)的主要根據(jù)是以正確的互補(bǔ)鏈修復(fù)損傷的或錯(cuò)誤的鏈。1.錯(cuò)配修復(fù)(mismatchrepair)a.DNA復(fù)制后錯(cuò)配堿基在模板鏈指導(dǎo)下的修復(fù)過(guò)程稱錯(cuò)配修復(fù),可提高復(fù)制精確率102-103倍;
b.區(qū)分模板鏈和新合成鏈依靠識(shí)別親本三.細(xì)胞中的DNA修復(fù)系統(tǒng)40DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件41鏈中GATC序列中的甲基化標(biāo)簽(tag);c.Dam甲基化酶甲基化DNA(A堿基的N6甲基化);
d.錯(cuò)配修復(fù)所需的酶類
Dam甲基化酶;MutH,MutL,MutS蛋白;DNAhelicaseII;SSB;DNApolymerasIII;exonucleaseI;外切酶VII;RecJ核酸酶;DNAligase。e.修復(fù)過(guò)程圖解鏈中GATC序列中的甲基化標(biāo)簽(tag);42DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件432.堿基的切割修復(fù)主要酶類:核酸糖基化酶(glycosylase),AP內(nèi)切核酸酶,DNApolymeraseI,DNAligase
核酸糖基化酶識(shí)別損傷堿基,切割損傷堿基產(chǎn)生AP位點(diǎn),由AP內(nèi)切核酸酶切割A(yù)P位點(diǎn)的磷酸二酯鍵。3.核苷酸切割修復(fù)由uvrA,uvrB,uvrC編碼的“ABC切割核酸酶”,ABCexcinuclease切去堿基光促合成產(chǎn)物,切去損傷點(diǎn)上游8nt,下游4-5nt。2.堿基的切割修復(fù)44DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件45DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件464.直接修復(fù)(directrepair)a.光復(fù)活修復(fù)
DNA光解酶(photolyase)b.O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶去甲基化4.直接修復(fù)(directrepair)47DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件485.差錯(cuò)傾向修復(fù)(error-pronerepair)SOS反應(yīng)
a.SOS反應(yīng)當(dāng)細(xì)胞DNA受到大量的嚴(yán)重的損傷時(shí),誘發(fā)細(xì)胞的應(yīng)急反應(yīng)(SOSrespone)。此時(shí)細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生大量應(yīng)急反應(yīng)所需的蛋白和酶。這種反應(yīng)使細(xì)胞分裂受到抑制,溶源狀態(tài)的噬菌體被誘導(dǎo)進(jìn)入溶菌周期,正常的DNA復(fù)制停止。同時(shí)誘發(fā)產(chǎn)生許多正常的DNA修復(fù)酶和特殊的5.差錯(cuò)傾向修復(fù)(error-pronerepair)S49DNA修復(fù)-差錯(cuò)傾向修復(fù)所需的酶類。DNA修復(fù)-差錯(cuò)傾向修復(fù)所需的酶類。50DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件51b.DNApolymeraseV和translesionreplicationDNA聚合酶V能復(fù)制DNA鏈的損傷位點(diǎn),造成高突變率。b.DNApolymeraseV和transle52第三節(jié)細(xì)胞內(nèi)DNA的遺傳重組(Geneticrecombination,或稱基因重排Generearrangement)一.普通重組(Generalrecombination)和位點(diǎn)特異性重組(site-specificrecombination)1.普通重組(依賴同源順序的重組)親本的雙鏈DNA在同源順序區(qū)域并排(聯(lián)會(huì)),通過(guò)互換同源DNA片斷形成新組合的DNA分子,這個(gè)過(guò)程稱為普通第三節(jié)細(xì)胞內(nèi)DNA的遺傳重組(Geneticrecomb53遺傳重組。2.位點(diǎn)特異重組無(wú)需同源順序的遺傳重組,包括:
a.外來(lái)DNA在特殊染色體特殊位點(diǎn)的整合,如HIV,λ;b.基因轉(zhuǎn)座(transposition)
轉(zhuǎn)座是基因或某DNA順序從一個(gè)染色體轉(zhuǎn)移到另一染色體或從同一染色體的一個(gè)座位轉(zhuǎn)移到另一座位的遺傳學(xué)事件。遺傳重組。54DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件553.遺傳重組的生物學(xué)意義a.普通重組在DNA損傷的修復(fù)中起重要作用;b.重組擴(kuò)大生物界遺傳多樣性,產(chǎn)生新的基因組合,對(duì)進(jìn)化有重要意義;
c.調(diào)節(jié)基因表達(dá),一個(gè)基因的沉默或激活可因它在染色體上的位置和取向的改變而改變,如酵母性別轉(zhuǎn)換,菌毛基因類型的改變(phasevariation);
d.遺傳重組使抗體多樣化。3.遺傳重組的生物學(xué)意義56二.普通遺傳重組機(jī)制1.依賴于同源順序遺傳重組的細(xì)胞學(xué)證據(jù):染色體的交叉互換二.普通遺傳572.普通重組的Holliday模型(RobinHolliday,1964)a.同源DNA(homologousduplexes)并排在一起(“聯(lián)會(huì)”);
b.內(nèi)切酶切割兩并列雙鏈中各一條鏈;
c.交叉互換(crossingover);d.交叉點(diǎn)移動(dòng);
e.重組中間體切割分解產(chǎn)生兩種不同的重組產(chǎn)物;2.普通重組的Holliday模型(RobinHolli58DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件593.同源DNA雙鏈配對(duì)形成Chi(χ)型重組中間體的證據(jù)。
a.單體(monomer)質(zhì)粒DNA在細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生頭尾相連的環(huán)形二聚體(dimer);b.質(zhì)粒同源重組中間體限制酶切割產(chǎn)生臂長(zhǎng)相等的χ型產(chǎn)物;4.遺傳重組需要特殊的酶
a.在大腸桿菌細(xì)胞中普通遺傳重組依賴于一組rec系列基因產(chǎn)物,其中有recA,recB,recC,recD以及其它一些酶類,如3.同源DNA雙鏈配對(duì)形成Chi(χ)型重組中間體的證據(jù)。60DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件61DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件62topo酶,DNA聚合酶,分解酶等。遺傳學(xué)證據(jù):recA-(缺陷)細(xì)胞使細(xì)胞的重組率下降10-4,recA-細(xì)胞在紫外光照射后的存活率降低為10-2-10-3。
b.RecA蛋白對(duì)單鏈DNA的結(jié)合(形成絲狀體)促進(jìn)與同源雙鏈DNA之間的DNA鏈互換。RecA蛋白在體外(invitro)誘發(fā)的DNA鏈交換反應(yīng);RecA蛋白介導(dǎo)的DNA鏈交換模型;topo酶,DNA聚合酶,分解酶等。63DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件645.E.coliRecBCD酶有解螺旋和內(nèi)切酶活性,RecBCD復(fù)合物有ATPdrivenhelicase和nuclease活性,RecD具有內(nèi)切酶活性,能切開(kāi)雙鏈DNA中的Chi位點(diǎn)(重組熱點(diǎn)),產(chǎn)生單鏈DNA,Chi位點(diǎn)的堿基順序?yàn)?‘-GCTGGTGG-3’。6.重組修復(fù)(復(fù)制后修復(fù),postreplicationrepair),當(dāng)受損傷的DNA鏈的配偶鏈不存在時(shí),同源重組可提供修復(fù)所需的信息。5.E.coliRecBCD酶有解螺旋和內(nèi)切酶活性,R65DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件66DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件677.位點(diǎn)特異重組(sitespecificrecombination)
一.λ噬菌體DNA在寄主染色體上的整合和切出
a.λ的兩種生活周期溶菌生長(zhǎng)周期(lyticcycle)
溶原狀態(tài)(lysogenicstate)b.λ的整合和切出時(shí)位點(diǎn)特異重組事件整合位點(diǎn)att(attachmentsites)attP(phage位點(diǎn))
attB(Bacterialsite)7.位點(diǎn)特異重組(sitespecificrecomb68其O順序是attP和attB共有的順序(同源),P,P’和B,B’為各自的側(cè)接順序(flankingsequence)。
二.位點(diǎn)特異重組依賴于重組酶和由重組酶識(shí)別的特殊順序(20-200bp),重組酶的識(shí)別順序的取向可能導(dǎo)致不同的重組結(jié)果。
a.重組導(dǎo)致基因順序顛倒;b.重組導(dǎo)致缺失和插入;其O順序是attP和attB共有的順序(同源),P69DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件70DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件71三.免疫球蛋白基因的重組
a.哺乳動(dòng)物,人抗體的多樣性數(shù)以百萬(wàn)計(jì);
b.免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)分重鏈,輕鏈(兩個(gè)家族Kappa鏈,lambda鏈,重鏈輕鏈都由可變區(qū),連接區(qū)和不變區(qū)三部分組成;
c.抗體的多樣性是由抗體基因片段的位點(diǎn)特異重組造成的不同組合導(dǎo)致的;以IgGKappa輕鏈為例三.免疫球蛋白基因的重組72可變區(qū)連接區(qū)不變區(qū)300種片斷4種1種組合數(shù)300×4=1200種,由于連接方式不同造成2.5倍的多樣性,于是總數(shù)1200×2.5=3000種,重鏈按類似的方式重組可有5000種組合;于是干細(xì)胞至少在分化過(guò)程可以產(chǎn)生5000×3000=1.5×107種功能特異的抗體,產(chǎn)生分化完全的B淋巴細(xì)胞,每種B淋巴細(xì)胞只產(chǎn)生一種抗體??勺儏^(qū)連接區(qū)不變區(qū)73多樣性還來(lái)自于不知原因的V順序高突變率多樣性還74演講完畢,謝謝觀看!演講完畢,謝謝觀看!75第二章DNA的復(fù)制,修復(fù)和重組1.DNA的代謝過(guò)程包括復(fù)制,修復(fù)和重組2.大腸桿菌遺傳圖整個(gè)圖分為100分鐘,每分鐘約40,000bp。基因名稱基本反映基因的功能,用3個(gè)斜體字母表示,如mut,誘變相關(guān)基因;pol,DNA多聚酶基因;rec,重組相關(guān)基因等等。第二章DNA的復(fù)制,修復(fù)和重組1.DNA的代謝過(guò)程包括復(fù)76DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件77作為基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)名稱則用第一個(gè)字母為大寫(xiě)的正體字,如“RecA蛋白”。第一節(jié)DNA復(fù)制
一.關(guān)于模板的概念(template)
模板分子的概念產(chǎn)生于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)建立之前,能指導(dǎo)子代生物大分子按特定順序合成的母鏈稱模板。二.DNA復(fù)制的基本規(guī)律
a.DNA復(fù)制是半保留的;作為基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)名稱則用第一個(gè)字母為大寫(xiě)的正體字,78DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件79b.DNA復(fù)制在一個(gè)原點(diǎn)(orgin)開(kāi)始,雙向進(jìn)行;DNA分子復(fù)制的起點(diǎn)稱原點(diǎn),大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)稱OriC,終點(diǎn)區(qū)是ter。DNA復(fù)制點(diǎn)呈分叉狀,分叉狀復(fù)制區(qū)域稱復(fù)制叉。
c.DNA復(fù)制是半不連續(xù)的;
I.岡崎片斷(Okazakifragments);II.復(fù)制叉上的前導(dǎo)鏈(leadingstrand)和滯后鏈(laggingstrand);b.DNA復(fù)制在一個(gè)原點(diǎn)(orgin)開(kāi)始,雙向進(jìn)行80DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件81DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件82三.依賴于DNA的DNA聚合酶1.E.coliDNApolymeraseI的發(fā)現(xiàn),ArthurKornberg,1955,單肽鏈,Mr=103,000。2.DNA聚合酶酶促反應(yīng)機(jī)制(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi
引物任意脫核延長(zhǎng)一個(gè)焦磷酸苷三磷酸核苷酸殘基
DNA聚合反應(yīng)的關(guān)鍵是生長(zhǎng)鏈的末端核苷酸的游離3’羥基對(duì)下一個(gè)參加聚合三.依賴于DNA的DNA聚合酶83
反應(yīng)的脫氧核苷三磷酸中的α-磷原子發(fā)動(dòng)親核進(jìn)攻,建立酯鍵,釋放出焦磷酸。
DNA聚合酶催化反應(yīng)的基本規(guī)律:所有DNA聚合酶都需要模板;所有DNA聚合酶都需要引物(primer);引物:互補(bǔ)于模板鏈的一個(gè)寡核苷酸片斷,它帶有一個(gè)游離的3’-OH,以便建立新的磷酸二酯鍵。所有的核酸鏈聚合反應(yīng)都從5‘——3’方向進(jìn)行。
84四.DNA多聚化的熱力學(xué)
DNA聚合酶(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+Ppippi焦磷酸酶2pi+2KJ/mol-30KJ/mol-28KJ/molΔG0’=-28KJ/mol
四.DNA多聚化的熱力學(xué)85但由DNA聚合酶催化的上述反應(yīng)在無(wú)焦磷酸酶參與下仍能繼續(xù)進(jìn)行。聚合反應(yīng)導(dǎo)致多重弱相互作用的形成,它們釋放的能量促進(jìn)多聚化反應(yīng):
C-H約100KJ/mol;OH…O=C約4-5KJ/mol;vanderWaal’s約1KJ/mol。但由DNA聚合酶催化的上述反應(yīng)在無(wú)焦磷酸酶參與下仍能繼86DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件87五.DNA聚合酶催化DNA聚合反應(yīng)的精確性
E.coli
中的實(shí)際錯(cuò)誤率10-9-10-10;
E.coli
基因組4.7×106bp;1.復(fù)制的堿基配對(duì)可以達(dá)到10-4-10-5的錯(cuò)誤率。這錯(cuò)誤率相當(dāng)于堿基上功能基團(tuán)的互變異構(gòu)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。2.DNA多聚酶3‘-5’外切酶活性對(duì)堿基配對(duì)的校對(duì)作用(proofreading),可以提高精度102-103倍,距離細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制精度還差102。校對(duì)作用不是合成的逆反應(yīng),兩種活性是獨(dú)立的。五.DNA聚合酶催化DNA聚合反應(yīng)的精確性88以上兩個(gè)過(guò)程復(fù)制和校對(duì),都依賴堿基配對(duì)中的非共價(jià)相互作用,這是提高信息分子復(fù)制高保真度的根本方法。六.大腸桿菌有多種DNA聚合酶1.DNApolymeraseI的特性5’-3’聚合酶活性;3’-5’外切酶活性;5’-3’外切酶活性。DNA合成速度不及復(fù)制叉移動(dòng)速度的1/20,16-20nt/s;連續(xù)性太低;以上兩個(gè)過(guò)程復(fù)制和校對(duì),都依賴堿基配對(duì)中的非共價(jià)相互作89遺傳學(xué)證據(jù)證明polA-細(xì)胞也能存活;2.II型DNA聚合酶和III型DNA聚合酶
II型參加SOS修復(fù);
III型是主要的DNA復(fù)制酶;3.E.coliI型DNA聚合酶的兩個(gè)主要應(yīng)用
a.“Nicktranslation”(切口移位技術(shù)),I型DNA聚合酶具有以雙鏈DNA的一個(gè)切口開(kāi)始,用5‘-3’的外切酶活性降解這條舊鏈,并合成一條新鏈代替舊鏈,用這種技術(shù)在試管內(nèi)把放射性核苷酸導(dǎo)入DNA,用于探針?lè)派湫缘臉?biāo)記。遺傳學(xué)證據(jù)證明polA-細(xì)胞也能存活;90DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件91
b.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR,polymerasechainreaction),在試管內(nèi)擴(kuò)增一個(gè)特定基因組片斷的一個(gè)方法。4.E.coli
三種DNA聚合酶的比較b.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR,polymerasech92DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件93DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件94七.復(fù)制復(fù)合物(replisome,復(fù)制體)復(fù)制體含有20種以上的蛋白質(zhì)和酶類,如DNA解螺旋酶(helicases),ssb(單鏈結(jié)合蛋白,singlestrandbindingprotein),primase(引物酶),DNApolymeraseIII,DNApolymeraseI,DNAligase(DNA連接酶),DNA拓?fù)涿?。?大腸桿菌染色體DNA復(fù)制的三個(gè)階段生物大分子的合成都可以分成三個(gè)階段:起始(initiation),延長(zhǎng)(elongation),終止(termination)。七.復(fù)制復(fù)合物(replisome,復(fù)制體)951.DNA合成的起始a.大腸桿菌復(fù)制原點(diǎn),OriC1.DNA合成的起始96DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件97Consensussequence(交感順序):一個(gè)理想化了的DNA順序,這種順序中的每個(gè)位置上的堿基代表著被比較的同功能的許多順序中最常出現(xiàn)的堿基。b.起始復(fù)合物(或預(yù)引復(fù)合物,preprimingcomplex)DnaA蛋白(20copies,結(jié)合于9bp序列,以打開(kāi)串聯(lián)13bp序列);
DnaB(helicase)DNA解螺旋;
DnaC蛋白促進(jìn)DnaB蛋白的結(jié)合;Consensussequence(交感順序):一個(gè)理想化98HU類組蛋白,刺激起始;
DnaG(primase)引物酶,合成RNA物;
SSB單鏈DNA結(jié)合蛋白;
RNApolymerase促進(jìn)DnaA的活性;
DNATopoisomeraseII釋放由DNA解螺旋產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)力(torsinalstrain);c.復(fù)制起始的調(diào)節(jié)HU類組蛋白,刺激起始;99DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件1002.復(fù)制中DNA鏈的延長(zhǎng)
a.前導(dǎo)鏈的延長(zhǎng)兩條鏈合成共同需要的酶:
DNAhelicase,DNATopoisomerase,SSB,DNApolymeraseIII,primase。b.滯后鏈的延長(zhǎng)引物體(primosome)含有DnaB,DnaADnaG等七種蛋白,引物體間隔性地迫使引物酶合成含10-60核苷酸殘基長(zhǎng)地RNA引物,DNApolymeraseIII加接脫氧核苷2.復(fù)制中DNA鏈的延長(zhǎng)101圖12-9圖12-10圖12-9102酸,DNApolymeraseI除去RNA引物,并合成DNA鏈代替,所留下的nick(切口)由DNA連接酶連接。
c.DNA連接酶連接具有5’-磷酸和3’-OH的切口形成磷酸二酯鍵,連接酶以NAD或ATP為能源。3.終止在原核細(xì)胞中,兩個(gè)方向相反的復(fù)制叉在染色體對(duì)相遇時(shí)復(fù)制的終止過(guò)程開(kāi)始。酸,DNApolymeraseI除去RNA引物103八.真核細(xì)胞DNA的復(fù)制1.真核細(xì)胞染色體上有許多復(fù)制原點(diǎn)(起點(diǎn)),稱自體復(fù)制順序(autonomouslyreplicatingsequences,ARS),長(zhǎng)約150bp,在yeast中,400ARS,in17chr。2.復(fù)制叉移動(dòng)速度僅及細(xì)菌的1/10。3.有多個(gè)DNA聚合酶(α,ε,δ等)。八.真核細(xì)胞DNA的復(fù)制104第二節(jié)DNA修復(fù)(repair)一.關(guān)于突變的一些概念1.天然突變和誘變天然突變:如堿基的互變異構(gòu),宇宙線造成的突變。天然突變率稱突變的本底水平(background)。
誘導(dǎo)突變(inducedmutation):補(bǔ)加誘變劑誘發(fā)的突變。誘變劑:引起突變的任何物理因子或化學(xué)因子稱誘變劑或誘變因子。第二節(jié)DNA修復(fù)(repair)105DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件106一些生物學(xué)過(guò)程也引起突變,如病毒的感染(在染色體上的整合等)。2.突變的分類點(diǎn)突變:用一個(gè)堿基對(duì)替換另一個(gè)堿基對(duì)的突變。插入(insertion)和缺失(deletion):插入和缺失都可以造成基因的框移突變(frameshiftmutation)。
無(wú)意義突變(nonsensemutation):有意義密碼改變成終止密碼的突變。一些生物學(xué)過(guò)程也引起突變,如病毒的感染(在染色體上的整107DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件1083.點(diǎn)突變的滲漏性a.沉默突變(silentmutation)突變不改變氨基酸殘基,CUX對(duì)應(yīng)Leu,CCX對(duì)應(yīng)Pro;改變氨基酸殘基但不影響基因產(chǎn)物的活性,如PheTyr,LeuIle;正向突變滅活一個(gè)基因的突變稱正向突變(forwardmutation)。突變的回復(fù)3.點(diǎn)突變的滲漏性109能克服原始突變?cè)斐傻挠绊懙牡诙瓮蛔兎Q回復(fù)突變(reversionmutation)真回復(fù)truereversion第二點(diǎn)回復(fù):回復(fù)突變發(fā)生在同一基因內(nèi)的第二個(gè)位點(diǎn)。4.突變的抑制作用(suppression)a.基因內(nèi)抑制(或基因內(nèi)回復(fù),intragenicreversion),指一個(gè)補(bǔ)償突變恢復(fù)了原突變蛋白的活性構(gòu)象;或在一個(gè)框移突變之后恢復(fù)正確的讀碼框架。能克服原始突變?cè)斐傻挠绊懙牡诙瓮蛔兎Q回復(fù)突變(rev110DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件111b.突變的基因間回復(fù)(或基因間的抑制)第二個(gè)基因的突變排除或抑制了第一個(gè)基因突變的影響,如抑制子tRNA抑制無(wú)意義突變和錯(cuò)義突變。二.腫瘤發(fā)生和Ames檢測(cè)
DNA核苷酸順序的永久性改變稱為突變,突變的積累導(dǎo)致動(dòng)物腫瘤的發(fā)生。一般的說(shuō)誘變劑是致癌物。Ames檢測(cè)法檢出致癌物:利用一株沙門(mén)氏桿菌組氨酸合成酶缺陷株。誘變劑(致癌物)可導(dǎo)致基因突變的回復(fù),使之成為野生型,這原理可用檢出誘變劑。b.突變的基因間回復(fù)(或基因間的抑制)112DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件113DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件114三.細(xì)胞中的DNA修復(fù)系統(tǒng)細(xì)胞有多個(gè)DNA修復(fù)系統(tǒng),為遺傳信息的完整性不惜代價(jià)。DNA修復(fù)的主要根據(jù)是以正確的互補(bǔ)鏈修復(fù)損傷的或錯(cuò)誤的鏈。1.錯(cuò)配修復(fù)(mismatchrepair)a.DNA復(fù)制后錯(cuò)配堿基在模板鏈指導(dǎo)下的修復(fù)過(guò)程稱錯(cuò)配修復(fù),可提高復(fù)制精確率102-103倍;
b.區(qū)分模板鏈和新合成鏈依靠識(shí)別親本三.細(xì)胞中的DNA修復(fù)系統(tǒng)115DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件116鏈中GATC序列中的甲基化標(biāo)簽(tag);c.Dam甲基化酶甲基化DNA(A堿基的N6甲基化);
d.錯(cuò)配修復(fù)所需的酶類
Dam甲基化酶;MutH,MutL,MutS蛋白;DNAhelicaseII;SSB;DNApolymerasIII;exonucleaseI;外切酶VII;RecJ核酸酶;DNAligase。e.修復(fù)過(guò)程圖解鏈中GATC序列中的甲基化標(biāo)簽(tag);117DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件1182.堿基的切割修復(fù)主要酶類:核酸糖基化酶(glycosylase),AP內(nèi)切核酸酶,DNApolymeraseI,DNAligase
核酸糖基化酶識(shí)別損傷堿基,切割損傷堿基產(chǎn)生AP位點(diǎn),由AP內(nèi)切核酸酶切割A(yù)P位點(diǎn)的磷酸二酯鍵。3.核苷酸切割修復(fù)由uvrA,uvrB,uvrC編碼的“ABC切割核酸酶”,ABCexcinuclease切去堿基光促合成產(chǎn)物,切去損傷點(diǎn)上游8nt,下游4-5nt。2.堿基的切割修復(fù)119DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件120DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件1214.直接修復(fù)(directrepair)a.光復(fù)活修復(fù)
DNA光解酶(photolyase)b.O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶去甲基化4.直接修復(fù)(directrepair)122DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件1235.差錯(cuò)傾向修復(fù)(error-pronerepair)SOS反應(yīng)
a.SOS反應(yīng)當(dāng)細(xì)胞DNA受到大量的嚴(yán)重的損傷時(shí),誘發(fā)細(xì)胞的應(yīng)急反應(yīng)(SOSrespone)。此時(shí)細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生大量應(yīng)急反應(yīng)所需的蛋白和酶。這種反應(yīng)使細(xì)胞分裂受到抑制,溶源狀態(tài)的噬菌體被誘導(dǎo)進(jìn)入溶菌周期,正常的DNA復(fù)制停止。同時(shí)誘發(fā)產(chǎn)生許多正常的DNA修復(fù)酶和特殊的5.差錯(cuò)傾向修復(fù)(error-pronerepair)S124DNA修復(fù)-差錯(cuò)傾向修復(fù)所需的酶類。DNA修復(fù)-差錯(cuò)傾向修復(fù)所需的酶類。125DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件126b.DNApolymeraseV和translesionreplicationDNA聚合酶V能復(fù)制DNA鏈的損傷位點(diǎn),造成高突變率。b.DNApolymeraseV和transle127第三節(jié)細(xì)胞內(nèi)DNA的遺傳重組(Geneticrecombination,或稱基因重排Generearrangement)一.普通重組(Generalrecombination)和位點(diǎn)特異性重組(site-specificrecombination)1.普通重組(依賴同源順序的重組)親本的雙鏈DNA在同源順序區(qū)域并排(聯(lián)會(huì)),通過(guò)互換同源DNA片斷形成新組合的DNA分子,這個(gè)過(guò)程稱為普通第三節(jié)細(xì)胞內(nèi)DNA的遺傳重組(Geneticrecomb128遺傳重組。2.位點(diǎn)特異重組無(wú)需同源順序的遺傳重組,包括:
a.外來(lái)DNA在特殊染色體特殊位點(diǎn)的整合,如HIV,λ;b.基因轉(zhuǎn)座(transposition)
轉(zhuǎn)座是基因或某DNA順序從一個(gè)染色體轉(zhuǎn)移到另一染色體或從同一染色體的一個(gè)座位轉(zhuǎn)移到另一座位的遺傳學(xué)事件。遺傳重組。129DNA復(fù)制,修復(fù)和重組課件1303.遺傳重組的生物學(xué)意義a.普通重組在DNA損傷的修復(fù)中起重要作用;b.重組擴(kuò)大生物界遺傳多樣性,產(chǎn)生新的基因組合,對(duì)進(jìn)化有重要意義;
c.調(diào)節(jié)基因表達(dá),一個(gè)基因的沉默或激活可因它在染色體上的位置和取向的改變而改變,如酵母性別轉(zhuǎn)換,菌毛基因類型的改變(phasevariation);
d.遺傳重組使抗體多樣化。3.遺傳重組的生物學(xué)意義131二.普通遺傳重組機(jī)制1.依賴于同源順序遺傳重組的細(xì)胞學(xué)證據(jù):染色體的交叉互換二.普通遺傳1322.普通重組的Holliday模型(RobinHolliday,1964)a.同源DNA(homologousduplexes)并排在一起(“聯(lián)會(huì)”);
b.內(nèi)切酶切割兩并列雙鏈中各一條鏈;
c.交叉互換(crossingover);d.交叉點(diǎn)移動(dòng);
e.重組中間體切割分解產(chǎn)生兩種不同的重組產(chǎn)物;2.普通重組的Holliday模型(RobinHolli13
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