DNA重組克隆的單元操作課程課件

第二節(jié)工具酶

第二節(jié)工具酶1切接轉(zhuǎn)檢增完整的基因克隆過程切接轉(zhuǎn)檢增完整的基因克隆過程2（一）基本知識(shí)一、限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease,RE）1、定義：指一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某特種特定核苷酸序列（4—8bp），并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。（一）基本知識(shí)一、限制性核酸內(nèi)切酶（Restriction32、來源:原核生物細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）限制性核酸內(nèi)切酶111EcoliC10-4110-4EcoliB10-410-41EcoliKλCλBλKEcoli菌株λ噬菌體感染率2、來源:原核生物細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）限制性核4RE將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。（1）限制（Restriction）RE將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。（1）限制（Res5細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割。（2）修飾（Modification）細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的63.性質(zhì):內(nèi)切酶,在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶×√3.性質(zhì):內(nèi)切酶,在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。內(nèi)切酶限制74.功能:自我保護(hù)作用限制性核酸內(nèi)切酶細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）

111EcoliC10-4110-4EcoliB10-410-41EcoliKλCλBλKEcoli菌株λ噬菌體感染率4.功能:自我保護(hù)作用限制性核酸內(nèi)切酶細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（8I型限制性內(nèi)切酶目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。（二）限制性內(nèi)切酶的類型II類限制性內(nèi)切酶III類限制性內(nèi)切酶I型限制性內(nèi)切酶目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)9首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿菌B株和K株分離的。（1）酶結(jié)構(gòu)1.I型限制性內(nèi)切酶如EcoB和EcoK。三亞基雙功能酶：R:限制酶亞基M:甲基化酶亞基S:識(shí)別DNA序列亞基首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大10（2）識(shí)別位點(diǎn)序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I型限制性內(nèi)切酶未甲基化修飾的特異序列。（2）識(shí)別位點(diǎn)序列EcoB：TGA(N)8TGCT1.11需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（4）作用機(jī)理在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約1000—1500bp處隨機(jī)切開一條單鏈。Recognizesitecut1-1.5kb（3）切割位點(diǎn)需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（4）作用機(jī)理12類型Ⅰ：大型的多亞基的蛋白質(zhì)。具有內(nèi)切酶的活性、具有甲基活性化酶的活性。具限制和修飾兩種體系，切割位點(diǎn)基本上是隨機(jī)。因此Ⅰ型內(nèi)切酶在DNA重組研究工作中并沒有什實(shí)際用處。類型Ⅰ：大型的多亞基的蛋白質(zhì)。13首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。（1）酶結(jié)構(gòu)相反方向結(jié)合的同源二聚體內(nèi)切酶與甲基化酶分開2.II類限制性內(nèi)切酶分離的第一個(gè)酶是HindⅡ首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在197014（2）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文對(duì)稱序列--旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列，反向重復(fù)序列）。與DNA的來源無關(guān)。2.II類限制性內(nèi)切酶EcoRI：5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’（2）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多15EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

產(chǎn)生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產(chǎn)生平齊末端（3）切割位點(diǎn)切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：識(shí)別位點(diǎn)處。EcoRI5’-GAATTC-3’EcoRV16（4）粘性末端含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：①5’端凸出（如EcoRI切點(diǎn)）GAATTC

CTTAA

GGAATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’（4）粘性末端含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：①5’17CTGCAG

②3’端凸出（如PstI切點(diǎn)）GACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG

GACGTCCTGCAG②3’端凸出（如PstI切點(diǎn)）GACG18①連接便利粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。①連接便利粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿19DNA重組克隆的單元操作課程課件20③補(bǔ)平成平齊末端凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端標(biāo)記凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。③補(bǔ)平成平齊末端凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚21識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同稱同裂酶。①同裂酶（Isoschizomers)：如HindⅢ和HsuIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’（5）II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同稱同裂酶。①同裂酶（IsoschizXmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

如XmaI和SmaI②同位酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。（5）II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式XmaI5’-CCCGGG-3’如Xma

同尾酶(Isocaudamers）識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端的酶。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’

BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。（5）II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式同尾酶(Isocaudamers）識(shí)別的序列不5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來的酶識(shí)別。5’-G3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’

BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’

BamHIBglⅡSau3A5’-GATC----3’Sau3A同尾（6）II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1mg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量（6）II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作大部分II型核26II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切，但應(yīng)注意：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATG3‘…CGATGTACCTAGGATCCCGGGTTCGCAT…3’

GGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCC3‘…CGATGTACCTAGGGGGGTTCGCAT…3’CCCAAGCGTA…5’BamHI

SmaIII型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則27對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切0.1倍體積的5MNaAcpH5.42.5倍體積的冰冷乙醇冰浴5分鐘、高速冷凍離心10分鐘、干燥對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，283.III類限制性內(nèi)切酶二亞基雙功能酶，也有專一的識(shí)別順序，在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但反應(yīng)需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸），這幾個(gè)核苷酸對(duì)也不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此也不能應(yīng)用于基因克隆。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG3.III類限制性內(nèi)切酶二亞基雙功能酶，也有專一的識(shí)別順29異源三聚體ATPMg2+SAMTGAN8TGCT距識(shí)別序列1kb處AACN6GTGC隨機(jī)性切割限制性核酸內(nèi)切酶的類型主要特性I型II型III型限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識(shí)別序列切割位點(diǎn)多功能同源二聚體Mg2+旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列單功能識(shí)別序列內(nèi)或附近特異性切割雙功能異源二聚體ATPMg2+SAMAGACCCAGCAG距識(shí)別序列下游24-26bp處異源三聚體ATPMg2+SAMTGAN8TGCT距識(shí)別序301973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：（三）限制性內(nèi)切酶的命名用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)字母的略語(yǔ)表示寄主菌的物種名。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。1973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名314.

限制酶前面要帶上R（Restriction)，修飾酶前面要帶上M（Modification）。（現(xiàn)已省略）。2.

用一個(gè)右下標(biāo)的大寫字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoRI）。3.

如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcoRI，EcoRV。4.限制酶前面要帶上R（Restriction)，2.用32限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名HindIII

HindIIIHaemophilus

influenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名33DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會(huì)影響酶的活性。1.DNA的純度（四）影響限制性內(nèi)切酶活性的因素①純化DNA②加大酶的用量1mgDNA用10U酶③延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間④擴(kuò)大反應(yīng)體積（>20l）一般采取DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都34大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）?；蚬こ讨斜仨毷褂眉谆甘Щ钔蛔兊木?。大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2.DNA的甲基化程度35大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響。

大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等。

哺乳動(dòng)物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基。大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列36不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045253.溫度不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少37是影響限制酶活性的重要因素。4.緩沖液(Buffer)緩沖液的化學(xué)組成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強(qiáng)度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。是影響限制酶活性的重要因素。4.緩沖液(Buffer)38溫度、離子強(qiáng)度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專一性。如果改變反應(yīng)條件就會(huì)影響酶的專一性和切割效率，稱為星號(hào)（*）活性。如高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，能切割與識(shí)別序列相似的序列。所以一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。

星號(hào)（*）活性4.緩沖液(Buffer)溫度、離子強(qiáng)度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專一性39EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8）時(shí)可識(shí)別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的時(shí)候要特別注意！EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>840EcoRI在正常條件下識(shí)別并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時(shí)，也可切割5‘AATT3’或者5‘PuPuATPyPy3’。使用的時(shí)候要特別注意！EcoRI在正常條件下識(shí)別并切割5‘GAATTC3’序41（五）限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA的消化1.內(nèi)切酶與識(shí)別序列的結(jié)合模式1986年J.A.McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)II類限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。GAATTCCTTAAG（五）限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA的消化1.內(nèi)切酶與識(shí)別序列的結(jié)合42內(nèi)切酶在DNA上的所有識(shí)別位點(diǎn)都被切開。2.完全消化12341234內(nèi)切酶在DNA上的所有識(shí)別位點(diǎn)都被切開。2.完全消化43只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開。通過縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。3.局部消化123414只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開。通過縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度44大多數(shù)酶可用65oC溫育5分鐘失活?；蛴靡掖汲恋鞤NA。4.限制酶酶切反應(yīng)的終止5.幾種常用限制酶識(shí)位點(diǎn)大多數(shù)酶可用65oC溫育5分鐘失活。4.限制酶酶切反應(yīng)的45（一）功能：保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶切割。二、甲基化酶（一）功能：保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶切割。二、甲基化46在大腸桿菌中大多數(shù)都有如下位點(diǎn)特異的甲基化酶。（二）甲基化酶的種類Dam甲基化酶GATC，A-N6甲基腺嘌呤BamHⅠ:GGATCCDcm甲基化酶CCAGG，CCTGG,C-5甲基胞嘧啶EcoRⅡ：CCAGG

在大腸桿菌中大多數(shù)都有如下位點(diǎn)特異的甲基化酶（三）甲基化對(duì)限制酶切的影響基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株。

如果限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)是從表達(dá)Dam或Dcm甲基化酶的菌株中分離而得，并且其甲基化識(shí)別位點(diǎn)與內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)有重疊，那么該限制性內(nèi)切酶的部分或全部酶切位點(diǎn)有可能不被切割。修飾酶切位點(diǎn)（三）甲基化對(duì)限制酶切的影響基因工程中必須使用甲基化酶失活三、DNA連接酶(DNAligase)

1、定義

催化雙鏈DNA片段靠在一起的3`-OH末端和5`-P末端形成3`,5`-磷酸二酯鍵，使兩末端連接的一種核酸酶。三、DNA連接酶(DNAligase)

1、定義OHP5`3`3`5`5`3`3`5`DNAligaseDNAligase連接缺刻(nick)OHP5`3`5`3`DNAligaseDNAl502、種類（1）大腸桿菌連接酶只能連接粘性末端。（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。依據(jù)來源可分為兩類:2、種類（1）大腸桿菌連接酶只能連接粘性末端。（2）T4噬菌1)修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵。3、DNA連接酶的基本性質(zhì)nickOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C

…5’POHnickDNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’1)修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵。3、DNA連接酶的522)修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-G-C-C-T-C…5’PnickOHT4-DNA連接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’2)修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵5‘533)連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C…5’T4-DNA連接酶5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’3)連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A54Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr4、DNA連接酶的反應(yīng)條件1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小時(shí)，完全連接1mgλ-DNA（HindIII片段）所需的酶量。Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl55（1）必須是兩條雙鏈DNA。不能催化兩單鏈DNA分子連接；只能連雙鏈DNA分子的單鏈缺刻(nick)；不能連接雙鏈中一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失所致缺(gap)。連接條件（1）必須是兩條雙鏈DNA。連接條件DNAligase的活性DNAligase的活性（2）DNA3’端有游離的-OH，5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。（3）需要能量動(dòng)物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+連接條件（2）DNA3’端有游離的-OH，（3）需要能量動(dòng)物或噬菌連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。連接反應(yīng)的溫度最佳溫度在37℃下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。實(shí)用溫度所以一般采用4~16C。連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。連接反應(yīng)的溫度最佳溫度在374、平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多。提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用加入單價(jià)陽(yáng)離子（NaCl），最終濃度150-200mM4、平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制60（一）基因工程中常用的DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T4噬菌體DNA聚合酶4.T7噬菌體DNA聚合酶5.耐熱DNA聚合酶6.反轉(zhuǎn)錄酶7.末端轉(zhuǎn)移酶四、DNA聚合酶（一）基因工程中常用的DNA聚合酶：四、DNA聚合酶1.共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。2.主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個(gè)dNTPs就會(huì)從模板上解離下來。（二）常用的DNA聚合酶的特點(diǎn)持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。1.共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。2.（三）DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶I（1）大腸桿菌DNA聚合酶I的性質(zhì)①一條單鏈多肽。⑤

5’3’外切酶活性位于N端。用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。就成為Klenowfragment。②5’3’DNA聚合酶活性。③5’3’外切酶活性

④

3’5’外切酶活性（三）DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③

帶有3’-OH游離端的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）的反應(yīng)條件-OH5’

3’

dNTPs①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP標(biāo)記①

核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標(biāo)記的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制備探針已知序列的核酸片斷顯示位置與互補(bǔ)的待測(cè)序列雜交標(biāo)記①核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異標(biāo)記已知序列的核酸片斷②探針的標(biāo)記方式標(biāo)記已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5’

3’

標(biāo)記已知序列的核酸片斷②探針的標(biāo)記方式標(biāo)記已知序列的核酸片③DNA聚合酶I對(duì)探針序列的標(biāo)記切口轉(zhuǎn)移法(nicktranslation)：放射性同位素標(biāo)記：DNA聚合酶I同時(shí)具備5’3’外切酶活性和5’3’的聚合酶活性（以及3’5’外切酶活性）。③DNA聚合酶I對(duì)探針序列的標(biāo)記切口轉(zhuǎn)移法(nickt5’3’外切酶活性從DNA切口的下一段DNA的5’端除去一個(gè)核苷酸后，聚合酶活性就會(huì)在切口的上一段DNA的3’一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸。切口切口5’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

5’3’外切酶活性從DNA切口的下一段DNA的5’端除去一純化的DNA片段DNaseI制造單鏈切口DNAPolI進(jìn)行切口轉(zhuǎn)移一種-32P-dNTPdNTPs5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標(biāo)記純化的DNA片段DNaseI制造單鏈切口DNAPol2.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性質(zhì)DNAPolIKlenowfragment(76KD）枯草桿菌蛋白酶2.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性①3’端補(bǔ)平5’

5’

klenow②DNA3’末端標(biāo)記補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。在3’隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。klenow（2）主要用途①3’端補(bǔ)平5’5’klenow②DNA3’末端標(biāo)3’隱蔽末端的DNA片段Klenowfragment補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇一種

-32P-dNTPs末端標(biāo)記的DNA

限制性內(nèi)切酶切5’----G3’

3’----CTTAA5’

5’----GAA3’

3’----CTTAA5’

5’----GAATT3’

3’----CTTAA5’

5’----G3’

3’----CCTAG5’

5’----GG3’

3’----CCTAG5’

5’----GGATC3’

3’----CCTAG5’

EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h3’隱蔽末端的DNA片段Klenowfragment補(bǔ)平根③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow5’

3’

3’

5’

5’

3’

引物③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA（1）T4DNA聚合酶的性質(zhì)3.T4DNA聚合酶從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由噬菌體基因43編碼。有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（約為Klenow片段活性的200倍）。①來源②酶活性（1）T4DNA聚合酶的性質(zhì)3.T4DNA聚合酶從T③特點(diǎn)當(dāng)沒有dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隱蔽端。如果只有一種dNTP，則外切至該dNTP互補(bǔ)核苷酸暴露時(shí)停止。在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位。③特點(diǎn)當(dāng)沒有dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶行使3’5’外切5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶無dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA（2）T4DNA聚合酶的用途標(biāo)記末端（取代合成法）用3’5’外切酶活性作用于所有末端（平端、3’隱蔽端、5’隱蔽端）制造出3’隱蔽端。再利用它的5’3’聚合酶活性補(bǔ)平，并加入放射性標(biāo)記的dNTP。①補(bǔ)平3’隱蔽末端②DNA3’末端標(biāo)記（2）T4DNA聚合酶的用途標(biāo)記末端（取代合成法）用3’酶切中間產(chǎn)生兩個(gè)末端標(biāo)記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’5’外切）DNA酶切片段T4DNA聚合酶（5’3’聚合）5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

內(nèi)切酶切無dNTPs酶切中間產(chǎn)生兩個(gè)末端標(biāo)記加入某種32P-dNTP和dNTPs4.T7DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來的，由兩個(gè)亞基組成：①T7基因5編碼的大亞基：有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。②大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白。增加大亞基對(duì)模板的親和性。4.T7DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)（2）T7DNA聚合酶的特點(diǎn)①持續(xù)合成能力強(qiáng)一旦與模板結(jié)合就會(huì)不間斷地合成互補(bǔ)鏈。②3’5’外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。約為Klenow片段活性的1000倍。③不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響其它DNA聚合酶受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的阻礙（2）T7DNA聚合酶的特點(diǎn)①持續(xù)合成能力強(qiáng)一旦與模板結(jié)②進(jìn)行末端標(biāo)記①

以大分子量DNA為模板的合成如M13③補(bǔ)平隱蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法標(biāo)記3’末端。與T4DNA聚合酶相同。合成補(bǔ)平3’隱蔽末端；水解修平3’突出末端。②進(jìn)行末端標(biāo)記①以大分子量DNA為模板的合成如M13③5.耐熱DNA聚合酶指在高溫下具有活性的DNA聚合酶，主要用于PCR反應(yīng)。5.耐熱DNA聚合酶指在高溫下具有活性的DNA6.逆轉(zhuǎn)錄酶最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶）。（1）來源RNA腫瘤病毒。（2）禽源反轉(zhuǎn)錄酶的性質(zhì)由和兩條多肽鏈組成。6.逆轉(zhuǎn)錄酶最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（av①鏈有反轉(zhuǎn)錄活性和RNaseH活性。RNaseH：以5’3’或3’5’方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。RNaseHRNADNARNADNA②鏈RNA-DNA雜交雙鏈中5’3’DNA外切酶活性。①鏈有反轉(zhuǎn)錄活性和RNaseH活性。RNaseH：R（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途①

合成cDNA以oligodT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補(bǔ)結(jié)合）。AAAAATTTTT5’

3’

mRNA5’

cDNA（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途①合成cDNA以oligodT為引物②

合成DNA探針用隨機(jī)引物（randomprimer）或oligodT做引物。隨機(jī)引物：隨機(jī)順序形成的寡聚DNA片斷。（理論上它能與各種序列的模板結(jié)合）③RT-PCR用的模板克隆某個(gè)基因時(shí)，用其mRNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈。②合成DNA探針用隨機(jī)引物（randomprimer）或7.末端轉(zhuǎn)移酶來源于小牛胸腺，是一種不依賴于模板的DNA聚合酶?？稍赾DNA或載體的3’末端加同聚物尾巴，便于克隆。7.末端轉(zhuǎn)移酶來源于小牛胸腺，是一種不依賴于模板的D末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）不需要模板的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNTPs5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTMg2+dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）不需要模板的DNA聚合酶，隨機(jī)TdT的基本特性：5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTCo2+dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTCo2+dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘AAAAAAAAAAATdT的基本特性：5‘p3‘HOOH3‘p5‘五、T4多核苷酸激酶1.來源T4噬菌體的pseT基因編碼。從T4感染大腸桿菌細(xì)胞中分離出來。多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。2.功能催化磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5’-OH端。不論5’-OH端突出與否。五、T4多核苷酸激酶1.來源T4噬菌體的pseT基因編碼。5’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的磷酸帶有32P標(biāo)記，就會(huì)被轉(zhuǎn)移到DNA的5’端。但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--3.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、標(biāo)記DNA的5’端。5’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH3’

32P--OH5’

3’

HO--32P5’

(-32P)ATP多核苷酸激酶3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

堿性磷酸酶（1）正向反應(yīng)（forwardreaction）3.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、標(biāo)記DN（2）交換反應(yīng)標(biāo)記法反應(yīng)混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP時(shí)，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P與DNA5’端的磷酸交換。3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

3’

32P--OH5’

3’

HO--32P5’

(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反應(yīng)效果不理想。（2）交換反應(yīng)標(biāo)記法反應(yīng)混合物中具有超量(-32P)ATP六、堿性磷酸酶1.堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）細(xì)菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP從小牛腸中純化出來。具有抗熱性。SDS中加熱68oC可完全失活。六、堿性磷酸酶1.堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。Ba2.堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

5’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH堿性磷酸酶3.堿性磷酸酶的功能（1）防止線性化的載體分子自我連接2.堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A堿性磷酸酶5’

5’

5’

單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTTHinA-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能與脫磷酸的載體OH連接。A-OHHO-AGCTTOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所ATTCGA

AGCTTAAGCTTA

ATTCGA

連接酶-OH與-OH連不住其中每條鏈上都有一個(gè)nick，但轉(zhuǎn)入細(xì)菌后會(huì)被修復(fù)。3’

P-AGCTTA-OH5’

3’

HO-ATTCGA-P5’

外源DNAAAGCTTAGCTTAATTCGA連接酶-OH與-七、核酸酶1、單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）能夠從5′-末端或3′-末端呈單鏈狀態(tài)的DNA分子上降解DNA，產(chǎn)生出寡核苷酸短片段，而且是唯一不需要Mg2+離子的活性酶，是一種耐受性很強(qiáng)的核酸酶。它只切割末端有單鏈突出的DNA分子。ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’七、核酸酶1、單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII2、雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）ExoIII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大腸桿菌的核酸外切酶III特異性地從3‘端外切2、雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）Exo3、單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性：來自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）Zn2+必需最適pH范圍為4.0-4.3需要NaCl10-300mM降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍3、單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性：來自稻谷單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切單鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C

T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切單鏈DN單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切帶切口或缺刻的雙鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-CA-C-C-T-C-A…5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切帶切口或4、單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基本用途：誘發(fā)DNA突變EcoRIABCEcoRIEcoRIBCABal31BCA環(huán)化AC4、單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsA:對(duì)單鏈DNAorRNA的活性Ca2+Ca2+對(duì)B:對(duì)帶缺口和裂口的雙鏈DNAorRNA的活性C:對(duì)雙鏈DNA末端的活性Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsA:對(duì)單鏈D小結(jié)一、限制性核酸內(nèi)切酶二、甲基化酶三、DNA連接酶四、基因工程中常用的DNA聚合酶：1.大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T4噬菌體DNA聚合酶4.T7噬菌體DNA聚合酶5.耐熱DNA聚合酶6.反轉(zhuǎn)錄酶7.末端轉(zhuǎn)移酶五、T4多核苷酸激酶六、堿性磷酸酶七、核酸酶小結(jié)2、雙鏈核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo）lExo3’5’3’5’Mg2+l核酸外切酶特異性地從5‘端外切3’5’3’5’2、雙鏈核酸外切酶：lExo3’5’3’5’Mg2+l核酸外a.放射性標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)：制作簡(jiǎn)單高比放射性放射自顯影效果好優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：半衰期短（32P只有14.3天）不易保存對(duì)人體有害要求在專門實(shí)驗(yàn)室操作a.放射性標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)：制作簡(jiǎn)單優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：半衰期短（3b.非放射性標(biāo)記i）生物素標(biāo)記：生物素（biotin），又稱維生素H、輔酶R可以與dNTP?；Y(jié)合成為生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素連接酶（biotinligase）催化與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。b.非放射性標(biāo)記i）生物素標(biāo)記：生物素（biotin），又純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈缺口DNAPolI進(jìn)行缺口轉(zhuǎn)移生物素-dTTP和dNTPs

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口轉(zhuǎn)移法將生物素?fù)饺隓NA探針中純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈缺口DNAPol演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！第二節(jié)工具酶

第二節(jié)工具酶112切接轉(zhuǎn)檢增完整的基因克隆過程切接轉(zhuǎn)檢增完整的基因克隆過程113（一）基本知識(shí)一、限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease,RE）1、定義：指一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某特種特定核苷酸序列（4—8bp），并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。（一）基本知識(shí)一、限制性核酸內(nèi)切酶（Restriction1142、來源:原核生物細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）限制性核酸內(nèi)切酶111EcoliC10-4110-4EcoliB10-410-41EcoliKλCλBλKEcoli菌株λ噬菌體感染率2、來源:原核生物細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）限制性核115RE將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。（1）限制（Restriction）RE將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。（1）限制（Res116細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割。（2）修飾（Modification）細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的1173.性質(zhì):內(nèi)切酶,在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶×√3.性質(zhì):內(nèi)切酶,在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。內(nèi)切酶限制1184.功能:自我保護(hù)作用限制性核酸內(nèi)切酶細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）

111EcoliC10-4110-4EcoliB10-410-41EcoliKλCλBλKEcoli菌株λ噬菌體感染率4.功能:自我保護(hù)作用限制性核酸內(nèi)切酶細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（119I型限制性內(nèi)切酶目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。（二）限制性內(nèi)切酶的類型II類限制性內(nèi)切酶III類限制性內(nèi)切酶I型限制性內(nèi)切酶目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)120首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿菌B株和K株分離的。（1）酶結(jié)構(gòu)1.I型限制性內(nèi)切酶如EcoB和EcoK。三亞基雙功能酶：R:限制酶亞基M:甲基化酶亞基S:識(shí)別DNA序列亞基首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大121（2）識(shí)別位點(diǎn)序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I型限制性內(nèi)切酶未甲基化修飾的特異序列。（2）識(shí)別位點(diǎn)序列EcoB：TGA(N)8TGCT1.122需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（4）作用機(jī)理在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約1000—1500bp處隨機(jī)切開一條單鏈。Recognizesitecut1-1.5kb（3）切割位點(diǎn)需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（4）作用機(jī)理123類型Ⅰ：大型的多亞基的蛋白質(zhì)。具有內(nèi)切酶的活性、具有甲基活性化酶的活性。具限制和修飾兩種體系，切割位點(diǎn)基本上是隨機(jī)。因此Ⅰ型內(nèi)切酶在DNA重組研究工作中并沒有什實(shí)際用處。類型Ⅰ：大型的多亞基的蛋白質(zhì)。124首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。（1）酶結(jié)構(gòu)相反方向結(jié)合的同源二聚體內(nèi)切酶與甲基化酶分開2.II類限制性內(nèi)切酶分離的第一個(gè)酶是HindⅡ首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970125（2）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文對(duì)稱序列--旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列，反向重復(fù)序列）。與DNA的來源無關(guān)。2.II類限制性內(nèi)切酶EcoRI：5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’（2）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多126EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

產(chǎn)生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產(chǎn)生平齊末端（3）切割位點(diǎn)切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：識(shí)別位點(diǎn)處。EcoRI5’-GAATTC-3’EcoRV127（4）粘性末端含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：①5’端凸出（如EcoRI切點(diǎn)）GAATTC

CTTAA

GGAATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’（4）粘性末端含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：①5’128CTGCAG

②3’端凸出（如PstI切點(diǎn)）GACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG

GACGTCCTGCAG②3’端凸出（如PstI切點(diǎn)）GACG129①連接便利粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。①連接便利粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿130DNA重組克隆的單元操作課程課件131③補(bǔ)平成平齊末端凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端標(biāo)記凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。③補(bǔ)平成平齊末端凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚132識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同稱同裂酶。①同裂酶（Isoschizomers)：如HindⅢ和HsuIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’（5）II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同稱同裂酶。①同裂酶（IsoschizXmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

如XmaI和SmaI②同位酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。（5）II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式XmaI5’-CCCGGG-3’如Xma

同尾酶(Isocaudamers）識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端的酶。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’

BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。（5）II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式同尾酶(Isocaudamers）識(shí)別的序列不5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來的酶識(shí)別。5’-G3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’

BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’

BamHIBglⅡSau3A5’-GATC----3’Sau3A同尾（6）II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1mg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量（6）II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作大部分II型核137II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切，但應(yīng)注意：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATG3‘…CGATGTACCTAGGATCCCGGGTTCGCAT…3’

GGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCC3‘…CGATGTACCTAGGGGGGTTCGCAT…3’CCCAAGCGTA…5’BamHI

SmaIII型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則138對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切0.1倍體積的5MNaAcpH5.42.5倍體積的冰冷乙醇冰浴5分鐘、高速冷凍離心10分鐘、干燥對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，1393.III類限制性內(nèi)切酶二亞基雙功能酶，也有專一的識(shí)別順序，在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但反應(yīng)需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸），這幾個(gè)核苷酸對(duì)也不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此也不能應(yīng)用于基因克隆。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG3.III類限制性內(nèi)切酶二亞基雙功能酶，也有專一的識(shí)別順140異源三聚體ATPMg2+SAMTGAN8TGCT距識(shí)別序列1kb處AACN6GTGC隨機(jī)性切割限制性核酸內(nèi)切酶的類型主要特性I型II型III型限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識(shí)別序列切割位點(diǎn)多功能同源二聚體Mg2+旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列單功能識(shí)別序列內(nèi)或附近特異性切割雙功能異源二聚體ATPMg2+SAMAGACCCAGCAG距識(shí)別序列下游24-26bp處異源三聚體ATPMg2+SAMTGAN8TGCT距識(shí)別序1411973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：（三）限制性內(nèi)切酶的命名用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)字母的略語(yǔ)表示寄主菌的物種名。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。1973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名1424.

限制酶前面要帶上R（Restriction)，修飾酶前面要帶上M（Modification）。（現(xiàn)已省略）。2.

用一個(gè)右下標(biāo)的大寫字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoRI）。3.

如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcoRI，EcoRV。4.限制酶前面要帶上R（Restriction)，2.用143限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名HindIII

HindIIIHaemophilus

influenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名144DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會(huì)影響酶的活性。1.DNA的純度（四）影響限制性內(nèi)切酶活性的因素①純化DNA②加大酶的用量1mgDNA用10U酶③延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間④擴(kuò)大反應(yīng)體積（>20l）一般采取DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都145大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）?；蚬こ讨斜仨毷褂眉谆甘Щ钔蛔兊木辍４竽c桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2.DNA的甲基化程度146大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響。

大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等。

哺乳動(dòng)物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基。大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列147不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045253.溫度不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少148是影響限制酶活性的重要因素。4.緩沖液(Buffer)緩沖液的化學(xué)組成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強(qiáng)度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。是影響限制酶活性的重要因素。4.緩沖液(Buffer)149溫度、離子強(qiáng)度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專一性。如果改變反應(yīng)條件就會(huì)影響酶的專一性和切割效率，稱為星號(hào)（*）活性。如高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，能切割與識(shí)別序列相似的序列。所以一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。

星號(hào)（*）活性4.緩沖液(Buffer)溫度、離子強(qiáng)度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專一性150EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8）時(shí)可識(shí)別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的時(shí)候要特別注意！EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8151EcoRI在正常條件下識(shí)別并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時(shí)，也可切割5‘AATT3’或者5‘PuPuATPyPy3’。使用的時(shí)候要特別注意！EcoRI在正常條件下識(shí)別并切割5‘GAATTC3’序152（五）限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA的消化1.內(nèi)切酶與識(shí)別序列的結(jié)合模式1986年J.A.McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)II類限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。GAATTCCTTAAG（五）限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA的消化1.內(nèi)切酶與識(shí)別序列的結(jié)合153內(nèi)切酶在DNA上的所有識(shí)別位點(diǎn)都被切開。2.完全消化12341234內(nèi)切酶在DNA上的所有識(shí)別位點(diǎn)都被切開。2.完全消化154只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開。通過縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。3.局部消化123414只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開。通過縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度155大多數(shù)酶可用65oC溫育5分鐘失活?；蛴靡掖汲恋鞤NA。4.限制酶酶切反應(yīng)的終止5.幾種常用限制酶識(shí)位點(diǎn)大多數(shù)酶可用65oC溫育5分鐘失活。4.限制酶酶切反應(yīng)的156（一）功能：保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶切割。二、甲基化酶（一）功能：保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶切割。二、甲基化157在大腸桿菌中大多數(shù)都有如下位點(diǎn)特異的甲基化酶。（二）甲基化酶的種類Dam甲基化酶GATC，A-N6甲基腺嘌呤BamHⅠ:GGATCCDcm甲基化酶CCAGG，CCTGG,C-5甲基胞嘧啶EcoRⅡ：CCAGG

在大腸桿菌中大多數(shù)都有如下位點(diǎn)特異的甲基化酶（三）甲基化對(duì)限制酶切的影響基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株。

如果限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)是從表達(dá)Dam或Dcm甲基化酶的菌株中分離而得，并且其甲基化識(shí)別位點(diǎn)與內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)有重疊，那么該限制性內(nèi)切酶的部分或全部酶切位點(diǎn)有可能不被切割。修飾酶切位點(diǎn)（三）甲基化對(duì)限制酶切的影響基因工程中必須使用甲基化酶失活三、DNA連接酶(DNAligase)

1、定義

催化雙鏈DNA片段靠在一起的3`-OH末端和5`-P末端形成3`,5`-磷酸二酯鍵，使兩末端連接的一種核酸酶。三、DNA連接酶(DNAligase)

1、定義OHP5`3`3`5`5`3`3`5`DNAligaseDNAligase連接缺刻(nick)OHP5`3`5`3`DNAligaseDNAl1612、種類（1）大腸桿菌連接酶只能連接粘性末端。（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。依據(jù)來源可分為兩類:2、種類（1）大腸桿菌連接酶只能連接粘性末端。（2）T4噬菌1)修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵。3、DNA連接酶的基本性質(zhì)nickOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C

…5’POHnickDNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…