人類基因組計劃與基因測序

關于人類基因組計劃與基因測序第一頁，共三十九頁，2022年，8月28日人類基因組計劃基因測序基因組概述第二頁，共三十九頁，2022年，8月28日基因組概述DNA基因基因組第三頁，共三十九頁，2022年，8月28日DNA雙螺旋的發(fā)現——里程碑1953年，沃森和克里克提出了DNA雙螺旋結構,標志著生物科學的發(fā)展進入了分子生物學階段，使遺傳的研究深入到分子層次,“生命之謎”被打開,人們清楚地了解遺傳信息的構成和傳遞的途徑。第四頁，共三十九頁，2022年，8月28日基因——控制生物性狀的基本遺傳單位?；颍╣ene）：帶有遺傳訊息的DNA片段稱為基因。結構基因

外顯子（編碼序列)

內含子（非編碼序列)非結構基因

順式作用元件啟動子上游啟動子元件反應元件增強子沉默子Poly(A)加尾信號

反式作用因子基因分類第五頁，共三十九頁，2022年，8月28日基因組——完整的單倍體序列基因組（Genome）：指單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內的全部DNA分子。人類基因組（人類基因體）：是指人的基因組，由23對染色體組成，其中包括22對體染色體、1條X染色體和1條Y染色體。人類只有一個基因組，大約有2-3萬個基因。人類基因組含有約30億個DNA堿基對，第六頁，共三十九頁，2022年，8月28日人類基因組計劃人類基因組計劃概述目的與意義《人種自傳23章》遺傳圖譜第七頁，共三十九頁，2022年，8月28日人類基因組計劃——概述人類基因組計劃(humangenomeproject,HGP)：是由美國科學家于1985年率先提出，于1990年正式啟動的。美國、英國、法國、德國、日本和我國科學家共同參與了這一預算達30億美元的人類基因組計劃。意義：人類基因組計劃與曼哈頓原子彈計劃和阿波羅計劃并稱為三大科學計劃。被譽為生命科學的“登月計劃”。中國：中國于1999年9月積極參加到這項研究計劃中的，承擔其中1%的任務，即人類3號染色體短臂上約3000萬個堿基對的測序任務。中國因此成為參加這項研究計劃的唯一的發(fā)展中國家。第八頁，共三十九頁，2022年，8月28日人類基因組計劃——概述目的：揭開組成人體2.5萬個基因的30億個堿基對的秘密；方法：要發(fā)現所有的人類基因，找出它們在染色體上的位置，破譯人類全部遺傳信息，同時繪制出人類基因的圖譜。結果：2001年人類基因組工作草圖的發(fā)表（由公共基金資助的國際人類基因組計劃和私人企業(yè)塞雷拉基因組公司各自獨立完成，并分別公開發(fā)表）被認為是人類基因組計劃成功的里程碑。截止到2005年，人類基因組計劃的測序工作已經完成。意義：解碼生命、了解生命的起源、了解生命體生長發(fā)育的規(guī)律、認識種屬之間和個體之間存在差異的起因、認識疾病產生的機制以及長壽與衰老等生命現象、為疾病的診治提供科學依據。第九頁，共三十九頁，2022年，8月28日1號染色體——生命。講生命的誕生，來源。2號染色體——物種。人類發(fā)展和近親之間的分別。3號染色體——歷史。孟德爾以及其他科學家在遺傳學上做出的貢獻。4號染色體——命運。你的命運完全在你的基因里。5號染色體——環(huán)境。推翻讓讀者覺得基因是簡單的分割開來的。6號染色體——智慧?；虻拇嬖诓皇菫榱酥虏〉?號染色體——本能。解釋行為遺傳學和進化心理學結論對人類的影響。8號染色體和9號染色體——X和Y染色體——沖突。性染色體，同性戀是否遺傳。8號染色體——自身利益?；蚪M97%都不是真正的基因?；蛑讣y測試技術。9號染色體——疾病。解釋了血型的不同以及基因對疾病的抵抗力。10號染色體——壓力。外部事件對基因的影響。11號染色體——個性。性格的天生以及后天對性格的影響。12號染色體——自我組裝?；蚴蔷幹坪玫囊贿B串程序，自我運行功能。13號染色體——史前。你知道你為什么能消化牛奶?你祖宗幾千里以前就學會了“偷奶”。14號染色體——永生。壽命長短實在不好說。萬一哪個基因調皮一下，你就掛了。15號染色體——性別。你出生真不是自個兒決定的事，是男是女，你爸媽也沒法決定。16號染色體——記憶。想知道為嘛你記東西老是學完就忘么。17號染色體——死亡。癌癥啊!癌癥啊!18號染色體——歷史。基因工程這玩意兒。19號染色體——預防。你又想知道，你又不想知道。20號染色體——政治。無知導致的悲劇。21號染色體——優(yōu)化人種論。優(yōu)化人種的歷史和現在遺留下來的歧視。22號染色體——自由意志。休謨之叉：我們的行為要么是事先已經被決定了的，這樣我們就不必為它們負責;要么是偶然事件的結果，這樣我們也不必為它們負責。人種自傳23章第十頁，共三十九頁，2022年，8月28日人類基因組計劃——四大遺傳圖譜

轉錄圖譜遺傳圖譜物理圖譜序列圖譜第十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日遺傳圖譜：又稱連鎖圖譜（linkagemap），它是以具有遺傳多態(tài)性（在一個遺傳位點上具有一個以上的等位基因，在群體中的出現頻率皆高于1%）的遺傳標記為“路標”，以遺傳學距離（在減數分裂事件中兩個位點之間進行交換、重組的百分率，1%的重組率稱為1cM）為圖距的基因組圖。第十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日物理圖譜：是利用限制性內切酶將染色體切成片段，再根據重疊序列確定片段間連接順序，以及遺傳標志之間物理距離堿基對(bp)或千堿基(kb)或兆堿基(Mb)的圖譜。第十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日序列圖譜（sequencemap）：序列分析采用一個區(qū)域的DNA序列重疊群使測序工作不斷延伸，使用其中的序列標記位點STS作為兩個片段間的重疊區(qū)域，使分別被測序的短序列進行正確的拼接，最后獲得DNA全序列圖譜。第十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日轉錄圖譜（transcriptomemap）：是在識別基因組所包含的蛋白質編碼序列的基礎上繪制的結合有關基因序列、位置及表達模式等信息的圖譜。在人類基因組中鑒別出占具2%~5%長度的全部基因的位置、結構與功能，最主要的方法是通過基因的表達產物mRNA反追到染色體的位置。第十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日基因測序——觸手可及第十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日測序技術DNA測序：是對DNA分子的一級結構的分析。意義：分析基因組核苷酸排列序列分析基因序列基因定點誘變的基礎基因工程載體構建中DNA序列定位和排序的基礎確定DNA序列中蛋白質的編碼區(qū)歷程：第一代測序技術：雙脫氧鏈終止法、化學降解法第二代測序技術：焦磷酸測序、連接酶測序第三代測序技術：單分子熒光測序第四代測序技術：納米孔測序第十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日測序技術——發(fā)展歷程第十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日第一代測序技術第一代測序技術的主要特點：優(yōu)點：測序讀長可達1000bp，準確性高達99.999%，從頭測序，從頭組裝缺點：測序成本高，通量低，難以大規(guī)模的應用第十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日第一代測序技術——雙脫氧鏈末端終止法原理：由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應，在4個DNA合成反應體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列缺點：1、測定步驟繁瑣。一個步驟重復四次，因此需要大量相同的DNA

拷貝，樣本需求量大；2、不能測定太長的DNA

序列。意義：Sanger測定了第一個基因組序列，是噬菌體X174的，全長5375個堿基。自此，人類獲得了窺探生命遺傳差異本質的能力，并以此為開端步入基因組學時代。在2001年，完成的首個人類基因組圖譜就是以改進了的Sanger法為其測序基礎。第二十頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日第一代測序技術——化學降解測序法原理：先對待測DNA末端進行放射性標記，再通過4-5組相互獨立的化學反應分別得到部分降解產物，其中每一組反應特異性地針對某一種或某一類堿基進行切割。因此，產生4-5組不同長度的放射性標記的DNA片段，每組中的每個片段都有放射性標記的共同起點，但長度取決于該組反應針對的堿基在原樣品DNA分子上的位置。此后各組反應物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，通過放射自顯影檢測末端標記的分子，并直接讀取待測DNA片段的核苷酸序列。第二十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二代測序技術特點：大大降低了測序成本的同時，大幅提高了測序速度，持了高準確性，序列讀長方面起第一代測序技術則要短很多。第二十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二代測序技術——Roche454測序系統(tǒng)DNA文庫制備：

利用噴霧法將待測DNA打斷成300-800bp長的小片段，并在片段兩端加上不同的接頭，或將待測DNA變性后用雜交引物進行PCR擴增，連接載體，構建單鏈DNA文庫。第二十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二代測序技術——Roche454測序系統(tǒng)EmulsionPCR（乳液PCR，其實是一個注水到油的獨特過程）：

將這些單鏈DNA結合在水油包被的直徑約28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。乳液PCR最大的特點是可以形成數目龐大的獨立反應空間以進行DNA擴增。第二十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二代測序技術——Roche454測序系統(tǒng)焦磷酸測序：

測序反應以磁珠上大量擴增出的單鏈DNA為模板，每次反應加入一種dNTP進行合成反應。如果dNTP能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸基團。釋放的焦磷酸基團會與反應體系中的ATP硫酸化學酶反應生成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測序反應中的熒光素分子并發(fā)出熒光，同時由PTP板另一側的CCD照相機記錄，最后通過計算機進行光信號處理而獲得最終的測序結果。第二十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二代測序技術——Illumina邊合成邊測序過程：DNA待測文庫構建：超聲波打斷為200-500bp序列片段，并添加接頭；Flowcell，吸附流動DNA片段橋式PCR擴增與變性：堿基的信號強度放大測序：原理同Sanger第二十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二代測序技術——Solid技術DNA文庫構建：片段打斷并在兩端加上測序接頭，連接載體，構建單鏈DNA文庫。EmulsionPCR：小水滴emulsionPCR，微珠只有1um。在擴增的同時對擴增產物的3’端進行修飾，這是為下一步的測序過程作的準備。3’修飾的微珠會被沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個、4個或8個測序區(qū)域。第二十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二代測序技術——Solid技術連接酶測序：沒有采用DNA聚合酶，而采用了連接酶。其底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，將其表示為：3’-XXnnnzzz-5’。探針的5’末端分別標記了CY5、TexasRed、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料。這個8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的，并根據種類的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的熒光標記。這是Solid的獨特測序法，兩個堿基確定一個熒光信號，相當于一次能決定兩個堿基。這種測序方法也稱之為兩堿基測序法。第二十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日第三代測序技術——單分子測序技術案例：PacificBiosciences公司RS系統(tǒng)特點：

不需要PCR擴展，消除了潛在的擴展錯誤和不均勻。可以直接閱讀RNA的序列。例如：Helicos直接使用RNA反轉錄酶，邊RNA反轉錄合成邊測序。

可以直接閱讀包括甲基化在內的DNA修飾。例如：Pacbio使用甲基化和非甲基化堿基的合成速率上的差異來進行區(qū)分。

讀長更長。PacBio系統(tǒng)可以測到1000bp以上。速度更快。第三十頁，共三十九頁，2022年，8月28日第三代測序技術——PacBioSMRT技術原理：對零模波導中的單個熒光分子進行高靈敏度檢測，從而快速獲得DNA序列信息。DNA聚合酶和模板結合,4色熒光標記4種堿基（即是dNTP）,在堿基配對階段,不同堿基的加入,會發(fā)出不同光,根據光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。同時這個DNA聚合酶是實現超長讀長的關鍵之一,讀長主要跟酶的活性保持有關,它主要受激光對其造成的損傷所影響。第三十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日第四代測序技術——納米孔測序技術原理：分子在通過納米孔道時，會對通過納米孔的電流，或橫穿過納米孔的電流（隧穿電流）產生影響，而每種不同的分子通過時，對電流產生的影響具有可區(qū)別的差異。于是利用這種差異，納米孔測序技術就可以識別基因中堿基（對）的排列順序。第三十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日第四代測序技術——納米孔測序技術特點：物理方法，無需生物化學預處理，直接對DNA進行讀?。徽嬲龑崿F單分子檢測和電子傳導檢測相結合的測序方法；完全擺脫了洗脫過程、PCR擴增過程；成本低廉：最有希望實現1000美元基因組甚至100美元基因組的技術，超高讀長；高通量；易集成，小型化；速度快，測序時間更少；數據分析更為簡單；實現