游離氨基酸總量的測(cè)定

游離氨基酸總量的測(cè)定一、目的要求掌握利用茚三酮顯色法測(cè)定果蔬組織中游離氨基酸總量的方法。二、基本原理氨基酸（Aminoacid，AA）是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物的種類之一。游離氨基酸與果蔬品質(zhì)和特殊風(fēng)味的呈現(xiàn)有關(guān)。在果蔬的生長(zhǎng)發(fā)育、成熟衰老過程中，游離氨基酸含量的變化與果蔬組織生理生化代謝密切相關(guān)。測(cè)定果蔬組織中游離氨基酸的含量對(duì)于研究果實(shí)采后生理、氮素代謝及營(yíng)養(yǎng)狀況等具有重要意義。常用茚三酮顯色法測(cè)定果蔬組織中游離氨基酸總量（Freeaminoacidcontent）。在酸性條件下，氨基酸與茚三酮共熱時(shí)，能定量地生成顯示藍(lán)紫色的產(chǎn)物二酮茚胺，稱為Ruhemans紫。該產(chǎn)物吸收峰在波長(zhǎng)570nm處有吸收峰，而且在一定范圍內(nèi)吸光度值與氨基酸濃度成正比。因此，可用分光光度計(jì)法測(cè)定其含量。氨基酸與茚三酮的反應(yīng)分兩步進(jìn)行。第一步，氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步，所形成的還原型茚三酮與另一個(gè)茚三酮分子和一分子氨脫水縮合生成二酮茚–二酮茚胺（Ruhemans紫），反應(yīng)式如下：

水合茚三酮氨基酸還原型茚三酮醛類水合茚三酮還原型茚三酮二酮茚–二酮茚胺（Ruhemans紫）三、材料、儀器及試劑（一）材料桃、青椒、香菜、蘆筍等果蔬。（二）儀器及用具分光光度計(jì)、研缽、水浴鍋、錐形瓶、電子天平、容量瓶（25mL或50mL）；漏斗、濾紙、具塞刻度試管（20mL）、容量瓶（50mL、100mL）、燒杯、移液器、玻璃棒、吸水紙、擦鏡紙、電爐、水浴鍋（帶鐵絲筐）。（三）試劑1．水合茚三酮試劑稱取0.6g重結(jié)晶的茚三酮，置于燒杯中，加入15mL正丙醇，攪拌使茚三酮溶解。再加入30mL正丁醇及60mL乙二醇，最后加入9mLpH5.4的乙酸–乙酸鈉緩沖液，混勻，貯于棕色瓶，置4℃下保存?zhèn)溆茫?0天內(nèi)有效。2．pH5.4乙酸–乙酸鈉緩沖液稱取54.4g乙酸鈉加入100mL無氨蒸餾水，在電爐上加熱至沸，使體積蒸發(fā)至60mL左右。冷卻后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中加30mL冰醋酸，再用無氨蒸餾水稀釋至100mL。3．標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液稱取46.8mg在80℃烘干的亮氨酸（分子量131.11），溶于少量10%異丙醇中，并用該溶液定容至100mL，混勻。取5mL該溶液，用蒸餾水稀釋至50mL，即1mL的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液含5μg的氨基氮。4．0.1%抗壞血酸溶液稱取50mg抗壞血酸，溶于50mL無氨蒸餾水中，隨配隨用。5．10%乙酸溶液6．95%乙醇四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支20mL具塞刻度試管，編號(hào)，按下表3加入各種試劑，蓋上玻璃塞，混勻。再在100℃水浴中加熱15min（加熱時(shí)封口），取出后立即置于冷水中迅速冷卻。然后迅速向每管中加入5.0mL95%乙醇，塞好塞子，猛搖試管，使加熱時(shí)形成的紅色產(chǎn)物被空氣中的氧所氧化而褪色，此時(shí)溶液呈藍(lán)紫色。然后用60%乙醇稀釋至20mL，以0號(hào)管為參比進(jìn)行調(diào)零，于波長(zhǎng)570nm處測(cè)定溶液的吸光度值。重復(fù)三次，以氨基氮的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線回歸方程。表3.制作游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線各試劑用量項(xiàng)目管號(hào)012345標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液/mL00.20.40.60.81.0無氨蒸餾水/mL2.01.81.61.41.21.0水合茚三酮試劑/mL3.03.03.03.03.03.0抗壞血酸溶液/mL0.10.10.10.10.10.1每管含氮量/μg012345（二）提取稱取1.0g果蔬組織樣品，置于研缽中，加入5.0mL10%乙酸，研磨勻漿后，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋、定容至刻度，混勻。然后用干濾紙過濾到三角瓶中備用。（三）測(cè)定吸取1.0mL樣品濾液，置于20mL干燥具塞刻度試管中，加入1.0mL無氨蒸餾水。其它操作步驟與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線方法相同。重復(fù)三次。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算1．將測(cè)定的數(shù)據(jù)填入下表重復(fù)次數(shù)樣品重量W(g)提取液總體積V(mL)吸取樣品液體積Vs(mL)570nm吸光度值由標(biāo)曲查得氨基氮量C(μg)游離氨基酸總量(mg/100gFW)計(jì)算值平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差1232．計(jì)算結(jié)果根據(jù)顯色液的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的氨基氮微克數(shù)。果蔬組織中游離氨基酸總量以每100g果蔬中氨態(tài)氮的毫克數(shù)表示，即mg/100gFW。計(jì)算公式：式中：C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的氨基酸（亮氨酸）的量，μg；V——樣品提取液總體積，mL；Vs——測(cè)定時(shí)所取樣品提取液體積，mL；W——樣品重量，g。六、注意事項(xiàng)1．茚三酮重結(jié)晶的方法合格的茚三酮應(yīng)該是微黃色結(jié)晶，若保管不當(dāng)，顏色加深或變成微紅色，必須重結(jié)晶后方可使用。其方法如下：將5g茚三酮溶于15mL熱蒸餾水中，加入0.25g活性炭，輕輕搖動(dòng)，溶液太稠時(shí)，可適量加水，30min后用濾紙過濾，濾液置冰箱中過夜后即可見微黃色結(jié)晶析出，用干濾紙過濾，再用1mL蒸餾水洗結(jié)晶一次，置于干燥器中干燥后貯于棕色瓶中。2．茚三酮與氨基酸反應(yīng)所生成的Ruhemans紫在未加入乙醇前不穩(wěn)定，故顯色反應(yīng)完畢冷卻時(shí)應(yīng)盡快加入95%乙醇稀釋。3．茚三酮試劑主要是多肽