免疫磁珠技術(shù)課件_第1頁(yè)
免疫磁珠技術(shù)課件_第2頁(yè)
免疫磁珠技術(shù)課件_第3頁(yè)
免疫磁珠技術(shù)課件_第4頁(yè)
免疫磁珠技術(shù)課件_第5頁(yè)
已閱讀5頁(yè),還剩32頁(yè)未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

免疫磁珠技術(shù)(IMB)在食品有害微生物檢測(cè)中的應(yīng)用資料搜集:武菁菁、張端莉、譚玉榮、周夢(mèng)柔PPT報(bào)告人:孫文靜目錄1免疫磁珠技術(shù)簡(jiǎn)介1.1免疫磁珠的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.2免疫磁珠技術(shù)2免疫磁珠技術(shù)的應(yīng)用2.1IMB技術(shù)在食品有害微生物檢測(cè)中的應(yīng)用2.2免疫磁珠與其它檢測(cè)手段的聯(lián)用2.3免疫磁珠技術(shù)在其他領(lǐng)域的應(yīng)用2.4免疫磁珠技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及發(fā)展方向1.免疫磁珠技術(shù)簡(jiǎn)介1.1免疫磁珠的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.1.1免疫磁珠的結(jié)構(gòu)

免疫磁珠(IMB),也稱免疫磁性微球,是一種均勻、具有超順磁性及保護(hù)性殼的球形小粒子,基本上由載體微球和免疫配基結(jié)合而成。其核心為順磁性粒子,核心外層包裹一層高分子料,最外層是免疫配基。

免疫配基

免疫配基通過(guò)生物高分子的功能基團(tuán)結(jié)合到磁性載體微球上形成免疫磁珠。由于載體微球制備材料和方法不同,其表現(xiàn)出的物理性質(zhì)也不同,從而可結(jié)合不同的免疫配基,如抗原、抗體、凝集素、DNA和RNA等。配基必須具有生物專一性的特點(diǎn),而且載體微球與配基結(jié)合要不影響或改變配基原有的生物學(xué)特性,保證磁珠的特殊識(shí)別功能。1.1.2免疫磁珠的性質(zhì)由于免疫磁珠的大小和形狀具有均一性,從而可使靶物質(zhì)迅速和有效地結(jié)合到磁珠上,也可使生成的新復(fù)合物在磁場(chǎng)中具有相同的磁響應(yīng)性,且行為一致磁珠的球形結(jié)構(gòu)可消除與不規(guī)則形狀粒子有關(guān)的非特異性結(jié)合順磁性可使磁珠置于磁場(chǎng)時(shí)顯示其磁性,并做定向移動(dòng),從磁場(chǎng)移出時(shí)磁性消除,磁珠分散,由此可方便地進(jìn)行分離和磁性導(dǎo)向保護(hù)性殼可防止磁性內(nèi)核漏出或被載液腐蝕;免疫配基可特異性地結(jié)合反應(yīng)體系中相應(yīng)的抗原、抗體、核酸等生物活性物質(zhì)。1.2免疫磁珠技術(shù)免疫磁珠(immunomagneticbead,IMB)技術(shù):是一種以特異的抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測(cè)和分離技術(shù)。它是以抗體包被的磁珠為載體,通過(guò)抗體與反應(yīng)介質(zhì)中特異性抗原結(jié)合,形成抗原—抗體復(fù)合物,此復(fù)合物在外加磁場(chǎng)的作用下發(fā)生定向移動(dòng),從而達(dá)到分離抗原的目的?;驹恚捍判晕⑶蚪?jīng)過(guò)一定處理后,可將抗體結(jié)合到磁珠上,形成免疫磁性微球,免疫磁性微球的抗體與特異性抗原結(jié)合形成抗原—微球復(fù)合物,該復(fù)合物在磁場(chǎng)中具有與其它組分不同的磁響應(yīng)性,在磁力作用下,該復(fù)合物發(fā)生力學(xué)移動(dòng),從而達(dá)到分離抗原的目的。以細(xì)胞分離為例圖解免疫磁珠技術(shù)的原理

2.1.1大腸桿菌O157的檢測(cè)傳統(tǒng)分離E.coliO157∶H7所采用的直接分離法存在著鑒別力差、抑制雜菌能力弱、耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大等缺點(diǎn)。采用免疫磁珠技術(shù),能夠快速地從各種食品樣品中分離富集E.coliO157∶H7,滿足流行病學(xué)的研究要求和提高控制力度?,F(xiàn)在這種免疫磁珠的方法已經(jīng)被英國(guó)公共健康服務(wù)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)定為標(biāo)準(zhǔn)的分離方法,我國(guó)也已將免疫磁珠法對(duì)大腸桿菌O157的檢測(cè)納入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T4789.36-2008)和出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T1059.5-2006)。增菌

免疫磁珠捕獲與分離

1.將Eppendorff管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號(hào),每個(gè)樣品使用1支Eppendorff管,然后插人到磁板架上。在漩渦混合器上輕輕振蕩E.coliO157免疫磁珠溶液后,用開(kāi)蓋器打開(kāi)每支Eppendorff管的蓋子,每管加人20μLE.coli0157免疫磁珠懸液。

2.取mEC+n肉湯增菌培養(yǎng)物1mL,加人到Eppendorff管中,蓋上蓋子,然后輕微振蕩10s。每個(gè)樣品更換1支加樣吸頭,質(zhì)控菌株必須與樣品分開(kāi)進(jìn)行,避免交叉污染。

具體操作步驟6.洗滌:洗滌免疫磁珠混合物。重復(fù)上述步驟

4~6。7.重復(fù)上述步驟4~5。8.免疫磁珠懸浮:將免疫磁珠重新懸浮在100μLPBS-Tween20洗液中。

9.涂布平板:用漩渦混合器將免疫磁珠混勻,用加樣器各取50μL免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157弧菌顯色瓊脂平板一側(cè),然后用無(wú)菌涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半,再用接種環(huán)劃線接種平板的另一半。待瓊脂表面水分完全吸收后,翻轉(zhuǎn)平板,于36℃士10℃培養(yǎng)18h---24h。菌落識(shí)別在CT-SMAC平板上,典型菌落為不發(fā)酵山梨醇的圓形、光滑、較小的無(wú)色菌落,中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色;發(fā)酵山梨醇的菌落為紅色;在改CHROMagar

O157弧菌顯色瓊脂平板上為圓形、較小的菌落,中心呈淡紫色一紫紅色,邊緣無(wú)色或淺灰色。

初步生化試驗(yàn):在CT-SMAC和改良CHROMagar

O157弧菌顯色瓊脂平板上挑取5個(gè)~10個(gè)典型或可疑菌落,分別接種TSI瓊脂,同時(shí)接種MUG-LST肉湯,于36℃士1℃培養(yǎng)18

h~24

h。必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。在TSI瓊脂中,典型菌株為斜面與底層均呈陽(yáng)性反應(yīng)呈黃色,產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣,不產(chǎn)生硫化氫(H2S)。置MUG-LST肉湯管于長(zhǎng)波紫外燈下觀察,無(wú)熒光產(chǎn)生者為陽(yáng)性結(jié)果,有熒光產(chǎn)生者為陰性結(jié)果;對(duì)分解乳糖且無(wú)熒光的菌株,在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分純,于36℃士1℃培養(yǎng)18

h~24

h,并進(jìn)行鑒定。大腸桿菌O157的檢測(cè)Fratamico等將兔抗E.coliO157∶H7多克隆抗體連接到羊抗兔IgG包被的磁珠上,從食物增菌培養(yǎng)液中分離O157∶H7菌株,再將帶菌的磁珠接種到培養(yǎng)基上,加入熒光素標(biāo)記的O157∶H7抗血清,在熒光顯微鏡下觀察,此法敏感性為10cfu/mL增菌培養(yǎng)液。Decory等建立了免疫磁珠-免疫脂質(zhì)體(IMB/IL)熒光試驗(yàn)方法,可在8h內(nèi)快速檢測(cè)出多種液態(tài)樣品(水樣、蘋果汁、蘋果酒)中低至1cfu/mL的E.coliO157∶H7,而傳統(tǒng)微生物學(xué)方法不能從陰性樣本中區(qū)分出E.coliO157∶H7感染樣本。

2.1.2單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)傳統(tǒng)的單增李斯特菌檢測(cè)方法檢測(cè)周期長(zhǎng),約5~14d,步驟繁瑣且靈敏度低,而IMB技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于在較低的菌液濃度時(shí)也可以通過(guò)免疫磁珠的富集作用進(jìn)行檢測(cè),縮短了檢測(cè)時(shí)間并進(jìn)一步降低了單增李斯特菌的檢測(cè)限。2008年,我國(guó)將免疫磁珠檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的方法納入了出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中(SN/T0184.3-2008)。檢樣25g(mL)對(duì)225mLFB1増菌液(30℃士1℃,24h士1h)1mL轉(zhuǎn)種10mLFB2増菌液(35℃,24h士1h)通過(guò)免疫磁珠捕獲李斯特菌,然后再用滅菌緩沖液洗滌用0.1mL的滅菌緩沖液重新制成懸液吸取50uL免疫磁珠懸液劃線于CHROMagar顯色培養(yǎng)基,OXA/PALCAM瓊脂平板(35℃+1℃,24h~28h)各挑選5個(gè)典型菌落接種于TSA-YE瓊脂平板,純培養(yǎng)鑒定和確認(rèn)試驗(yàn)單增李斯特菌的檢測(cè)方法

2)分離

將Eppendorf管固定在磁架的管孔中。1800輕緩擺動(dòng)磁架5次--6次,使免疫磁珠聚集到磁極。小心地打開(kāi)磁架上的Eppendorf管管蓋,從磁極對(duì)面一側(cè)慢慢吸出液體,注意不要接觸管壁上的磁珠。每一個(gè)樣品換一次槍頭;加1

mI滅菌的PBS

,并重新蓋好蓋子.將磁極從支架上移走,1800輕緩擺動(dòng)磁架5次一6次,使管內(nèi)各成分混合,后重新將磁極放回到支架上。重復(fù)該清洗步驟幾次。將離心管從磁性分離器上移開(kāi).并加100μL滅菌的PBS到管中,重懸磁珠。如果實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有磁性分離器.,可以用手搖代替.

4.分離培養(yǎng)

1)分離培養(yǎng)

吸取50μL免疫磁珠懸液.加到顯色培養(yǎng)基及任一選擇性培養(yǎng)基OXA、PALCAM瓊脂平板上.用無(wú)菌接種環(huán)劃線.35℃士1℃培養(yǎng)22h-48h。

2)篩選

李斯特氏菌在CHROMagar顯色培養(yǎng)基上菌落為藍(lán)色.且在其周圍形成一個(gè)暈環(huán)。李斯特氏菌在OXA瓊脂平板上生長(zhǎng)22

h后菌落呈現(xiàn)黑色.直徑為1mm.在其周圍形成一個(gè)黑色環(huán)。培養(yǎng)48h,菌落仍呈黑色.直徑2mm

--3mm.除在菌落周圍有一環(huán)外.在菌落中心部位的深層也形成黑點(diǎn)。李斯特氏菌在PALCAM瓊脂平板上與在()XA瓊脂平板上菌落相似。在CHROMagar顯色培養(yǎng)基及OXA或PALCAM瓊脂平板上挑取5個(gè)或更多可疑菌落.接種于TSA-YE瓊脂平板上.純培養(yǎng)后進(jìn)鑒定。

5.鑒定和確認(rèn)

2.1.3沙門氏菌的檢測(cè)例1:Notzon等用IMB-熒光PCR檢測(cè)肉類中的沙門氏菌,實(shí)驗(yàn)包括非選擇性增菌、免疫磁珠分離、DNA提取及PCR擴(kuò)增,12~13h即可完成檢測(cè)過(guò)程,IMB-熒光PCR在檢測(cè)自然感染肉類和人工感染肉類都具有較高的敏感性和特異性。例2:Blackburn等將用生物素標(biāo)記的抗沙門菌多價(jià)多克隆抗體連接到鏈霉親和素包被的磁珠上,以此試劑檢測(cè)從不同食物中提取的活沙門菌。此法的敏感性可達(dá)105cfu/g食物,總的檢測(cè)時(shí)間從5d減少至1~2d。IMB技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)IMB技術(shù)適用于各類食品基質(zhì)中的沙門氏菌的快速檢測(cè),能快速有效富集食品基質(zhì)中的目標(biāo)病原菌,且有良好的靈敏度和特異性,檢測(cè)限可達(dá)到1—10cfu/25g;在檢測(cè)時(shí)間方面可將常規(guī)檢測(cè)方法中的72小時(shí)檢測(cè)周期縮短至40小時(shí),而且能有效減輕過(guò)程交叉污染;篩選結(jié)果既可以與常規(guī)的細(xì)菌生化和血清學(xué)聯(lián)用,也可以和顯色培養(yǎng)基、熒光PCR以及微生物全自動(dòng)鑒定儀器等方法聯(lián)用,為食源性致病菌的檢測(cè)和鑒定提供了有效的快速篩選技術(shù)。2.1.5副溶血性弧菌的檢測(cè)Hara-Kudo等利用IMS和顯色培養(yǎng)基分離貝類中產(chǎn)TDH的副溶血性弧菌O3:K6。Datta等利用副溶血性弧菌ATCC17802制備針對(duì)極鞭毛的單克隆抗體,這將有益于快速檢測(cè)從環(huán)境來(lái)源的副溶血性弧菌。張凡非等利用IMS分離環(huán)境及食品中產(chǎn)生TDH副溶血性弧菌,分別從1份海水、1份海泥和3份蛤肉中檢出了神奈川現(xiàn)象陽(yáng)性,并產(chǎn)生耐熱溶血毒素的副溶血性弧菌,血清型為03:K6。IMB技術(shù)優(yōu)點(diǎn)該方法與一般的細(xì)菌培養(yǎng)分離法相比,極大地提高了環(huán)境樣品及食品中病原性副溶血性弧菌的檢出率。利用IMS可有效地吸附、濃縮大量樣品中的少量病原微生物,IMS為難于從環(huán)境及食品中分離病原性副溶血性弧菌的問(wèn)題提供一種有效手段。2.1.6 其他致病菌的檢測(cè)志賀氏菌例:Islam等應(yīng)用O抗原特異性單克隆抗體包被免疫磁珠,快速檢測(cè)糞便中的疾痢志賀菌和福氏志賀菌。分離出的志賀菌株用PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行鑒定。此種免疫磁珠分離與PCR聯(lián)合法檢測(cè)志賀菌,較傳統(tǒng)的培養(yǎng)法敏感、快速(7h)。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌例:Kapperud等用抗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血清抗體包被磁性微球,從食物和水樣中分離,并能將小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌與假結(jié)核耶爾森氏菌和非致病性耶爾森氏菌區(qū)別開(kāi)來(lái)。2.2.2免疫磁珠與ELISA的聯(lián)用利用磁性微球,并以兔抗甘草蛋白IgG抗體致敏,制備特異性捕獲甘草特征蛋白的免疫磁性微球。以生物素標(biāo)記抗體為示蹤抗體,結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)親和素建立ELISA檢測(cè)系統(tǒng),用于甘草藥材和含甘草中成藥中甘草蛋白的分析。結(jié)果用該方法對(duì)甘草藥材和中成藥中甘草蛋白抗原檢測(cè),檢測(cè)靈敏度10ng/mL。免疫磁性捕獲ELISA檢測(cè)技術(shù)方便、快速、準(zhǔn)確,為生藥的品種鑒定及中成藥的質(zhì)量控制提供一種新方法。

2.2.3免疫磁珠與發(fā)光檢測(cè)手段的聯(lián)用發(fā)光手段分析包括熒光免疫分析、電化學(xué)發(fā)光分析等。

免疫磁珠熒光微球2.3IMB技術(shù)在其他領(lǐng)域中的應(yīng)用2.3.1免疫檢測(cè)IMB技術(shù)不僅應(yīng)用于食品中有害微生物的檢測(cè),它在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景,它可以檢測(cè)腫瘤細(xì)胞,如骨髓中腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)和淋巴結(jié)中腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。另外這種技術(shù)還可以對(duì)腫瘤進(jìn)行磁導(dǎo)向治療和免疫磁性凈化治療。2.3.2細(xì)胞分離細(xì)胞分離是免疫磁珠目前應(yīng)用最主要的一個(gè)方面,傳統(tǒng)細(xì)胞分離技術(shù)有的比較費(fèi)時(shí),有的十分昂貴,由于免疫磁珠技術(shù)分離細(xì)胞時(shí)只需要抗體和磁鐵,既簡(jiǎn)便靈敏又經(jīng)濟(jì)快捷。分離細(xì)胞有兩種方式,用免疫磁珠直接從細(xì)胞混合液中分離靶細(xì)胞的方法稱為陽(yáng)性分離,用免疫磁珠去除無(wú)關(guān)細(xì)胞使靶細(xì)胞得以純化的方法稱為陰性分離。馬東初用GPⅡb/Шa血小板單克隆抗體結(jié)合磁珠分離人骨中的巨核細(xì)胞,其純度達(dá)到87.5%到97.1%,且50%的巨核細(xì)胞具有生物活性,且磁珠分離的巨核細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)保持完整,可用于巨核細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等方面的研究

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論