定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件

定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)測(cè)定技術(shù)

及其臨床應(yīng)用衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心李金明定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)測(cè)定技術(shù)

及其臨床應(yīng)用衛(wèi)生部臨1PCR?

PCR只是一個(gè)簡(jiǎn)單的不起眼玩藝

——?jiǎng)P利·穆利斯（KaryMullis)

PCR只是一個(gè)概念，所發(fā)生的奇跡是：PCR概念變成了可操作的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，變成了一項(xiàng)成熟的技術(shù)，后者又上升成為新的概念?！?/p>

它最大的特點(diǎn)就是能不斷推出新形式。

——摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]PCR?PCR只是一個(gè)簡(jiǎn)單的不起眼玩藝2（KaryMullis)（KaryMullis)3什么是PCR?

我不認(rèn)為PCR能夠用兩種“革命”(政治革命和科學(xué)革命)加以說(shuō)明。……它的發(fā)明并沒(méi)有改變基因操作的本質(zhì)。有了PCR，我們能在更廣的范圍內(nèi)更快、更容易地進(jìn)行基因操作，學(xué)術(shù)界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不過(guò)是一種新工具?！?jiǎng)P利·穆利斯（KaryMullis)什么是PCR?我不認(rèn)為PCR能夠用兩種“4定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件5PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（1）1983Cetus公司的K.Mullis在這年底（12月16日第一次成功實(shí)驗(yàn)）發(fā)明了PCR?！斑@種簡(jiǎn)單得令人驚奇，可以無(wú)限量地拷貝DNA片段的方法是在不可想象的情況下，即駕車行駛在月色下的加利福尼亞山間公路上時(shí)想出來(lái)的”。--KBMullis,ScientificAmerican,april1990PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（1）1983Ce6PCR發(fā)明過(guò)程的簡(jiǎn)單回顧PCR發(fā)明過(guò)程的簡(jiǎn)單回顧7定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件8定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件9定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件10定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件11PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（2）關(guān)于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上發(fā)表(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.ErlichandN.Arnheim)1987KBMullisetal.”SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerase-catalyzedchainreaction.MethodsinEnzymology155:335PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（2）12PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（3）1987當(dāng)年7月Cetus公司在美國(guó)獲得PCR基本技術(shù)專利批準(zhǔn)。1985年底成立的Perkin-ElmerCetus儀器公司（PECI）于這一年的11月推出了第一個(gè)PCR試劑產(chǎn)品及第一臺(tái)熱循環(huán)儀。1989Science報(bào)道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶的發(fā)現(xiàn),預(yù)示著分子時(shí)代的到來(lái)。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個(gè)“年度分子”。Hoffmann-LaRoche公司和Cetus開始合作將PCR應(yīng)用于臨床診斷。RKSaiki,…KBMullisetal.(1988)”Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermo-stableDNApolymerase”,Science239:487PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（3）1987當(dāng)年7月Cet13TaqDNApolymeraseThermusaquaticusTaqDNApolymeraseThermusaqua14TaqDNApolymerase–AthermostableDNApolymerasefromThermusaquaticus.定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件15PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（4）DuPont理由是，1971年P(guān)CR的雛形已由Khorana一系列文章闡明，并公布于眾，應(yīng)當(dāng)是公共產(chǎn)權(quán)。斯坦福大學(xué)Kornberg（研究DNA聚合酶獲諾貝爾獎(jiǎng)）也認(rèn)為，任何具備生物技術(shù)知識(shí)的人都可以從Khorana等的文章中推知如何操作PCR。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（4）DuPont理由是，197116PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（5）H.G.Khorana

美國(guó)MIT教授、1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主Studyonpolynucleotides:repairreplicationofshortsyntheticDNA’sascatalyzedby

DNApolymerases.JMolBiol,1971,56:341“經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因”。核酸體外擴(kuò)增最早設(shè)想不能實(shí)現(xiàn)的原因:當(dāng)時(shí)很難進(jìn)行測(cè)序和合成寡核苷酸引物；當(dāng)時(shí)(1970)Smith等發(fā)現(xiàn)了內(nèi)切酶，體外克隆基因成為可能

PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（5）H.G.K17Thearticlefrom1971inwhichKleppeetal.describeRepairreplication–basicallythesameprincipleasPCR!J.Mol.Biol.(1971)56341-361定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件18PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（6）1990Cetus科學(xué)家D.Gelfand和S.Stoffel發(fā)明了純化TaqDNA多聚酶的方法。Cetus科學(xué)家H.Erlich和K.Mullis在德國(guó)臨床化學(xué)領(lǐng)域獲得生化分析獎(jiǎng)。1991TaqMan技術(shù)發(fā)表。當(dāng)年11月Hoffmann-LaRoche公司從Cetus獲得全球的PCR專利權(quán)。RocheMolecularSystems創(chuàng)建了單一耐熱多聚酶rTth進(jìn)行RT-PCR技術(shù)，并用于臨床RNA病毒檢測(cè)。耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶首次由Cetus科學(xué)家發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。

PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（6）1990Cetus科19實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)1986年末RussHiguchi來(lái)到PCR的誕生地Cetus公司工作探討“閉管PCR”的可能“溴化乙錠”的使用光導(dǎo)纖維的使用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)1986年末RussHiguchi來(lái)到20PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（7）1992當(dāng)年3月Cetus公司獲得Taq酶、熱循環(huán)擴(kuò)增儀等專利；1993AMPLICORHCV*首次用于臨床RNAPCR標(biāo)準(zhǔn)試劑盒。

KaryMullis

因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（7）1992當(dāng)年3月Ce21PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（8）

九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國(guó)內(nèi)全面展開1998年實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開始在中國(guó)較廣泛的應(yīng)用于臨床檢測(cè)1999年西方發(fā)達(dá)國(guó)家嘗試將PCR應(yīng)用于血液篩查PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（8）九十年代中期PCR臨床22PCR循環(huán)–第一步–加熱變性靶序列靶序列PCR循環(huán)–第一步–加熱變性靶序列靶序列23PCR循環(huán)-第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)-第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Pr24PCR循環(huán)-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerasePCR循環(huán)-第三步-引物延伸靶序列靶序列Prime25第1個(gè)PCR循環(huán)完成后–

得到兩個(gè)拷貝的靶序列靶序列靶序列BiotinBiotin第1個(gè)PCR循環(huán)完成后–

得到2630次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.of No.Ampli27定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件28PCR擴(kuò)增過(guò)程圖示PCR擴(kuò)增過(guò)程圖示29PCR擴(kuò)增的理論模式

PCR擴(kuò)增為指數(shù)擴(kuò)增，每一擴(kuò)增周期后產(chǎn)物的量可以下式表達(dá)：Yn=Yn-1·(1+E)=Yn-2·(1+E)2=…=X·(1+E)n

0≤E≤1其中E表示擴(kuò)增效率，Yn表示在n個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量，Yn-1為n-1個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量。等式僅在限定的擴(kuò)增周期數(shù)（通常為20或30）內(nèi)成立。超過(guò)此周期數(shù)，擴(kuò)增過(guò)程即由指數(shù)擴(kuò)增降低至穩(wěn)定的擴(kuò)增速率，最終達(dá)到平臺(tái)，不再擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增的理論模式PCR擴(kuò)增為指數(shù)擴(kuò)增，每30影響PCR擴(kuò)增效率的因素:PCR定量的困難?引物/靶的雜交反應(yīng)試劑的相對(duì)量樣本在擴(kuò)增儀中的位置的不同臨床樣本中DNA聚合酶抑制物的存在PCR擴(kuò)增模板的量靶核酸鏈的再退火及酶過(guò)量可致E降低影響PCR擴(kuò)增效率的因素:PCR定量的困難?引物/靶的雜交31PCR和定量問(wèn)題

高濃度/高效率

高濃度/低效率

低濃度/高效率

N : 擴(kuò)增分子的數(shù)目n : 擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)log-phaseanalysisNnend-pointanalysisPCR和定量問(wèn)題高濃度/高效率log-phaseana32定量PCR與定性PCR測(cè)定的最根本的區(qū)別

定量PCR測(cè)定的測(cè)定點(diǎn)為PCR擴(kuò)增的指數(shù)擴(kuò)增期;而定性PCR測(cè)定的測(cè)定點(diǎn)則多為PCR擴(kuò)增的平臺(tái)期。定量PCR與定性PCR測(cè)定的最根本的區(qū)別33定性PCR測(cè)定方法熒光PCR（TaqMan和分子信標(biāo)等）PCR-膜上雜交PCR-ELISA定性PCR測(cè)定方法熒光PCR（TaqMan和分子信標(biāo)等）34定量PCR的方法定量PCR方法可歸為三大類，即外標(biāo)方法、動(dòng)力學(xué)方法和內(nèi)標(biāo)共擴(kuò)增方法定量還可分為絕對(duì)定量（即測(cè)定X的分子數(shù)量）和相對(duì)定量（即測(cè)定不同樣本中X的比率）

定量PCR的方法定量PCR方法可歸為三大類，即外標(biāo)方法、動(dòng)力35用外標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法用外標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法36使用外標(biāo)的定量PCR方法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）方法簡(jiǎn)便，容易建立；（2）使用雙孔重復(fù)測(cè)定，這種方法可得到非常準(zhǔn)確的結(jié)果，甚至可排除管間的差異，但不能排除樣本間的差異；缺點(diǎn)：（1）PCR反應(yīng)體系中小的區(qū)別也會(huì)對(duì)測(cè)定造成較大的影響。由于最后在擴(kuò)增效率上的差異，從而使得定量測(cè)定精密度和重復(fù)性不佳。因此，如果建立一個(gè)使用外標(biāo)準(zhǔn)的PCR定量方法，則必須進(jìn)行方法的精密度（批內(nèi)變異）和重復(fù)性（批間變異）分析，以確定其應(yīng)用的局限性。使用外標(biāo)的定量PCR方法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）方法簡(jiǎn)便，容易建37TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCRTaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR38定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件39分子信標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子信標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量PCR40動(dòng)力學(xué)定量PCR方法

第一步：確定PCR擴(kuò)增的效率；第二步：根據(jù)相應(yīng)的公式計(jì)算原始模板數(shù)。動(dòng)力學(xué)定量PCR方法41擴(kuò)增效率的計(jì)算(1)如果在PCR每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中擴(kuò)增效率為常數(shù)，則可通過(guò)在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期的數(shù)個(gè)連續(xù)的或非連續(xù)的周期中取擴(kuò)增樣本，然后測(cè)定每份樣本中的產(chǎn)物Yn的量來(lái)測(cè)定E值。有必要收集2份以上的樣本，最好是盡可能多的樣本以確證擴(kuò)增效率保持恒定；換句話說(shuō)，也就是PCR尚未達(dá)到擴(kuò)增效率開始降低時(shí)的階段。如果取的是連續(xù)的樣本，則可從公式（1）測(cè)得E值；擴(kuò)增效率的計(jì)算(1)如果在PCR每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中擴(kuò)增效率為常42擴(kuò)增效率的計(jì)算擴(kuò)增效率的計(jì)算43擴(kuò)增效率的計(jì)算(2)如果取的樣本不連續(xù)，則可使用下述將公式（2）重排后得到的更為通用的公式，用參數(shù)j（取樣中間隔的周期數(shù)）替代n，Yj（在較高循環(huán)周期數(shù)取樣的產(chǎn)物量）替代Yn，Yi-j（在較低循環(huán)周期數(shù)取樣的產(chǎn)物量）替代X：E＝－1＋（Yi/Yi-j）1/j

(3)擴(kuò)增效率的計(jì)算(2)如果取的樣本不連續(xù)，則可使用下述將公式（44X(原始模板數(shù))的計(jì)算

一旦效率確定后，根據(jù)公式（4）可從測(cè)定的產(chǎn)物量和循環(huán)周期數(shù)計(jì)算得到X。公式（4）來(lái)源于公式（2）的重新排列：X＝Y(jié)n/(1＋E)n（4）X(原始模板數(shù))的計(jì)算一旦效率確定后，根據(jù)公45X的另一種計(jì)算方式(1)

另一種方式是，根據(jù)公式（2）的對(duì)數(shù)形式，以所測(cè)定的Yn值的對(duì)數(shù)對(duì)函數(shù)n繪圖得到X值：logYn=logX

+n×log(1+E)(5)當(dāng)n＝0時(shí)，可在圖上讀出X值，或通過(guò)對(duì)公式（5）的線性回歸計(jì)算X值（圖2）。X的另一種計(jì)算方式(1)另一種方式是，根據(jù)公46定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件47動(dòng)力學(xué)方法的特點(diǎn)

這種方法的優(yōu)點(diǎn):(1)不需要外標(biāo)準(zhǔn)；（2）如果能測(cè)定PCR產(chǎn)物分子的絕對(duì)數(shù)量，則可得到待測(cè)樣本的不同的擴(kuò)增效率（Ee)。動(dòng)力學(xué)方法的特點(diǎn)這種方法的優(yōu)點(diǎn):(1)不需要外標(biāo)準(zhǔn)；48使用非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法

非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)：（1）一般為與靶核酸無(wú)關(guān)的基因組；（2）既可是內(nèi)源的也可是外源的；（3）與靶核酸無(wú)相同的引物結(jié)合位點(diǎn)和擴(kuò)增序列。對(duì)于DNA的擴(kuò)增，非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)幾乎所有的基因都可應(yīng)用，最常用的有丙酮酸脫氫酶、前腦啡肽或β肌動(dòng)蛋白的基因。而對(duì)RNA的擴(kuò)增，則非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)較難尋找。理想的mRNA內(nèi)標(biāo)應(yīng)該在整個(gè)細(xì)胞周期中表達(dá)的水平變化不大，此外，其表達(dá)水平應(yīng)接近于靶RNA，而且它們的擴(kuò)增效率應(yīng)相等，因此兩者擴(kuò)增線性區(qū)域是重合的。已有許多的mRNA被嘗試用來(lái)作為此種內(nèi)標(biāo)，如HLA、β肌動(dòng)蛋白、GPDH和組蛋白H3.3的mRNA或14SrRNA等。使用非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)：（1）一49以非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)定量的主要優(yōu)點(diǎn)內(nèi)標(biāo)的制備簡(jiǎn)單復(fù)管測(cè)定可排除管間差異，并且在一定程度上，可排除樣本間的差異。以非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)定量的主要優(yōu)點(diǎn)內(nèi)標(biāo)的制備簡(jiǎn)單50以非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)定量的缺點(diǎn)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)和靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄的效率有可能不同，并且有可能既使針對(duì)的是相同的靶核酸逆轉(zhuǎn)錄效率也會(huì)有很大差異。因此，使用這種方法進(jìn)行RNA的定量PCR測(cè)定極為困難。在擴(kuò)增過(guò)程中的指數(shù)期測(cè)定可對(duì)原始模板相對(duì)定量，但如果沒(méi)有驗(yàn)證在一定的擴(kuò)增周期內(nèi)靶核酸和內(nèi)標(biāo)有相同的擴(kuò)增效率，則不能進(jìn)行絕對(duì)定量。以非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)定量的缺點(diǎn)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)和靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄的效率有可能不51使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法

“競(jìng)爭(zhēng)性”內(nèi)標(biāo)：人為構(gòu)建的可與原始靶核酸競(jìng)爭(zhēng)酶、核苷酸和引物分子的核酸標(biāo)準(zhǔn)，其特點(diǎn)是，與靶核酸具有相同的引物結(jié)合位點(diǎn)、但引物之間的順序需加以修飾，使得擴(kuò)增產(chǎn)物在檢測(cè)時(shí)能夠很容易地通過(guò)諸如凝膠電泳、探針雜交或高效液相層析等方法區(qū)分。對(duì)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的修飾方法包括對(duì)野生型基因組的點(diǎn)突變、部份缺失或插入外來(lái)順序等，目前尚無(wú)通用的規(guī)則或程序來(lái)構(gòu)建這種內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法“競(jìng)爭(zhēng)性”內(nèi)標(biāo)：人為構(gòu)建的52使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)既可進(jìn)行相對(duì)定量也可進(jìn)行絕對(duì)定量。相對(duì)定量具有很好的精密度和重復(fù)性。而絕對(duì)定量，關(guān)鍵是要證明競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)和野生型靶核酸的擴(kuò)增效率相同。亦可將競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)置于含已知量的野生型靶核酸的樣本中同時(shí)擴(kuò)增來(lái)評(píng)價(jià)。使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)既可進(jìn)行相對(duì)定53使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法要定量單份的臨床樣本，必須進(jìn)行數(shù)管競(jìng)爭(zhēng)性PCR測(cè)定，每管中靶核酸的量不變，但改變競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)的量，因?yàn)橹挥挟?dāng)待測(cè)靶核酸與競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)等摩爾量時(shí)才能有可靠的定量。由于競(jìng)爭(zhēng)性PCR可排除管間和樣本間的差異，因此，其可作為準(zhǔn)確的PCR定量方法，適用于絕對(duì)定量及含低拷貝數(shù)樣本的定量。

使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法要定量單份的臨床樣本，必須進(jìn)54定量和定性PCR測(cè)定的臨床應(yīng)用及

應(yīng)注意的問(wèn)題為什么要做定量測(cè)定？定性和定量測(cè)定結(jié)果報(bào)告上的混淆。定量和定性PCR測(cè)定的臨床應(yīng)用及

應(yīng)注意的問(wèn)題55為什么要做定量測(cè)定？用于已知病毒感染患者抗病毒治療效果的動(dòng)態(tài)觀察及抗病毒藥物的臨床研究；用于基因表達(dá)方面的研究，如特定的mRNA的定量測(cè)定。為什么要做定量測(cè)定？56為什么要做定性測(cè)定？用于未知患者的確認(rèn)用于血液篩檢突變檢測(cè)為什么要做定性測(cè)定？用于未知患者的確認(rèn)57定量和定性測(cè)定的結(jié)果報(bào)告定量測(cè)定測(cè)定的是量的“多”或“少”；定性測(cè)定則是測(cè)定某種物質(zhì)的“有”或“無(wú)”，用于未知病人的確認(rèn)診斷。定量測(cè)定結(jié)果報(bào)告：根據(jù)所使用的測(cè)定方法的測(cè)定范圍報(bào)告結(jié)果，如樣本測(cè)定結(jié)果高出此范圍，則可報(bào)告>多少，也可對(duì)樣本稀釋后再檢測(cè)；如低于此范圍，則報(bào)告<多少，如<103拷貝數(shù)/ml，而不能報(bào)告為0拷貝數(shù)/ml或陰性。定性測(cè)定結(jié)果報(bào)告:報(bào)告“陽(yáng)性”或“陰性”,“檢出”或“未檢出”,“反應(yīng)”或“未反應(yīng)”定量和定性測(cè)定的結(jié)果報(bào)告定量測(cè)定測(cè)定的是量的“多”或“少”；58在感染性疾病病原體檢測(cè)中的應(yīng)用病毒的檢測(cè)

定量定性基因型及基因突變細(xì)菌及其它微生物的檢測(cè)難培養(yǎng)菌耐藥基因寄生蟲的檢測(cè)在感染性疾病病原體檢測(cè)中的應(yīng)用病毒的檢測(cè)59在遺傳病及其它基因相關(guān)疾病診斷中的應(yīng)用α地貧β地貧血友病藥物性耳聾在遺傳病及其它基因相關(guān)疾病診斷中的應(yīng)用α地貧60在親子鑒定中的應(yīng)用每個(gè)人的遺傳物質(zhì)一半來(lái)自父親，另一半則來(lái)自母親。根據(jù)孟德爾遺傳分離和自由組合定律，親代基因型決定子代基因型，在沒(méi)有基因突變和分型錯(cuò)誤的前提下，孩子不可能帶有雙親均沒(méi)有的等位基因。父系遺傳的Y染色體的標(biāo)記，子代的分型必定與父親的相同，而且同一父系的所有個(gè)體的分型一致。母系遺傳的線粒體DNA，子代的分型與母親的分型一致，并且同一母系的所有個(gè)體的分型一致。

在親子鑒定中的應(yīng)用每個(gè)人的遺傳物質(zhì)一半來(lái)自父親，另一半則來(lái)自61在個(gè)體鑒別中的應(yīng)用基因指紋又稱DNA指紋，指的單基因座探針限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。DNA所含有的遺傳信息是由遺傳密碼字母A、C、G和T的序列決定的。人類含有總數(shù)約30億個(gè)這種字母，它們?cè)谌梭w每個(gè)細(xì)胞的染色體上都以一定的次序排列，排列次序的不同使得一個(gè)個(gè)體與另一個(gè)個(gè)體完全不同。個(gè)體間的親緣關(guān)系相距越遠(yuǎn)，基因組的核苷酸字母排列差異就越大。相反，遺傳上相關(guān)的個(gè)體（如同胞、父子）相應(yīng)地在其字母序列上有很大的相似性。

在個(gè)體鑒別中的應(yīng)用基因指紋又稱DNA指紋，指的單基因座探針限62在惡性腫瘤診斷中的應(yīng)用腫瘤診斷腫瘤療效觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移在惡性腫瘤診斷中的應(yīng)用腫瘤診斷63在血液篩檢中的應(yīng)用HCV和HIV感染“窗口期”HBVDNAPCR檢測(cè)篩檢血液的意義在血液篩檢中的應(yīng)用64其它Immuno-PCR其它Immuno-PCR65臨床PCR檢驗(yàn)應(yīng)用的發(fā)展趨勢(shì)核酸提取方法的簡(jiǎn)便化和自動(dòng)化項(xiàng)目的多樣化：從病原體、到基因疾病的診斷、多標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)、疾病基因指紋不同原理的實(shí)時(shí)基因擴(kuò)增儀的普遍應(yīng)用擴(kuò)增試劑的改進(jìn)：標(biāo)準(zhǔn)化、防污染、有內(nèi)標(biāo)陰性質(zhì)控臨床PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量理念不斷進(jìn)入增強(qiáng)臨床PCR檢驗(yàn)應(yīng)用的發(fā)展趨勢(shì)核酸提取方法的簡(jiǎn)便化和自動(dòng)化66總結(jié)1.定量測(cè)定重在定量，即如何改善擴(kuò)增指數(shù)期的線性及其范圍。定性測(cè)定重在測(cè)定下限。2.定量測(cè)定的準(zhǔn)確性較之測(cè)定下限要重要得多。3.非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)和競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)對(duì)于使用內(nèi)標(biāo)的定量測(cè)定方法極為關(guān)鍵。合適的非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)應(yīng)為在整個(gè)細(xì)胞周期中均勻表達(dá)的基因核酸，而競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)則應(yīng)盡可能近似原始待測(cè)模板。4.定量測(cè)定應(yīng)在擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行，因此，更重要的是要使涉及整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程的每個(gè)參數(shù)都理想化，以便控制整個(gè)擴(kuò)增，避開擴(kuò)增“平臺(tái)期”。定性既可在擴(kuò)增的平臺(tái)期，也可在擴(kuò)增的指數(shù)期測(cè)定?？偨Y(jié)1.定量測(cè)定重在定量，即如何改善擴(kuò)增指數(shù)期的線性及其67總結(jié)5.由樣本制備（核酸提?。┓椒ㄋ鸬亩繙y(cè)定的差異應(yīng)仔細(xì)研究加以避免。6.對(duì)于絕對(duì)定量，必須確定靶核酸和內(nèi)標(biāo)（競(jìng)爭(zhēng)的和非競(jìng)爭(zhēng)的）的擴(kuò)增效率，內(nèi)標(biāo)應(yīng)以相同的效率與靶核酸一起擴(kuò)增。為增加測(cè)定結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的可信性，建議重復(fù)多次測(cè)定。總結(jié)5.由樣本制備（核酸提?。┓椒ㄋ鸬亩繙y(cè)定的差異68謝謝!謝謝!69定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)測(cè)定技術(shù)

及其臨床應(yīng)用衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心李金明定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)測(cè)定技術(shù)

及其臨床應(yīng)用衛(wèi)生部臨70PCR?

PCR只是一個(gè)簡(jiǎn)單的不起眼玩藝

——?jiǎng)P利·穆利斯（KaryMullis)

PCR只是一個(gè)概念，所發(fā)生的奇跡是：PCR概念變成了可操作的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，變成了一項(xiàng)成熟的技術(shù)，后者又上升成為新的概念?！?/p>

它最大的特點(diǎn)就是能不斷推出新形式。

——摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]PCR?PCR只是一個(gè)簡(jiǎn)單的不起眼玩藝71（KaryMullis)（KaryMullis)72什么是PCR?

我不認(rèn)為PCR能夠用兩種“革命”(政治革命和科學(xué)革命)加以說(shuō)明。……它的發(fā)明并沒(méi)有改變基因操作的本質(zhì)。有了PCR，我們能在更廣的范圍內(nèi)更快、更容易地進(jìn)行基因操作，學(xué)術(shù)界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不過(guò)是一種新工具?！?jiǎng)P利·穆利斯（KaryMullis)什么是PCR?我不認(rèn)為PCR能夠用兩種“73定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件74PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（1）1983Cetus公司的K.Mullis在這年底（12月16日第一次成功實(shí)驗(yàn)）發(fā)明了PCR?！斑@種簡(jiǎn)單得令人驚奇，可以無(wú)限量地拷貝DNA片段的方法是在不可想象的情況下，即駕車行駛在月色下的加利福尼亞山間公路上時(shí)想出來(lái)的”。--KBMullis,ScientificAmerican,april1990PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（1）1983Ce75PCR發(fā)明過(guò)程的簡(jiǎn)單回顧PCR發(fā)明過(guò)程的簡(jiǎn)單回顧76定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件77定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件78定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件79定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件80PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（2）關(guān)于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上發(fā)表(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.ErlichandN.Arnheim)1987KBMullisetal.”SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerase-catalyzedchainreaction.MethodsinEnzymology155:335PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（2）81PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（3）1987當(dāng)年7月Cetus公司在美國(guó)獲得PCR基本技術(shù)專利批準(zhǔn)。1985年底成立的Perkin-ElmerCetus儀器公司（PECI）于這一年的11月推出了第一個(gè)PCR試劑產(chǎn)品及第一臺(tái)熱循環(huán)儀。1989Science報(bào)道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶的發(fā)現(xiàn),預(yù)示著分子時(shí)代的到來(lái)。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個(gè)“年度分子”。Hoffmann-LaRoche公司和Cetus開始合作將PCR應(yīng)用于臨床診斷。RKSaiki,…KBMullisetal.(1988)”Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermo-stableDNApolymerase”,Science239:487PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（3）1987當(dāng)年7月Cet82TaqDNApolymeraseThermusaquaticusTaqDNApolymeraseThermusaqua83TaqDNApolymerase–AthermostableDNApolymerasefromThermusaquaticus.定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件84PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（4）DuPont理由是，1971年P(guān)CR的雛形已由Khorana一系列文章闡明，并公布于眾，應(yīng)當(dāng)是公共產(chǎn)權(quán)。斯坦福大學(xué)Kornberg（研究DNA聚合酶獲諾貝爾獎(jiǎng)）也認(rèn)為，任何具備生物技術(shù)知識(shí)的人都可以從Khorana等的文章中推知如何操作PCR。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（4）DuPont理由是，197185PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（5）H.G.Khorana

美國(guó)MIT教授、1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主Studyonpolynucleotides:repairreplicationofshortsyntheticDNA’sascatalyzedby

DNApolymerases.JMolBiol,1971,56:341“經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因”。核酸體外擴(kuò)增最早設(shè)想不能實(shí)現(xiàn)的原因:當(dāng)時(shí)很難進(jìn)行測(cè)序和合成寡核苷酸引物；當(dāng)時(shí)(1970)Smith等發(fā)現(xiàn)了內(nèi)切酶，體外克隆基因成為可能

PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（5）H.G.K86Thearticlefrom1971inwhichKleppeetal.describeRepairreplication–basicallythesameprincipleasPCR!J.Mol.Biol.(1971)56341-361定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件87PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（6）1990Cetus科學(xué)家D.Gelfand和S.Stoffel發(fā)明了純化TaqDNA多聚酶的方法。Cetus科學(xué)家H.Erlich和K.Mullis在德國(guó)臨床化學(xué)領(lǐng)域獲得生化分析獎(jiǎng)。1991TaqMan技術(shù)發(fā)表。當(dāng)年11月Hoffmann-LaRoche公司從Cetus獲得全球的PCR專利權(quán)。RocheMolecularSystems創(chuàng)建了單一耐熱多聚酶rTth進(jìn)行RT-PCR技術(shù)，并用于臨床RNA病毒檢測(cè)。耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶首次由Cetus科學(xué)家發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。

PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（6）1990Cetus科88實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)1986年末RussHiguchi來(lái)到PCR的誕生地Cetus公司工作探討“閉管PCR”的可能“溴化乙錠”的使用光導(dǎo)纖維的使用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)1986年末RussHiguchi來(lái)到89PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（7）1992當(dāng)年3月Cetus公司獲得Taq酶、熱循環(huán)擴(kuò)增儀等專利；1993AMPLICORHCV*首次用于臨床RNAPCR標(biāo)準(zhǔn)試劑盒。

KaryMullis

因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（7）1992當(dāng)年3月Ce90PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（8）

九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國(guó)內(nèi)全面展開1998年實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開始在中國(guó)較廣泛的應(yīng)用于臨床檢測(cè)1999年西方發(fā)達(dá)國(guó)家嘗試將PCR應(yīng)用于血液篩查PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（8）九十年代中期PCR臨床91PCR循環(huán)–第一步–加熱變性靶序列靶序列PCR循環(huán)–第一步–加熱變性靶序列靶序列92PCR循環(huán)-第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)-第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Pr93PCR循環(huán)-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerasePCR循環(huán)-第三步-引物延伸靶序列靶序列Prime94第1個(gè)PCR循環(huán)完成后–

得到兩個(gè)拷貝的靶序列靶序列靶序列BiotinBiotin第1個(gè)PCR循環(huán)完成后–

得到9530次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.of No.Ampli96定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件97PCR擴(kuò)增過(guò)程圖示PCR擴(kuò)增過(guò)程圖示98PCR擴(kuò)增的理論模式

PCR擴(kuò)增為指數(shù)擴(kuò)增，每一擴(kuò)增周期后產(chǎn)物的量可以下式表達(dá)：Yn=Yn-1·(1+E)=Yn-2·(1+E)2=…=X·(1+E)n

0≤E≤1其中E表示擴(kuò)增效率，Yn表示在n個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量，Yn-1為n-1個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量。等式僅在限定的擴(kuò)增周期數(shù)（通常為20或30）內(nèi)成立。超過(guò)此周期數(shù)，擴(kuò)增過(guò)程即由指數(shù)擴(kuò)增降低至穩(wěn)定的擴(kuò)增速率，最終達(dá)到平臺(tái)，不再擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增的理論模式PCR擴(kuò)增為指數(shù)擴(kuò)增，每99影響PCR擴(kuò)增效率的因素:PCR定量的困難?引物/靶的雜交反應(yīng)試劑的相對(duì)量樣本在擴(kuò)增儀中的位置的不同臨床樣本中DNA聚合酶抑制物的存在PCR擴(kuò)增模板的量靶核酸鏈的再退火及酶過(guò)量可致E降低影響PCR擴(kuò)增效率的因素:PCR定量的困難?引物/靶的雜交100PCR和定量問(wèn)題

高濃度/高效率

高濃度/低效率

低濃度/高效率

N : 擴(kuò)增分子的數(shù)目n : 擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)log-phaseanalysisNnend-pointanalysisPCR和定量問(wèn)題高濃度/高效率log-phaseana101定量PCR與定性PCR測(cè)定的最根本的區(qū)別

定量PCR測(cè)定的測(cè)定點(diǎn)為PCR擴(kuò)增的指數(shù)擴(kuò)增期;而定性PCR測(cè)定的測(cè)定點(diǎn)則多為PCR擴(kuò)增的平臺(tái)期。定量PCR與定性PCR測(cè)定的最根本的區(qū)別102定性PCR測(cè)定方法熒光PCR（TaqMan和分子信標(biāo)等）PCR-膜上雜交PCR-ELISA定性PCR測(cè)定方法熒光PCR（TaqMan和分子信標(biāo)等）103定量PCR的方法定量PCR方法可歸為三大類，即外標(biāo)方法、動(dòng)力學(xué)方法和內(nèi)標(biāo)共擴(kuò)增方法定量還可分為絕對(duì)定量（即測(cè)定X的分子數(shù)量）和相對(duì)定量（即測(cè)定不同樣本中X的比率）

定量PCR的方法定量PCR方法可歸為三大類，即外標(biāo)方法、動(dòng)力104用外標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法用外標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法105使用外標(biāo)的定量PCR方法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）方法簡(jiǎn)便，容易建立；（2）使用雙孔重復(fù)測(cè)定，這種方法可得到非常準(zhǔn)確的結(jié)果，甚至可排除管間的差異，但不能排除樣本間的差異；缺點(diǎn)：（1）PCR反應(yīng)體系中小的區(qū)別也會(huì)對(duì)測(cè)定造成較大的影響。由于最后在擴(kuò)增效率上的差異，從而使得定量測(cè)定精密度和重復(fù)性不佳。因此，如果建立一個(gè)使用外標(biāo)準(zhǔn)的PCR定量方法，則必須進(jìn)行方法的精密度（批內(nèi)變異）和重復(fù)性（批間變異）分析，以確定其應(yīng)用的局限性。使用外標(biāo)的定量PCR方法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）方法簡(jiǎn)便，容易建106TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCRTaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR107定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件108分子信標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子信標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量PCR109動(dòng)力學(xué)定量PCR方法

第一步：確定PCR擴(kuò)增的效率；第二步：根據(jù)相應(yīng)的公式計(jì)算原始模板數(shù)。動(dòng)力學(xué)定量PCR方法110擴(kuò)增效率的計(jì)算(1)如果在PCR每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中擴(kuò)增效率為常數(shù)，則可通過(guò)在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期的數(shù)個(gè)連續(xù)的或非連續(xù)的周期中取擴(kuò)增樣本，然后測(cè)定每份樣本中的產(chǎn)物Yn的量來(lái)測(cè)定E值。有必要收集2份以上的樣本，最好是盡可能多的樣本以確證擴(kuò)增效率保持恒定；換句話說(shuō)，也就是PCR尚未達(dá)到擴(kuò)增效率開始降低時(shí)的階段。如果取的是連續(xù)的樣本，則可從公式（1）測(cè)得E值；擴(kuò)增效率的計(jì)算(1)如果在PCR每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中擴(kuò)增效率為常111擴(kuò)增效率的計(jì)算擴(kuò)增效率的計(jì)算112擴(kuò)增效率的計(jì)算(2)如果取的樣本不連續(xù)，則可使用下述將公式（2）重排后得到的更為通用的公式，用參數(shù)j（取樣中間隔的周期數(shù)）替代n，Yj（在較高循環(huán)周期數(shù)取樣的產(chǎn)物量）替代Yn，Yi-j（在較低循環(huán)周期數(shù)取樣的產(chǎn)物量）替代X：E＝－1＋（Yi/Yi-j）1/j

(3)擴(kuò)增效率的計(jì)算(2)如果取的樣本不連續(xù)，則可使用下述將公式（113X(原始模板數(shù))的計(jì)算

一旦效率確定后，根據(jù)公式（4）可從測(cè)定的產(chǎn)物量和循環(huán)周期數(shù)計(jì)算得到X。公式（4）來(lái)源于公式（2）的重新排列：X＝Y(jié)n/(1＋E)n（4）X(原始模板數(shù))的計(jì)算一旦效率確定后，根據(jù)公114X的另一種計(jì)算方式(1)

另一種方式是，根據(jù)公式（2）的對(duì)數(shù)形式，以所測(cè)定的Yn值的對(duì)數(shù)對(duì)函數(shù)n繪圖得到X值：logYn=logX

+n×log(1+E)(5)當(dāng)n＝0時(shí)，可在圖上讀出X值，或通過(guò)對(duì)公式（5）的線性回歸計(jì)算X值（圖2）。X的另一種計(jì)算方式(1)另一種方式是，根據(jù)公115定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR測(cè)定技術(shù)山東臨床檢驗(yàn)中心課件116動(dòng)力學(xué)方法的特點(diǎn)

這種方法的優(yōu)點(diǎn):(1)不需要外標(biāo)準(zhǔn)；（2）如果能測(cè)定PCR產(chǎn)物分子的絕對(duì)數(shù)量，則可得到待測(cè)樣本的不同的擴(kuò)增效率（Ee)。動(dòng)力學(xué)方法的特點(diǎn)這種方法的優(yōu)點(diǎn):(1)不需要外標(biāo)準(zhǔn)；117使用非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法

非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)：（1）一般為與靶核酸無(wú)關(guān)的基因組；（2）既可是內(nèi)源的也可是外源的；（3）與靶核酸無(wú)相同的引物結(jié)合位點(diǎn)和擴(kuò)增序列。對(duì)于DNA的擴(kuò)增，非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)幾乎所有的基因都可應(yīng)用，最常用的有丙酮酸脫氫酶、前腦啡肽或β肌動(dòng)蛋白的基因。而對(duì)RNA的擴(kuò)增，則非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)較難尋找。理想的mRNA內(nèi)標(biāo)應(yīng)該在整個(gè)細(xì)胞周期中表達(dá)的水平變化不大，此外，其表達(dá)水平應(yīng)接近于靶RNA，而且它們的擴(kuò)增效率應(yīng)相等，因此兩者擴(kuò)增線性區(qū)域是重合的。已有許多的mRNA被嘗試用來(lái)作為此種內(nèi)標(biāo)，如HLA、β肌動(dòng)蛋白、GPDH和組蛋白H3.3的mRNA或14SrRNA等。使用非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)：（1）一118以非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)定量的主要優(yōu)點(diǎn)內(nèi)標(biāo)的制備簡(jiǎn)單復(fù)管測(cè)定可排除管間差異，并且在一定程度上，可排除樣本間的差異。以非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)定量的主要優(yōu)點(diǎn)內(nèi)標(biāo)的制備簡(jiǎn)單119以非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)定量的缺點(diǎn)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)和靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄的效率有可能不同，并且有可能既使針對(duì)的是相同的靶核酸逆轉(zhuǎn)錄效率也會(huì)有很大差異。因此，使用這種方法進(jìn)行RNA的定量PCR測(cè)定極為困難。在擴(kuò)增過(guò)程中的指數(shù)期測(cè)定可對(duì)原始模板相對(duì)定量，但如果沒(méi)有驗(yàn)證在一定的擴(kuò)增周期內(nèi)靶核酸和內(nèi)標(biāo)有相同的擴(kuò)增效率，則不能進(jìn)行絕對(duì)定量。以非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)定量的缺點(diǎn)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)和靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄的效率有可能不120使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法

“競(jìng)爭(zhēng)性”內(nèi)標(biāo)：人為構(gòu)建的可與原始靶核酸競(jìng)爭(zhēng)酶、核苷酸和引物分子的核酸標(biāo)準(zhǔn)，其特點(diǎn)是，與靶核酸具有相同的引物結(jié)合位點(diǎn)、但引物之間的順序需加以修飾，使得擴(kuò)增產(chǎn)物在檢測(cè)時(shí)能夠很容易地通過(guò)諸如凝膠電泳、探針雜交或高效液相層析等方法區(qū)分。對(duì)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的修飾方法包括對(duì)野生型基因組的點(diǎn)突變、部份缺失或插入外來(lái)順序等，目前尚無(wú)通用的規(guī)則或程序來(lái)構(gòu)建這種內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法“競(jìng)爭(zhēng)性”內(nèi)標(biāo)：人為構(gòu)建的121使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)既可進(jìn)行相對(duì)定量也可進(jìn)行絕對(duì)定量。相對(duì)定量具有很好的精密度和重復(fù)性。而絕對(duì)定量，關(guān)鍵是要證明競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)和野生型靶核酸的擴(kuò)增效率相同。亦可將競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)置于含已知量的野生型靶核酸的樣本中同時(shí)擴(kuò)增來(lái)評(píng)價(jià)。使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)既可進(jìn)行相對(duì)定122使用競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法要定量單份的臨床樣本，必須進(jìn)行數(shù)管競(jìng)爭(zhēng)性PCR測(cè)定，每管中靶核酸的量不變，但改變競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)的量，因?yàn)橹挥挟?dāng)待測(cè)靶核酸與競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)等摩爾量時(shí)才能有可靠的定量。由于競(jìng)爭(zhēng)性PCR可排除管間和樣本間的差異，因此，其可作為準(zhǔn)確的PCR定量方法，適用于絕對(duì)定量及含低拷貝數(shù)樣本的定量。

使