生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移

生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移資料僅供參考文件編號：2022年4月生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移版本號：A修改號：1頁次：1.0審核：批準:發(fā)布日期：BRET生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)簡介：生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）技術(shù)是近10年來出現(xiàn)的一種新的檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù).它的最大優(yōu)勢是能在活細胞中實時進行檢測，因此能夠進行相互作用動力學的研究。在應用這個系統(tǒng)研究感興趣的蛋白前，首先需要將Rluc或者EYFP融合到每個蛋白或者他們的輔蛋白上。在細胞中，融合蛋白共表達，然后和熒光素酶和其底物腔腸素反應，當能量供體Rluc，能量受體EYFP之間距離比較近的時候(10-100?)，那么光將從Rluc(峰值480nm發(fā)射)傳遞到EYFP，形成它的激發(fā)，并且發(fā)射一個波長在530nm的發(fā)射光，BRET量化的程度以發(fā)射光530nm和480nm的比率表示。實驗流程1、用于BRET的表達質(zhì)粒構(gòu)建；2、融合蛋白表達檢測；3、BRET實驗；4、實驗結(jié)果分析及提交實驗報告客戶提供1、目的基因cDNA（也可由我公司提供基因克?。?、用于實驗細胞（如果我公司細胞庫有可不需提供）公司提供詳細實驗步驟、使用儀器、及結(jié)果分析等詳細實驗報告。服務周期和價格具體咨詢本公司熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）熒光共振能量轉(zhuǎn)移-FRET（FluorescentResonanceEnergyTransfer）

指兩個熒光發(fā)色基團在足夠靠近時，當供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移。

（1）FRET發(fā)生條件：

能量匹配：供體分子的發(fā)射光譜可以被受體分子吸收并產(chǎn)生熒光信號。供體分子的發(fā)射光譜應與受體分子的激發(fā)光譜必須有顯著重疊（>30%）；

作用距離：供體分子與受體分子的作用距離為1-10nm；

FRET效率公式：用于計算分子/基團間作用距離R

偶極-偶極作用：供體分子與受體分子作用時的向量必須滿足一定條件。

（2）FRET的應用：

通過FRET技術(shù)可以獲得有關(guān)兩個蛋白分子之間相互作用的空間信息（作用距離、作用方向、能量傳遞效率）。常用于解決如下問題：蛋白分子的共定位；蛋白分子聚合體；轉(zhuǎn)錄機制；轉(zhuǎn)化途徑；分子運動；蛋白折疊等生物學問題。

（3）FRET常見的供體-受體熒光分子對：熒光蛋白類：

染料類：

FRET檢測HIV附屬蛋白與細胞膜CD分子相互作用

摘自：AFlowCytometry-BasedFRETAssaytoIdentifyandAnalyseProtein-ProteinInteractionsinLivingCells

CarinaBanning,Jo¨rgVotteler,etal.

圖釋：流式細胞儀FACSAria檢測FRET信號。（a）活的293T細胞分別單獨轉(zhuǎn)入CFP、YFP、CFP/YFP、CFP/YFP融合蛋白作為對照，確定最好的圈門方式為CFP/FRET。（b）293T細胞經(jīng)過2%PFA處理后，YFP熒光強度出現(xiàn)明顯下降。

篩選有相互作用的未知蛋白質(zhì)的流程

圖釋：流式細胞儀FACSAria進行FACS-FRET高通量篩選感興趣蛋白相互作用的未知蛋白。（a）FACS-FRET篩選流程。（b）在活的293T細胞中轉(zhuǎn)入Vpu-YFP作為誘餌，與等量的CFP融合蛋白（蛋白的cDNA庫）相互作用36小時后，分選FERT+細胞。

FRET研究蛋白酶功能

摘自：DetectionofInfectivePoliovirusbyaSimple,Rapid,andSensitiveFlowCytometryMethodBasedonFluorescenceResonanceEnergyTransferTechnology

JasonL.Cantera

etal.Appliedandenvironmental

microbiology,Jan.2010,p.584-588

圖釋：流式細胞儀FACSAria檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV1）10倍感染BGM-PV細胞，8小時后上機檢測。A~C病毒濃度分別為0.4~0.004，D為陰性對照。雙分子熒光互補技術(shù)BiFC（BimolecularFluorescenceComplementation）

是將熒光報告蛋白按照規(guī)則分成沒有熒光的兩段，分別與誘餌蛋白和捕獲蛋白融合，只有在誘餌蛋白和捕獲蛋白發(fā)生相互作用的情況下，兩段不完整的熒光報告蛋白才會形成完整的報告蛋白，發(fā)出熒光?；罴毎占螅诹魇郊毎麅x中的檢測是實時進行的，只要細胞中有熒光產(chǎn)生就會被捕捉到信號，因此，不論是親和力較弱的結(jié)合還是暫時性的結(jié)合都不會被遺漏。

雙分子熒光互補技術(shù)原理示意圖(a)誘餌和捕獲蛋白分別攜帶CYFP和NYFP兩段YFP熒光蛋白片段(b)誘餌和捕獲蛋白結(jié)合同時CYFP與NYFP形成YFP(c)形成的YFP發(fā)出熒光

（1）BiFC檢測的特點：

活細胞分析；

可以用于研究2種或2種以上的啟動子調(diào)控之下的蛋白質(zhì)相互作用；

具有很高的信噪比，弱蛋白相互作用也可以檢測到（>7nm）。

（2）可用于BiFC的熒光蛋白：

GFP、BFP、CFP、YFP，生理條件可用的黃色的Venus和citrine，青色的cerulean；

紅色系統(tǒng)：mRFP2Q66T、mCherry；

Venus（EYFP的變體）是目前用于BiFC分析最多的熒光蛋白，因為其熒光強且背景敏感度降低，是BiFC分析理想的熒光蛋白。

常見的用于雙分子熒光互補技術(shù)的熒光蛋白

BiFC研究復合體中亞基間的相互作用

摘自：DetectionandCharacterizationofInfluenzaAVirusPA-PB2InteractionthroughaBimolecularFluorescenceComplementationAssay

JosephN.Hemerka,DanWang,etal.JOURNALOFVIROLOGY,Apr.2009,p.3944-3955

圖釋：流式細胞儀FACSCalibur檢測流感病毒復合體中亞基PA-PB2間的相互作用。（B）流式檢測同時轉(zhuǎn)入PA/PB2的COS-1細胞及單轉(zhuǎn)入PA-VC的細胞的Venus熒光信號，顯示轉(zhuǎn)入24小時后的熒光強度。（C）螢火蟲熒光蛋白酶顯示，轉(zhuǎn)入單或雙質(zhì)粒的細胞，螢火蟲熒光蛋白酶活性一致。

BiFC研究信號傳導通路中蛋白質(zhì)間的相互作用

摘自：Characterizationofthelatentmembraneprotein1signalingcomplexofEpstein-Barrvirusinthemembraneofmammaliancellswithbimolecularfluorescencecomplementation

PoojaTalaty,AmandaEmery,etal.VirologyJournal2011,8:414

圖釋：流式細胞儀FACSLSRII檢測BiFC信號。LMP1-NYFP和LMP1-NYFP突變體分別與CYFP-TRAF2、CYFP-TRAF3轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)，檢測其相互作用。曲線藍色部分為出現(xiàn)YFP的熒光陽性表達，表明LMP1與CYFP、CYFP均存在相互作用?？破找幌耂CI

《科學引文索引》（ScienceCitationIndex,簡稱SCI）于1957年由美國科學信息研究所（InstituteforScientificInformation,簡稱ISI）在美國費城創(chuàng)辦，是由美國科學信息研究所(ISI)1961年創(chuàng)辦出版的引文數(shù)據(jù)庫。SCI(科學引文索引)、EI(工程索引)、ISTP(科技會議錄索引)是世界著名的三大科技文獻檢索系統(tǒng)，是國際公認的進行科學統(tǒng)計與科學評價的主要檢索工具。

1976年，ISI在SCI基礎上引出期刊引用報告（journalcitationreport,JCR），提供了一套統(tǒng)計數(shù)據(jù)，展示科學期刊被引用情況、發(fā)表論文數(shù)量以及論文的平均被引用情況。在JCR中可以計算出每種期刊的影響因子（ImpactFactor,IF）。影響因子的高低，在一定程度上可以反應一個期刊的影響力。

（百度百科）

期刊的影響因子(Impactfactor；IF)計算方式：

IF2014=(該雜志2012-2013年發(fā)表文章在2014年被引用的次數(shù)/

(該雜志2012-2013年發(fā)表文章的總數(shù))

附件是最近兩年的SCI期刊列表，2014年植物學類我紅色標注了部分，不過期刊名都是縮寫，2013年的是全稱期刊名。影響因子從高到低排列，大體代表了期刊的水平檔次。

三大國際頂尖期刊CNS，指CELL，NATURE，SCIENCE。

國際植物學專業(yè)期刊中，最好的研究論文期刊是PlantCell（IF2004=9.338），當然今年新創(chuàng)刊的NATUREPLANTS估計不久的