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文檔簡介

細胞培養(yǎng)液的配制

培養(yǎng)基的選擇

依據(jù):經(jīng)驗、文獻、嘗試常用:RPMI1640、DMEM

培養(yǎng)基的來源

市售干粉培養(yǎng)基---自己配制液體培養(yǎng)基---直接使用(注意有效期)

培養(yǎng)基的除菌方法

過濾除菌:(1)正壓過濾---效率高

(2)負壓過濾---效率低高壓蒸氣滅菌:

不含谷氨酰胺，滅菌后另外添加培養(yǎng)基附加成分的添加

按使用說明或實驗要求添加配制時加:碳酸氫鈉、抗生素、血清等臨用前加:生物活性因子如EGF、FGF、NGF、PDGF等

配制步驟

(1)10.4g/包培養(yǎng)粉溶至1L三蒸水中,磁力攪拌20min(2)加2gNaHCO3/L,繼續(xù)攪拌10min(3)加青霉素100U/mL(80萬U溶至4ml三蒸水,取0.5ml)

鏈霉素100U/mL(100萬U溶至5ml三蒸水,取0.5ml))(4)加1NHCl約3mL,調(diào)pH至7.2,繼續(xù)攪拌(5)按要求加血清（血清一般需經(jīng)56℃，30min滅活）例如:10%胎牛血清無血清培養(yǎng)液900ml

滅活胎牛血清100ml(6)正壓過濾除菌(氣壓適當,防止濾膜破裂)(7)分裝,貯存于4℃，2周內(nèi)用完。(8)無菌試驗:取樣,37℃放置24－72h,無細菌、霉菌污染方可使用注意事項

谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，４℃，７ｄ分解５０％，放置兩周以上時，根據(jù)需要添加谷氨酰胺。配制１００×母液（200mmol/L,即29.22g/L）,每100ml加入0.5－2ml母液，終濃度1－4mmol/L抗生素在37℃穩(wěn)定性維持3－4d,可控制輕度污染。防污染重在無菌操作

培養(yǎng)液配制過程

（以RPMI1640為例）(2)培養(yǎng)粉、NaHCO3、1NHCl、青霉素、鏈霉素、血清、新鮮制備的三蒸水取孔徑為0.45μm和0.22μm濾膜各一張，浸入三蒸水中

將裝有濾膜的濾器包裝后高壓蒸氣消毒

3.液體配制①將培養(yǎng)粉倒入容器中②加入新鮮制備的三蒸水磁力攪拌器充分攪拌③按照實驗的具體要求分別加入NaHCO3和青鏈霉素（青霉素100U/mL：80萬U溶至4ml三蒸水,取0.5ml；鏈霉素100U/mL：100萬U溶至5ml三蒸水,取0.5ml)⑤加入1NHCl約3mL,調(diào)整pH至7.2－7.4

磁力攪拌器充

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