免疫原和抗血清制備電子教案課件

免疫原和抗血清制備

——陳雪麗陳春婉馮慧婷侯純?nèi)靥m州大學2010級醫(yī)學檢驗二班免疫原和抗血清制備陳春婉馮慧婷侯純?nèi)?案例一常州狂犬疫苗造假事件

該公司2008年生產(chǎn)的4個批次人用狂犬疫苗效價低于國家標準，可能導致疫苗接種后免疫抗體水平低，無法充分發(fā)揮疫苗應有的預防保護作用，屬于不合格產(chǎn)品。案例一常州狂犬疫苗造假事件2什么是疫苗？抗原？抗體？作用？1234什么是疫苗？抗原？抗體？作用？12343疫苗病原微生物及其代謝產(chǎn)物預防疾病用于人工主動免疫的生物制劑人工減毒、滅活、利用基因工程等經(jīng)過特殊處理的抗原疫苗病原微生物預防疾病用于人工主動免疫的生物制劑人工減毒、滅4免疫原和抗血清制備電子教案課件5疫苗的分類

傳統(tǒng)

新型

傳統(tǒng)

新型

傳統(tǒng)

新型類毒素重組抗原疫苗重組載體疫苗DNA疫苗減毒活疫苗滅活疫苗亞單位疫苗合成肽疫苗基因工程疫苗免疫原性強的病原微生物，如傷寒、霍亂等，理化方法滅活人工誘導變異或從自然界中篩選的毒力高度減弱的病原微生物用0.3%-0.4%甲醛處理，喪失毒性的外毒素去除有害成分，保留免疫原性成分，腦膜炎球菌莢膜疫苗將具有免疫原性的多肽抗原或氨基酸序列與適當載體或佐劑結(jié)合成的疫苗采用DNA重組技術制備的只含保護性抗原組分的基因工程疫苗將編碼病原體免疫原性的基因插入減毒的病毒或細菌，接種到人體將編碼抗原的基因轉(zhuǎn)入真核表達載體后注入人體，它需要人體細胞來利用這段基因自己表達抗原疫苗的分類傳統(tǒng)新型傳統(tǒng)6疫苗大致可以分為六大類：滅活疫苗，是被徹底殺死的病原，相當于把反動分子槍斃以后曝尸示眾，由于是已經(jīng)死掉的階級敵人，往往導致革命隊伍警惕性不很高，常需要反復刺激；減毒活疫苗，其實就是可以改造好的黑五類后代，經(jīng)過教育改造，已經(jīng)減弱或喪失了危害性，進入人體后現(xiàn)身說法介紹反革命分子的長相，并且可以繁殖供長期圍觀，效果很好，但也存在突然又反叛的危險，所以在篩選確認時耗費時間極長；類毒素疫苗，是處理后的細菌外毒素，相當于階級敵人的便便經(jīng)過消毒后給革命群眾作為識別特征；亞單位疫苗，是除去其他成分后提取病原體中有效免疫原所得，如多糖類疫苗等，相當于將謀逆賊子砍頭后傳首九邊以供識別；免疫原和抗血清制備電子教案課件7上述種種，均直接來源于病原，真正像照片的，其實是基因重組疫苗和DNA疫苗，它們都是對病原體照相——找到編碼免疫原的基因——這段基因相當于底片，在基因重組疫苗中，該基因被插入表達系統(tǒng)——比如把乙肝的HBS抗原基因植入酵母菌當中，酵母菌就是沖片機，表達出的抗原相當于沖印好的照片，經(jīng)過純化制成疫苗；DNA疫苗則是將編碼抗原的基因轉(zhuǎn)入真核表達載體后注入人體，它需要人體細胞來利用這段基因自己表達抗原相當于上級只發(fā)放底片，得自己沖洗。上述種種，均直接來源于病原，真正像照片的，其實是基因重組疫苗8免疫原疫苗抗原免疫原疫苗抗原9抗原誘導機體產(chǎn)生免疫應答（免疫原性）與免疫應答產(chǎn)物結(jié)合（抗原性）疫苗經(jīng)過特殊處理誘導機體產(chǎn)生免疫應答免疫原誘導機體產(chǎn)生免疫應答抗原半抗原

僅具有抗原性抗原誘導機體產(chǎn)生免疫應答（免疫原性）疫苗經(jīng)過特殊處理免疫原誘10疫苗都是免疫原？免疫原都是疫苗？免疫原都是抗原？抗原都是免疫原？疫苗都是免疫原？11疫苗免疫原抗原疫苗免疫原抗原12合格疫苗？安全性有效性專一性可獲得性適合大批量生產(chǎn)易保存經(jīng)濟合格疫苗？安全性13如何制備？疫苗的制造過程，大體上可以分成4部分：1.篩選種毒；2.擴繁病原；3.處理純化；4.驗證批簽。如何制備？疫苗的制造過程，大體上可以分成4部分：14如何制備？顆粒性抗原的制備（細胞、細菌、寄生蟲等）滅活疫苗細胞抗原（綿羊紅細胞）經(jīng)生理鹽水等溶液洗凈，配制成一定濃度；細菌抗原純菌增菌后處理制備菌體(O)抗原置于100℃水浴2-2.5h去除鞭毛(H)抗原；制備H抗原，菌液用0.3%-0.5%甲醛處理；制備細菌毒素抗原，殺菌后用0.5%-1%氯化鈣處理。如何制備？顆粒性抗原的制備（細胞、細菌、寄生蟲等）15可溶性抗原亞單位疫苗包括：蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂蛋白等來源：組織和細胞步驟：提取和純化可溶性抗原亞單位疫苗16粗提組織、細胞破碎，取上清組織勻漿：必須為新鮮或低溫保存高速組織搗碎機法；研磨法（腦、胰腺）2.細胞破碎：凍融法，緩慢融化，適用于細胞超聲破碎法，間歇進行，適用于細胞酶法，不易破壞內(nèi)含物成分，適用于微生物表面活性劑處理法，多用于細菌提取核酸粗提組織、細胞破碎，取上清17純化（以蛋白為例）超速離心法差速離心法分離大小和密度差異較大的顆粒

差速離心法原理示意圖純化（以蛋白為例）超速離心法差速離心法原理示意圖18純化密度梯度離心法將樣品放在惰性介質(zhì)（梯度液）中進行離心沉淀蔗糖、甘油、氯化銫等純化密度梯度離心法19純化特點適用于少數(shù)大分子抗原及某些比重較小的抗原純化20純化選擇性沉淀法鹽析法純度不高，適合初步純化，常用33%-35%飽和度的硫酸銨有機溶劑沉淀法必須在0℃下進行，常用乙醇和丙酮聚合物沉淀法PEG，分子量越大，PEG濃度越低核酸沉淀劑法硫酸魚精蛋白、核酸酶等去除核酸純化選擇性沉淀法21免疫原和抗血清制備電子教案課件22純化層析法1.凝膠層析法分子量不同2.離子交換柱層析法蛋白質(zhì)的等電點不同3.親和層析法生物分子結(jié)合的特異性和可逆性純化層析法23純化-凝膠層析法純化-凝膠層析法24純化-凝膠層析法純化-凝膠層析法25純化-離子交換層析1、樹脂類：分離氨基酸，孔徑??；2、纖維素類：分離蛋白質(zhì)，孔徑大純化-離子交換層析1、樹脂類：分離氨基酸，孔徑??；26純化-親和層析純化-親和層析27純化電泳法分子量電荷數(shù)量純化電泳法28純化

粗分級一般采用鹽析、有機溶劑分級等方法；

細分級一般采用層析法，包括凝膠層析、離子交換層析、親和層析等方法。

必要時，還可采用電泳法，包括等電聚焦等作為蛋白質(zhì)的提純步驟。純化粗分級一般采用鹽析、有機溶劑分級等方法；29細胞破碎固液分離粗分級細分級GoingUp細胞破碎固液分離粗分級細分級GoingUp30純化抗原的鑒定含量雙縮脲法、比濁法、酚試劑法、直接紫外吸收法等分子量SDS純度SDS、HPLC免疫活性雙向免疫擴散、ELISA等純化抗原的鑒定含量31瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳32瓊脂糖凝膠電泳-模式圖瓊脂糖凝膠電泳-模式圖33SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，使各種蛋白質(zhì)—SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，其數(shù)量遠遠超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，34人工抗原人工結(jié)合抗原（半抗原）人工合成抗原基因工程抗原人工抗原人工結(jié)合抗原（半抗原）35人工結(jié)合抗原半抗原（>=20）載體(1)蛋白質(zhì)牛血清蛋白多肽類聚合物多聚賴氨酸大分子聚合物羧甲基纖維素完全抗原物理化學羧甲基纖維素聚乙烯吡咯烷酮某些功能基團鑒定吸收光譜分析法放射性核素標記法人工結(jié)合抗原半抗原（>=20）載體(1)蛋白質(zhì)牛血清蛋36人工合成抗原……化學方法……化學方法合成肽疫苗人工合成抗原……化學方法……化學方法合成肽疫苗37基因工程抗原——基因工程疫苗提取、純化、鑒定基因工程抗原——基因工程疫苗提取、純化、鑒定38毒性試驗（安全性試驗）

通常包括殺菌劑的殘留，防腐劑的含量，熱源含量，有無微生物污染，培養(yǎng)基殘留等，例如因為可能有人對雞蛋過敏，所以所有雞胚培養(yǎng)的疫苗必須嚴格監(jiān)控卵清蛋白殘留；而懷疑牛血清中可能有對人體不利的物質(zhì)，凡添加了牛血清培養(yǎng)細胞的，必須監(jiān)控牛血清白蛋白殘留量；對于滅活疫苗，還要檢測其滅活程度，通常是把成品或處理后的原液接種到細胞或?qū)嶒瀯游?，動物或細胞沒有感染跡象才算過關，對于弱毒疫苗，還要用動物做毒力測定，以保證疫苗沒有復壯成致病株。毒性試驗（安全性試驗）通常包括殺菌劑的殘留，防腐39效力試驗（免疫保護實驗）

有效性檢測，最基本的，是用抗血清檢查疫苗中確實含有目的抗原，然后做效力測定，給實驗動物注射疫苗，檢查有無產(chǎn)生促發(fā)特異的免疫應答產(chǎn)生特定抗體，或者，比較倒霉的實驗動物會被接種致病菌觀察疫苗的保護效應。效力試驗（免疫保護實驗）有效性檢測，最基本的，是40我的疑問抗原到疫苗，到底要怎么處理？我的疑問抗原到疫苗，到底要怎么處理？41參考：三槍拍案說疫苗·生產(chǎn)——科學松鼠會蛋白質(zhì)分離純化——生物秀論壇嗜水氣單胞菌亞單位疫苗的研制——孫建和、嚴亞賢等從乙肝疫苗的制備看疫苗純化技術的發(fā)展——張國強、趙鎧參考：42經(jīng)驗概念：1.看書2.wikipedia3.科學松鼠會方法技術：1.文獻2.論壇丁香園生物秀小木蟲經(jīng)驗概念：43本次課程結(jié)束，謝謝大家本次課程結(jié)束，謝謝大家44免疫原和抗血清制備

——陳雪麗陳春婉馮慧婷侯純?nèi)靥m州大學2010級醫(yī)學檢驗二班免疫原和抗血清制備陳春婉馮慧婷侯純?nèi)?5案例一常州狂犬疫苗造假事件

該公司2008年生產(chǎn)的4個批次人用狂犬疫苗效價低于國家標準，可能導致疫苗接種后免疫抗體水平低，無法充分發(fā)揮疫苗應有的預防保護作用，屬于不合格產(chǎn)品。案例一常州狂犬疫苗造假事件46什么是疫苗？抗原？抗體？作用？1234什么是疫苗？抗原？抗體？作用？123447疫苗病原微生物及其代謝產(chǎn)物預防疾病用于人工主動免疫的生物制劑人工減毒、滅活、利用基因工程等經(jīng)過特殊處理的抗原疫苗病原微生物預防疾病用于人工主動免疫的生物制劑人工減毒、滅48免疫原和抗血清制備電子教案課件49疫苗的分類

傳統(tǒng)

新型

傳統(tǒng)

新型

傳統(tǒng)

新型類毒素重組抗原疫苗重組載體疫苗DNA疫苗減毒活疫苗滅活疫苗亞單位疫苗合成肽疫苗基因工程疫苗免疫原性強的病原微生物，如傷寒、霍亂等，理化方法滅活人工誘導變異或從自然界中篩選的毒力高度減弱的病原微生物用0.3%-0.4%甲醛處理，喪失毒性的外毒素去除有害成分，保留免疫原性成分，腦膜炎球菌莢膜疫苗將具有免疫原性的多肽抗原或氨基酸序列與適當載體或佐劑結(jié)合成的疫苗采用DNA重組技術制備的只含保護性抗原組分的基因工程疫苗將編碼病原體免疫原性的基因插入減毒的病毒或細菌，接種到人體將編碼抗原的基因轉(zhuǎn)入真核表達載體后注入人體，它需要人體細胞來利用這段基因自己表達抗原疫苗的分類傳統(tǒng)新型傳統(tǒng)50疫苗大致可以分為六大類：滅活疫苗，是被徹底殺死的病原，相當于把反動分子槍斃以后曝尸示眾，由于是已經(jīng)死掉的階級敵人，往往導致革命隊伍警惕性不很高，常需要反復刺激；減毒活疫苗，其實就是可以改造好的黑五類后代，經(jīng)過教育改造，已經(jīng)減弱或喪失了危害性，進入人體后現(xiàn)身說法介紹反革命分子的長相，并且可以繁殖供長期圍觀，效果很好，但也存在突然又反叛的危險，所以在篩選確認時耗費時間極長；類毒素疫苗，是處理后的細菌外毒素，相當于階級敵人的便便經(jīng)過消毒后給革命群眾作為識別特征；亞單位疫苗，是除去其他成分后提取病原體中有效免疫原所得，如多糖類疫苗等，相當于將謀逆賊子砍頭后傳首九邊以供識別；免疫原和抗血清制備電子教案課件51上述種種，均直接來源于病原，真正像照片的，其實是基因重組疫苗和DNA疫苗，它們都是對病原體照相——找到編碼免疫原的基因——這段基因相當于底片，在基因重組疫苗中，該基因被插入表達系統(tǒng)——比如把乙肝的HBS抗原基因植入酵母菌當中，酵母菌就是沖片機，表達出的抗原相當于沖印好的照片，經(jīng)過純化制成疫苗；DNA疫苗則是將編碼抗原的基因轉(zhuǎn)入真核表達載體后注入人體，它需要人體細胞來利用這段基因自己表達抗原相當于上級只發(fā)放底片，得自己沖洗。上述種種，均直接來源于病原，真正像照片的，其實是基因重組疫苗52免疫原疫苗抗原免疫原疫苗抗原53抗原誘導機體產(chǎn)生免疫應答（免疫原性）與免疫應答產(chǎn)物結(jié)合（抗原性）疫苗經(jīng)過特殊處理誘導機體產(chǎn)生免疫應答免疫原誘導機體產(chǎn)生免疫應答抗原半抗原

僅具有抗原性抗原誘導機體產(chǎn)生免疫應答（免疫原性）疫苗經(jīng)過特殊處理免疫原誘54疫苗都是免疫原？免疫原都是疫苗？免疫原都是抗原？抗原都是免疫原？疫苗都是免疫原？55疫苗免疫原抗原疫苗免疫原抗原56合格疫苗？安全性有效性專一性可獲得性適合大批量生產(chǎn)易保存經(jīng)濟合格疫苗？安全性57如何制備？疫苗的制造過程，大體上可以分成4部分：1.篩選種毒；2.擴繁病原；3.處理純化；4.驗證批簽。如何制備？疫苗的制造過程，大體上可以分成4部分：58如何制備？顆粒性抗原的制備（細胞、細菌、寄生蟲等）滅活疫苗細胞抗原（綿羊紅細胞）經(jīng)生理鹽水等溶液洗凈，配制成一定濃度；細菌抗原純菌增菌后處理制備菌體(O)抗原置于100℃水浴2-2.5h去除鞭毛(H)抗原；制備H抗原，菌液用0.3%-0.5%甲醛處理；制備細菌毒素抗原，殺菌后用0.5%-1%氯化鈣處理。如何制備？顆粒性抗原的制備（細胞、細菌、寄生蟲等）59可溶性抗原亞單位疫苗包括：蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂蛋白等來源：組織和細胞步驟：提取和純化可溶性抗原亞單位疫苗60粗提組織、細胞破碎，取上清組織勻漿：必須為新鮮或低溫保存高速組織搗碎機法；研磨法（腦、胰腺）2.細胞破碎：凍融法，緩慢融化，適用于細胞超聲破碎法，間歇進行，適用于細胞酶法，不易破壞內(nèi)含物成分，適用于微生物表面活性劑處理法，多用于細菌提取核酸粗提組織、細胞破碎，取上清61純化（以蛋白為例）超速離心法差速離心法分離大小和密度差異較大的顆粒

差速離心法原理示意圖純化（以蛋白為例）超速離心法差速離心法原理示意圖62純化密度梯度離心法將樣品放在惰性介質(zhì)（梯度液）中進行離心沉淀蔗糖、甘油、氯化銫等純化密度梯度離心法63純化特點適用于少數(shù)大分子抗原及某些比重較小的抗原純化64純化選擇性沉淀法鹽析法純度不高，適合初步純化，常用33%-35%飽和度的硫酸銨有機溶劑沉淀法必須在0℃下進行，常用乙醇和丙酮聚合物沉淀法PEG，分子量越大，PEG濃度越低核酸沉淀劑法硫酸魚精蛋白、核酸酶等去除核酸純化選擇性沉淀法65免疫原和抗血清制備電子教案課件66純化層析法1.凝膠層析法分子量不同2.離子交換柱層析法蛋白質(zhì)的等電點不同3.親和層析法生物分子結(jié)合的特異性和可逆性純化層析法67純化-凝膠層析法純化-凝膠層析法68純化-凝膠層析法純化-凝膠層析法69純化-離子交換層析1、樹脂類：分離氨基酸，孔徑??；2、纖維素類：分離蛋白質(zhì)，孔徑大純化-離子交換層析1、樹脂類：分離氨基酸，孔徑??；70純化-親和層析純化-親和層析71純化電泳法分子量電荷數(shù)量純化電泳法72純化

粗分級一般采用鹽析、有機溶劑分級等方法；

細分級一般采用層析法，包括凝膠層析、離子交換層析、親和層析等方法。

必要時，還可采用電泳法，包括等電聚焦等作為蛋白質(zhì)的提純步驟。純化粗分級一般采用鹽析、有機溶劑分級等方法；73細胞破碎固液分離粗分級細分級GoingUp細胞破碎固液分離粗分級細分級GoingUp74純化抗原的鑒定含量雙縮脲法、比濁法、酚試劑法、直接紫外吸收法等分子量SDS純度SDS、HPLC免疫活性雙向免疫擴散、ELISA等純化抗原的鑒定含量75瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳76瓊脂糖凝膠電泳-模式圖瓊脂糖凝膠電泳-模式圖77SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，使各種蛋白質(zhì)—SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，其數(shù)量遠遠超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，78人工抗原人工結(jié)合抗原（半抗原）人工合成抗原基因工程抗原人工抗原人工結(jié)合抗原（半抗原）79人工結(jié)合抗原半抗原（>=20）載體(1)蛋白質(zhì)牛血清蛋白多肽類聚合物多聚賴氨酸大分子聚合物羧甲基纖維素完全抗原物理化學羧甲基纖維素聚乙烯吡咯烷酮某些