遺傳性疾病的分子診斷12am課件

DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄

翻譯

核酸的分子雜交

基因結(jié)構(gòu)異?；虮磉_(dá)異常PCR

DNA測序

Nothern-blot

實(shí)時(shí)熒光定量PCR

反轉(zhuǎn)錄PCR

蛋白質(zhì)芯片

ELISA

蛋白組織化學(xué)染色Western-blot基因芯片

基因診斷的技術(shù)和方法DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄翻譯核酸的分子雜交基因結(jié)1遺傳性疾病分子診斷嚴(yán)永敏基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院遺傳性疾病分子診斷嚴(yán)永敏2遺傳性疾病診斷策略遺傳性疾病診斷策略3

1.點(diǎn)突變的診斷

方法有等位基因特異性寡核苷酸雜交（ASO）、PCR－ELISA、等位基因特異性擴(kuò)增（ASA）、PCR－RFLP、基因芯片技術(shù)進(jìn)行診斷；對于一些基因背景未知的點(diǎn)突變，可以采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）、變性梯度凝膠電泳（DEEG）、異源雙鏈分析（HA）、DNA序列測定、蛋白截短測試等方法。1.點(diǎn)突變的診斷方法有等位基因特異性寡核4一、限制性內(nèi)切酶法（RE法）導(dǎo)致某一限制酶識(shí)別位點(diǎn)移位的大片段缺失或插入，

導(dǎo)致某一限制酶識(shí)別位點(diǎn)喪失或獲得的點(diǎn)突變，均可引起相應(yīng)限制性片段的長度和數(shù)量發(fā)生變化。分析限制性酶切圖，即可診斷出此類突變。一、限制性內(nèi)切酶法（RE法）導(dǎo)致某一限制酶識(shí)別位點(diǎn)5×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′6+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮7二、ASO探針雜交受檢者基因組DNA或含突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)記的ASO探針雜交主要適用于檢測已知點(diǎn)突變ASO1ASO2NormalHeteroHomo二、ASO探針雜交受檢者基因組DNA或含主要適用于檢測已知點(diǎn)8遺傳性疾病的分子診斷12am9遺傳性疾病的分子診斷12am10PCR-SSCPPCR-SSCP112.片段性突變的檢測

片段性突變是指DNA分子中較大范圍的堿基發(fā)生突變，如堿基的缺失、插入、擴(kuò)增和重組。對于少數(shù)核苷酸缺失或插入，可以采用檢測點(diǎn)突變的方法，而對于大的片段突變，則使用Southern印跡技術(shù)和多重PCR技術(shù)。2.片段性突變的檢測片段性突變是指DNA分子中較12杜氏和貝氏肌營養(yǎng)不良癥的基因診斷

多重PCR檢測患者缺失凝膠電泳圖（9對引物）P1除外顯子1外其余均缺失；P2外顯子8－19有小的缺失；P3外顯子44-50缺失；P4外顯子45－52有小的缺失；B1空白對照；C1、C2正常對照。杜氏和貝氏肌營養(yǎng)不良癥的基因診斷多重PCR檢測患者缺失凝13遺傳性疾病診斷策略遺傳性疾病診斷策略14

DNA多態(tài)（DNAPolymorphism）：群體中每個(gè)個(gè)體DNA區(qū)域中等位基因（或片段）存在兩種或兩種以上的形式，對基因功能沒有影響，稱DNA多態(tài)。它通過孟德爾方式遺傳。常用做遺傳分析中的標(biāo)記。DNA多態(tài)（DNAPolymorphism）：15將與致病基因連鎖的某種多態(tài)性標(biāo)志作為遺傳標(biāo)志，在同一個(gè)家系成員中探查是否存在致病基因的方法即為基因連鎖分析法。

基因連鎖分析將與致病基因連鎖的某種多態(tài)性標(biāo)志作為遺傳16常用的遺傳性多態(tài)性標(biāo)記有3類：1）RFLP：

稱限制性片段長度多態(tài)性，為第一代多態(tài)性標(biāo)記；2）重復(fù)序列多態(tài)性（VNTR）：如短串聯(lián)重復(fù)序列（STR），為第二代多態(tài)性標(biāo)記；3）單核苷酸多態(tài)性（SNP）DNA序列的單個(gè)核苷酸的差別，為第三代多態(tài)性標(biāo)記。常用的遺傳性多態(tài)性標(biāo)記有3類：1）RFLP：17遺傳性疾病的分子診斷12am18遺傳性疾病的分子診斷12am191Southernblot--RFLP診斷(PKU)間接基因診斷PAH基因兩側(cè)有Msp1酶切位點(diǎn),用該酶消化可產(chǎn)生23kb、19kb兩種等位片段，以PAHcDNA為探針與PKU家系成員外周血DNA雜交。1Southernblot--RFLP診斷(PKU)間接20患者為19kb片段的純合子,說明患者缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖其父、母親缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖，其23kb片段與正常PAH基因連鎖。II2為23kb和19kb片段的雜合子，為表型正常的致病基因攜帶者。間接基因診斷患者為19kb片段的純合子,說明患者缺陷的PAH間接基因診斷21數(shù)目變異串聯(lián)重復(fù)

variablenumbertandemrepeats,VNTR重復(fù)序列以各自的核心序列（重復(fù)單元），首尾相連多次重復(fù)，稱為串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)即VNTR。散在分布于染色體上。重復(fù)單位6~25bp長，稱為小衛(wèi)星DNA。

重復(fù)單位2~6bp長，如（TA）n,(CGG)n等，稱為微衛(wèi)星DNA，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)。數(shù)目變異串聯(lián)重復(fù)

variablenumbertande22VNTR兩側(cè)酶切位點(diǎn)固定，但兩酶切點(diǎn)之間的串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)不同，酶切后產(chǎn)生不同長度的片段。DNA多態(tài)可以通過PCR擴(kuò)增后電泳來檢出，稱擴(kuò)增片段長度多態(tài)（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,Amp-FLP）VNTR兩側(cè)酶切位點(diǎn)固定，但兩酶切點(diǎn)之間的串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)不同23VNTR酶切，電泳后的檢測結(jié)果

大小VNTR酶切，電泳后的檢測結(jié)果

大小24PCR-VNTR檢測PCR-VNTR檢測25PCR-VNTRPCR-VNTR26成年型多囊腎病的診斷例：成年型多囊腎病——APKD，AD，臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結(jié)石。最終導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機(jī)理也尚未闡明，但已證實(shí)APKDGene與α珠蛋白基因3`端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列（3`HVR）緊密連鎖，因此，可以通過VNTR連鎖分析進(jìn)行診斷。間接基因診斷成年型多囊腎病的診斷例：成年型多囊腎病——APKD，AD，27以3`HVR為探針，與PvuII酶切后的家系有關(guān)成員的基因組DNA進(jìn)行SouthernBlot

基因組DNAPvuII酶切DNA片段變性轉(zhuǎn)膜探針變性雜交結(jié)果分析間接基因診斷以3`HVR為探針，與PvuII酶切后的家系有關(guān)成員281212345

5.7kb3.4kb2.3kb

間接基因診斷12間接基因29結(jié)果分析患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段，說明致病基因與3.4kb片段連鎖，并按孟德爾方式遺傳。II5不含3.4kb片段，產(chǎn)前診斷正常。間接基因診斷結(jié)果分析患者（I1、II1和II2）有3.430單核苷酸多態(tài)SingleNucleiotidePolymorphism，SNPSNP：發(fā)生在基因組中的單個(gè)核苷酸的替代根據(jù)SNP在基因中的位置，分為：基因編碼區(qū)SNP基因周邊SNP基因間SNP在人類基因組中每100~300個(gè)核苷酸就有一個(gè)SNP單核苷酸多態(tài)SNP：發(fā)生在基因組中的單個(gè)核苷酸的替代31遺傳性疾病的主要分子機(jī)理是基因突變，因而是基因診斷的最佳適應(yīng)癥?；蛟\斷在遺傳性疾病中的應(yīng)用

遺傳性疾病的主要分子機(jī)理是基因突變，32血紅蛋白病最早成功進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷可分為兩大類：異常血紅蛋白病（abnormalhemoglobinsyndrome）地中海貧血（thalassemia）一、

遺傳性疾病血紅蛋白病可分為兩大類：一、遺傳性疾病331）異常血紅蛋白病珠蛋白基因突變（單鹼基替代、缺失或插入等）

鐮狀細(xì)胞貧血：

b-珠蛋白基因第6位密碼子GAG→GTG(E6V)該突變使限制酶MstII位點(diǎn)消失(CCTGAGG→CCTGTGG)

診斷方法：限制性酶切圖譜直接分析法(基因組DNA或PCR產(chǎn)物)ASO斑點(diǎn)印跡雜交分析法

(ASO=等位基因特異性寡核苷酸探針)1）異常血紅蛋白病34×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′35+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮36

b-珠蛋白基因點(diǎn)突變

GAG(Glu)-->GTG(Val)

bAprobeACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCbSprobeACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC

HeterobAprobebSprobeHomoNormalHeterobAprobebSprobeHomoNorm37

a-地中海貧血：

不同數(shù)量(1-4個(gè))a-珠蛋白基因缺失或點(diǎn)突變等aa

14kbBamHIBamHIaa/aaaa/--aa/a-a-/----/--10kb14kb10kb

a

2）地中海貧血

珠蛋白基因缺失或基因中某些鹼基替代→影響a-或b-珠蛋白鏈的合成速率→a-或b-地貧診斷方法：PCR、酶切圖譜法、PCR-ARMS、PCR-ASO2）地中海貧血診斷方法：PCR、酶切圖譜法、PCR-AR38b-地中海貧血主要是b-珠蛋白基因點(diǎn)突變。突變常不涉及限制酶識(shí)別位點(diǎn)不能用限制性酶切圖譜進(jìn)行直接分析。診斷方法：RFLP連鎖分析間接檢測病變基因ASO斑點(diǎn)印跡雜交分析直接檢測病變基因點(diǎn)突變DNA芯片（包括各種基因突變位點(diǎn)的所有探針）可快速、簡便地檢出所有已知突變

b-地中海貧血主要是b-珠蛋白基因點(diǎn)突變。39甲型血友?。ㄑ巡）凝血因子VIII（FVIII）缺乏所致，發(fā)病的分子機(jī)制是FVIII基因突變，主要為點(diǎn)突變或少數(shù)鹼基的缺失和插入以及第22內(nèi)含子的大片段倒位。乙型血友?。ㄑ巡）起因于凝血因子IX的缺乏其分子機(jī)制是分布于整個(gè)基因各處的多種形式的突變。

診斷方法：PCR/ASO直接檢測法（點(diǎn)突變）PCR/RFLP連鎖分析法（多種不定突變）（2）血友病（haemophilia）

（2）血友?。╤aemophilia）40DMD的基因檢測

Duchennemusculardystrophy(DMD)是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X連鎖的遺傳性疾病，在3500個(gè)活產(chǎn)男嬰中即有一個(gè)患者。DMD基因的全長為250kb，有79個(gè)外顯子。DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占60%~70%。DMD的基因檢測Duchennemusculardys41DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄

翻譯

核酸的分子雜交

基因結(jié)構(gòu)異?；虮磉_(dá)異常PCR

DNA測序

Nothern-blot

實(shí)時(shí)熒光定量PCR

反轉(zhuǎn)錄PCR

蛋白質(zhì)芯片

ELISA

蛋白組織化學(xué)染色Western-blot基因芯片

基因診斷的技術(shù)和方法DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄翻譯核酸的分子雜交基因結(jié)42遺傳性疾病分子診斷嚴(yán)永敏基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院遺傳性疾病分子診斷嚴(yán)永敏43遺傳性疾病診斷策略遺傳性疾病診斷策略44

1.點(diǎn)突變的診斷

方法有等位基因特異性寡核苷酸雜交（ASO）、PCR－ELISA、等位基因特異性擴(kuò)增（ASA）、PCR－RFLP、基因芯片技術(shù)進(jìn)行診斷；對于一些基因背景未知的點(diǎn)突變，可以采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）、變性梯度凝膠電泳（DEEG）、異源雙鏈分析（HA）、DNA序列測定、蛋白截短測試等方法。1.點(diǎn)突變的診斷方法有等位基因特異性寡核45一、限制性內(nèi)切酶法（RE法）導(dǎo)致某一限制酶識(shí)別位點(diǎn)移位的大片段缺失或插入，

導(dǎo)致某一限制酶識(shí)別位點(diǎn)喪失或獲得的點(diǎn)突變，均可引起相應(yīng)限制性片段的長度和數(shù)量發(fā)生變化。分析限制性酶切圖，即可診斷出此類突變。一、限制性內(nèi)切酶法（RE法）導(dǎo)致某一限制酶識(shí)別位點(diǎn)46×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正常基因5′3′47+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮48二、ASO探針雜交受檢者基因組DNA或含突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)記的ASO探針雜交主要適用于檢測已知點(diǎn)突變ASO1ASO2NormalHeteroHomo二、ASO探針雜交受檢者基因組DNA或含主要適用于檢測已知點(diǎn)49遺傳性疾病的分子診斷12am50遺傳性疾病的分子診斷12am51PCR-SSCPPCR-SSCP522.片段性突變的檢測

片段性突變是指DNA分子中較大范圍的堿基發(fā)生突變，如堿基的缺失、插入、擴(kuò)增和重組。對于少數(shù)核苷酸缺失或插入，可以采用檢測點(diǎn)突變的方法，而對于大的片段突變，則使用Southern印跡技術(shù)和多重PCR技術(shù)。2.片段性突變的檢測片段性突變是指DNA分子中較53杜氏和貝氏肌營養(yǎng)不良癥的基因診斷

多重PCR檢測患者缺失凝膠電泳圖（9對引物）P1除外顯子1外其余均缺失；P2外顯子8－19有小的缺失；P3外顯子44-50缺失；P4外顯子45－52有小的缺失；B1空白對照；C1、C2正常對照。杜氏和貝氏肌營養(yǎng)不良癥的基因診斷多重PCR檢測患者缺失凝54遺傳性疾病診斷策略遺傳性疾病診斷策略55

DNA多態(tài)（DNAPolymorphism）：群體中每個(gè)個(gè)體DNA區(qū)域中等位基因（或片段）存在兩種或兩種以上的形式，對基因功能沒有影響，稱DNA多態(tài)。它通過孟德爾方式遺傳。常用做遺傳分析中的標(biāo)記。DNA多態(tài)（DNAPolymorphism）：56將與致病基因連鎖的某種多態(tài)性標(biāo)志作為遺傳標(biāo)志，在同一個(gè)家系成員中探查是否存在致病基因的方法即為基因連鎖分析法。

基因連鎖分析將與致病基因連鎖的某種多態(tài)性標(biāo)志作為遺傳57常用的遺傳性多態(tài)性標(biāo)記有3類：1）RFLP：

稱限制性片段長度多態(tài)性，為第一代多態(tài)性標(biāo)記；2）重復(fù)序列多態(tài)性（VNTR）：如短串聯(lián)重復(fù)序列（STR），為第二代多態(tài)性標(biāo)記；3）單核苷酸多態(tài)性（SNP）DNA序列的單個(gè)核苷酸的差別，為第三代多態(tài)性標(biāo)記。常用的遺傳性多態(tài)性標(biāo)記有3類：1）RFLP：58遺傳性疾病的分子診斷12am59遺傳性疾病的分子診斷12am601Southernblot--RFLP診斷(PKU)間接基因診斷PAH基因兩側(cè)有Msp1酶切位點(diǎn),用該酶消化可產(chǎn)生23kb、19kb兩種等位片段，以PAHcDNA為探針與PKU家系成員外周血DNA雜交。1Southernblot--RFLP診斷(PKU)間接61患者為19kb片段的純合子,說明患者缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖其父、母親缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖，其23kb片段與正常PAH基因連鎖。II2為23kb和19kb片段的雜合子，為表型正常的致病基因攜帶者。間接基因診斷患者為19kb片段的純合子,說明患者缺陷的PAH間接基因診斷62數(shù)目變異串聯(lián)重復(fù)

variablenumbertandemrepeats,VNTR重復(fù)序列以各自的核心序列（重復(fù)單元），首尾相連多次重復(fù)，稱為串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)即VNTR。散在分布于染色體上。重復(fù)單位6~25bp長，稱為小衛(wèi)星DNA。

重復(fù)單位2~6bp長，如（TA）n,(CGG)n等，稱為微衛(wèi)星DNA，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)。數(shù)目變異串聯(lián)重復(fù)

variablenumbertande63VNTR兩側(cè)酶切位點(diǎn)固定，但兩酶切點(diǎn)之間的串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)不同，酶切后產(chǎn)生不同長度的片段。DNA多態(tài)可以通過PCR擴(kuò)增后電泳來檢出，稱擴(kuò)增片段長度多態(tài)（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,Amp-FLP）VNTR兩側(cè)酶切位點(diǎn)固定，但兩酶切點(diǎn)之間的串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)不同64VNTR酶切，電泳后的檢測結(jié)果

大小VNTR酶切，電泳后的檢測結(jié)果

大小65PCR-VNTR檢測PCR-VNTR檢測66PCR-VNTRPCR-VNTR67成年型多囊腎病的診斷例：成年型多囊腎病——APKD，AD，臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結(jié)石。最終導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機(jī)理也尚未闡明，但已證實(shí)APKDGene與α珠蛋白基因3`端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列（3`HVR）緊密連鎖，因此，可以通過VNTR連鎖分析進(jìn)行診斷。間接基因診斷成年型多囊腎病的診斷例：成年型多囊腎病——APKD，AD，68以3`HVR為探針，與PvuII酶切后的家系有關(guān)成員的基因組DNA進(jìn)行SouthernBlot

基因組DNAPvuII酶切DNA片段變性轉(zhuǎn)膜探針變性雜交結(jié)果分析間接基因診斷以3`HVR為探針，與PvuII酶切后的家系有關(guān)成員691212345

5.7kb3.4kb2.3kb

間接基因診斷12間接基因70結(jié)果分析患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段，說明致病基因與3.4kb片段連鎖，并按孟德爾方式遺傳。II5不含3.4kb片段，產(chǎn)前診斷正常。間接基因診斷結(jié)果分析患者（I1、II1和II2）有3.471單核苷酸多態(tài)SingleNucleiotidePolymorphism，SNPSNP：發(fā)生在基因組中的單個(gè)核苷酸的替代根據(jù)SNP在基因中的位置，分為：基因編碼區(qū)SNP基因周邊SNP基因間SNP在人類基因組中每100~300個(gè)核苷酸就有一個(gè)SNP單核苷酸多態(tài)SNP：發(fā)生在基因組中的單個(gè)核苷酸的替代72遺傳性疾病的主要分子機(jī)理是基因突變，因而是基因診斷的最佳適應(yīng)癥?；蛟\斷在遺傳性疾病中的應(yīng)用

遺傳性疾病的主要分子機(jī)理是基因突變，73血紅蛋白病最早成功進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷可分為兩大類：異常血紅蛋白?。╝bnormalhemoglobinsyndrome）地中海貧血（thalassemia）一、

遺傳性疾病血紅蛋白病可分為兩大類：一、遺傳性疾病741）異常血紅蛋白病珠蛋白基因突變（單鹼基替代、缺失或插入等）

鐮狀細(xì)胞貧血：

b-珠蛋白基因第6位密碼子GAG→GTG(E6V)該突變使限制酶MstII位點(diǎn)消失(CCTGAGG→CCTGTGG)

診斷方法：限制性酶切圖譜直接分析法(基因組DNA或PCR產(chǎn)物)ASO斑點(diǎn)印跡雜交分析法

(ASO=等位基因特異性寡核苷酸探針)1）異常血紅蛋白病75×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′76+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮77

b-珠蛋白基因點(diǎn)突變

GAG(Glu)-->GTG(Val)

bAprobeACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCbSprobeACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC

HeterobAprobebSprobeHomoNormalHeterobAprobebSprobeHomoNorm78

a-地中海貧血：

不同數(shù)量(1-4個(gè))a-珠蛋白基因缺失或點(diǎn)突變等aa

14kbBamHI