醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)xxx公司醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)文件編號(hào)：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計(jì)，管理制度醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室第一次實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2.實(shí)驗(yàn)室規(guī)則實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3.細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察技術(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容4.染色標(biāo)本的制備—革藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課是該專業(yè)課程的重要組成部分，指導(dǎo)學(xué)生上好實(shí)驗(yàn)課是教學(xué)過程中的重要環(huán)節(jié)，學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)課的目的是：1.使學(xué)生加深理解并鞏固理論知識(shí)，學(xué)習(xí)和掌握有關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，為以后的醫(yī)學(xué)專業(yè)課學(xué)習(xí)打好基礎(chǔ)：2.在實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考和分析問題的能力，主動(dòng)參與實(shí)驗(yàn)的動(dòng)手能力及獨(dú)立工作的能力。訓(xùn)練學(xué)生嚴(yán)格的科學(xué)作風(fēng)、嚴(yán)肅白的科學(xué)態(tài)度和嚴(yán)密的工作方法。3.培養(yǎng)學(xué)生在集體工作環(huán)境中互幫互讓，團(tuán)結(jié)協(xié)作，共同完成好實(shí)驗(yàn)的精神品德。為了達(dá)到上述目的，提高實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)效果，特提出以下要求：1.實(shí)驗(yàn)課前做好預(yù)習(xí)，明確本次實(shí)驗(yàn)課的內(nèi)容及其原理、方法及注意事項(xiàng)；2.實(shí)驗(yàn)中要仔細(xì)認(rèn)真，注意分工與協(xié)作，操作實(shí)驗(yàn)要按操作步驟進(jìn)行。學(xué)會(huì)正確操作手法、準(zhǔn)確記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。示教實(shí)驗(yàn)要注意觀察，并記錄好相關(guān)內(nèi)容；3.詳細(xì)討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提倡同學(xué)之間互幫互學(xué)，并緊密聯(lián)系理論課內(nèi)容。要注意不論實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論符合與否，都有討論的價(jià)值，并分析其原因，有可能的話還應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)；4.嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)則，在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課上，要樹立“有菌觀點(diǎn)”，嚴(yán)格掌握和不斷完善無菌操作技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)室規(guī)則一、進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室須穿工作服、戴工作帽。除必要的書籍文具外，其它個(gè)人物品一律不得帶入實(shí)驗(yàn)室。二、在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，禁止飲食、吸煙及與學(xué)習(xí)無關(guān)的其它活動(dòng)，不得大聲喧嘩或嘻戲。三、未經(jīng)老師許可，不得擅自搬動(dòng)實(shí)驗(yàn)器材及示教物品，不準(zhǔn)隨意擺弄和旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)儀器上的開關(guān)及旋扭等。四、按照實(shí)驗(yàn)要求，在老師的指導(dǎo)下，主動(dòng)安排要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，認(rèn)真進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，爭(zhēng)取順利地完成實(shí)驗(yàn)。五、實(shí)驗(yàn)中使用完畢的器材和試劑，必須放回規(guī)定的位置。廢棄物必須按規(guī)定進(jìn)行處理或歸放于指定的容器內(nèi)，不能隨便亂丟亂放。六、實(shí)驗(yàn)中萬一有菌液打翻、有菌材料污染桌面或衣物、割破手指等意外情況，應(yīng)及時(shí)報(bào)告老師進(jìn)行處理，切勿自作主張不按規(guī)定處理。七、愛護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一切設(shè)備、掛圖、儀器。注意節(jié)約使用消耗材料及藥品試劑，注意用電安全及節(jié)約水電。八、實(shí)驗(yàn)結(jié)束，要清理桌面，將實(shí)驗(yàn)器材放回原處。值日同學(xué)要搞好實(shí)驗(yàn)室的清潔衛(wèi)生，保持室內(nèi)整齊，離開實(shí)驗(yàn)室前要關(guān)好門窗、水、電，并將手洗干凈。九、未經(jīng)許可，不得將實(shí)驗(yàn)室內(nèi)任何物品帶出實(shí)驗(yàn)室。

實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察技術(shù)將細(xì)菌培養(yǎng)物或含菌標(biāo)本材料制備的染色標(biāo)本片，置顯微鏡油鏡頭下，可以觀察到細(xì)菌的形狀、大小、結(jié)構(gòu)、排列及染色特性等，了解這些特征有助于鑒別各種細(xì)菌。一、顯微鏡油鏡頭的使用與保護(hù)【使用原理】用油鏡觀察標(biāo)本、是在使用高倍鏡的基礎(chǔ)上，采用同玻璃折光率相似的油狀物（如香柏油、液體石臘等），滴加在標(biāo)本與油鏡頭中間，以避免光線散射，提高顯微鏡的清晰度和分辨能力。使觀察物象更加清楚明了?！静僮鞣椒ā?.調(diào)試：打開電源，先采用低倍鏡，使視野達(dá)到清晰光亮。2.加油：雙手向上轉(zhuǎn)動(dòng)粗螺旋，使鏡筒上升，將標(biāo)本片固定于載物臺(tái)上，使染色面對(duì)準(zhǔn)集光器央，加鏡油于標(biāo)本面，調(diào)換油鏡頭對(duì)準(zhǔn)標(biāo)本面。3.調(diào)焦點(diǎn)：用左手向下輕轉(zhuǎn)粗螺旋，使鏡筒下降，同時(shí)眼睛從右側(cè)觀察下降程度，待鏡頭入油后接觸上玻片，用眼觀目鏡，反轉(zhuǎn)粗螺旋，使鏡筒慢慢上升，待看到模糊物象時(shí)，改用細(xì)螺旋上下調(diào)節(jié)，使物像達(dá)到完全清晰為宜（一般轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)前后半圈）。4.觀察：觀察時(shí)只使用細(xì)調(diào)。需改換視野時(shí)，右手操縱推進(jìn)器，左手轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)螺旋，做到配合自如。并養(yǎng)成左眼觀察，右眼繪圖的習(xí)慣?！居顽R頭的保護(hù)】油鏡頭使用完結(jié)后，必須用擦鏡紙滴加少量二甲苯將油擦洗干凈（二甲苯用量宜少，以免鏡片間粘膠溶解）。下降集光器，半接物鏡轉(zhuǎn)成“八”字，再下降鏡筒，輕觸鏡臺(tái)表面，雙手平持顯微放入鏡箱，避免直射日光，置于干燥處，以防受潮?！咀⒁馐马?xiàng)】1.使用直筒顯微鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須兩眼同時(shí)睜開，訓(xùn)練使用左眼觀察，右眼繪圖。如用油鏡頭觀察，勿將鏡身歪斜，避免鏡油流出片面。2.觀察染色標(biāo)本時(shí)，光線宜強(qiáng)，可上升集光器，開大光圈。觀察不染色標(biāo)本時(shí)，光源宜弱，可下降集光器，縮小光圈。3.使用完畢，一定擦去鏡油。二、細(xì)菌不染色標(biāo)本不染色的細(xì)菌和標(biāo)本鏡檢，雖可觀察細(xì)菌在自然生活狀態(tài)下的大小、形態(tài)、活動(dòng)等，但主要用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力。（一）懸滴法【材料】1.細(xì)菌：枯草桿菌8~12小時(shí)肉湯培養(yǎng)物。2.凹玻片，蓋玻片，凡士林等?！痉椒ā?.取凹玻片一張，于凹窩周圍涂少許凡士林（見圖1）。圖1懸滴法2.用接種環(huán)沾取枯草桿菌8~12小時(shí)培養(yǎng)物，置于蓋玻片中央。3.反轉(zhuǎn)凹玻片，使凹窩對(duì)準(zhǔn)蓋玻片中央，蓋于其上，輕壓后，迅速翻轉(zhuǎn)玻片，使蓋破片面向上。4.標(biāo)本片置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用弱光線，低倍鏡找物象，再改換高倍鏡觀察，密切注意，勿壓破蓋玻片。5.觀察：細(xì)菌在鏡下為灰色半透明體，并呈現(xiàn)真運(yùn)動(dòng)，如在明亮的海洋中，深入淺出游來動(dòng)去。（二）壓滴法用途同懸滴法?！静牧稀?.細(xì)菌：枯草桿菌8~12小時(shí)肉湯培養(yǎng)物。2.載物玻片：蓋玻片等。【方法】1.取無油污物玻片1張。2.用接種環(huán)沾取枯草桿菌8~12小時(shí)肉湯培養(yǎng)物置于載物玻片中央。3.加蓋玻片于菌液表面，觀察方法同懸滴法。三、細(xì)菌染色標(biāo)本片的制備（操作）由于細(xì)菌個(gè)體微小，基本上無色透明，故將其用適當(dāng)染料染色觀察，方能顯示它的形態(tài)、大小、構(gòu)造及染色特性等，在細(xì)菌和鑒別上有重要意義?！静牧稀?.葡萄球菌大腸桿菌18~24小時(shí)普通瓊脂斜面培養(yǎng)物。2.革蘭染色液。3.生理鹽水，載物玻片，接種環(huán)等?！痉椒ā浚ㄒ唬┘?xì)菌涂片的制作1.涂片：取清潔無油污載物玻片一張，接種環(huán)沾取生理鹽水1~2環(huán)置于玻片中央，再將接種環(huán)火焰滅菌待冷后，沾取葡萄球菌或大腸桿菌菌苔少許，混于生理鹽水中，輕輕涂成均勻薄膜。2.干燥：室溫自然干燥，也可將涂面向上，遠(yuǎn)離火焰上方微加溫干燥（切勿加熱過度，以防將標(biāo)本燒枯）。3.固定：標(biāo)本干燥后，通過酒精燈火焰三次（約2~3秒鐘），以殺死細(xì)菌并使之固定于玻片上。4.染色：可根據(jù)不同的染色要求，用相應(yīng)染色液進(jìn)行染色。（二）革蘭染色法：涂片的制備方法同前，革蘭染色方法可分為四步。1.初染：于涂抹面上滴加結(jié)晶紫染液數(shù)滴，覆蓋整個(gè)涂面，室溫作用一分鐘。用自來水輕輕沖洗，甩干水分。2.媒染：滴加魯戈碘液，室溫作用一分鐘，自來水沖洗，甩干水分。3.脫色：將載物玻片浸于95%酒精缸中，上下提取，邊提邊看，見涂面無色素下流為止（約30秒鐘）。自來水沖洗，甩干水分。4.復(fù)染：加稀釋復(fù)紅染液染30秒鐘，自來水沖洗，吸水紙吸干玻片水分。5.加油鏡檢：染色片待干后，于油鏡下，調(diào)強(qiáng)光視野觀察，呈紫色的為革蘭陽性菌，呈紅色的為革蘭陰性菌。（三）美蘭染色法【方法】將涂片固定滴加美蘭染液于玻片上，染1~2分鐘，水洗、待干、鏡檢?！窘Y(jié)果】此法為單染色法，菌體和細(xì)胞均染成藍(lán)色。常用于腦膜炎球菌及白喉?xiàng)U菌等細(xì)菌染色。四、細(xì)菌基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)觀察（一）基本形態(tài)（示教）1.球形：葡萄球菌革蘭染色標(biāo)本片——菌體正園形，染成蘭紫色，呈現(xiàn)葡萄串狀排列。G+球菌。2.桿形：大腸桿菌革蘭染色標(biāo)本片——菌體短桿狀，染成紅色，呈分散排列。G-桿菌。3.螺形：霍亂弧菌革蘭染色標(biāo)本片——菌體弧形，染成紅色，呈分散排列。G-弧菌。（二）特殊結(jié)構(gòu)示教1.鞭毛：傷寒桿菌鞭毛染色片——菌體較粗大桿狀，染成蘭灰色，單個(gè)或成堆存在，周圍可見到波浪狀彎曲、較長(zhǎng)、呈蘭灰色的鞭毛。2．莢膜：肺炎雙球菌莢膜染色片——視野背景為紅色，其中可見到染色呈深紅色，矛頭狀菌體，縱向成雙排列，菌體周圍有未染上顏色的空白區(qū)，即莢膜。3.芽胞：破傷風(fēng)梭菌芽胞染色片——菌體為細(xì)長(zhǎng)桿狀，頂端有染成紅色、并大于菌體的球狀物即芽胞，呈“鼓槌狀”，其他散亂分布的紅色球體，為菌體脫落的成熟芽胞?！陡戒洝犯锾m（Gram）染液的配制1.結(jié)晶紫染液將1份結(jié)晶紫酒精飽和液與4份1%草酸銨水溶液混合即成（14克結(jié)晶紫加95%酒精100毫升即為酒精飽和溶液）。2.魯戈（Lugol）碘液碘1克碘化鉀2克蒸餾水300毫升3.稀釋復(fù)紅液1份鹼性復(fù)紅飽和液（鹼性復(fù)紅3.2克溶于95%酒精100毫升中。即為鹼性復(fù)紅飽和溶液）加9份5%石炭酸水溶液，先配成石炭酸復(fù)紅染液（抗酸染色用），取1份石炭酸復(fù)紅染液加9份蒸餾水即為稀釋復(fù)紅染液。第二次實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1；細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)（操作）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2；細(xì)菌的生化反應(yīng)檢測(cè)（示教）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3：播放錄象—《細(xì)菌感染的檢查方法和防治原則》實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)給細(xì)菌提供適宜的條件，細(xì)菌即可以生長(zhǎng)繁殖，形成具有一定特征的培養(yǎng)物，學(xué)習(xí)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)可以純化細(xì)菌，了解細(xì)菌的生長(zhǎng)特征，并能進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)菌生化反應(yīng)、變異性，制備細(xì)菌抗原，深入進(jìn)行分子生物學(xué)工作等。了解細(xì)菌的培養(yǎng)特征也有助于鑒別細(xì)菌。細(xì)菌培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基是用人工方法將適合細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的各種營養(yǎng)物配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)，以供細(xì)菌培養(yǎng)使用。一般培養(yǎng)基的主要成份為蛋白質(zhì)、糖類、鹽類、水分等。另外還有一些營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌，還必須加入血液或血清、雞蛋、維生素等其他營養(yǎng)物質(zhì)。有時(shí)為了鑒別或抑制某些細(xì)菌，則可加入各種專用基質(zhì)（如某種糖類、氨基酸等），指示劑，染料等。由于對(duì)培養(yǎng)基的使用目的不同，故在培養(yǎng)基的選擇上有所不同。按其物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。按其成分和用途可分為普通培養(yǎng)基，鑒別培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基和專用培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基需加入小試管、中試管、三角瓶、平皿等內(nèi)使用。培養(yǎng)基的種類很多，但一般制備原則有三條：1.足夠和適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)成份。籍以滿足細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的要求，獲得典型細(xì)菌培養(yǎng)物，達(dá)到研究細(xì)菌的形態(tài)，生化反應(yīng)，抗原結(jié)構(gòu)及致病力等方面的目的。2.合適的酸鹼度。培養(yǎng)基的酸鹼度直接影響細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。一般細(xì)菌最合適PH為7.2~7.6。測(cè)定的方法常用普通比色法或精密PH試紙來測(cè)定（見附錄）。3.絕對(duì)無菌。培養(yǎng)基務(wù)必進(jìn)行除菌處理，由于培養(yǎng)基所含成份不同，除菌的方法也不同。如普通培養(yǎng)基常用高壓蒸氣滅菌法。一、常用培養(yǎng)基的制備（一）普通肉湯培養(yǎng)基【材料】1.新鮮牛肉或牛肉膏，蛋白胨，氯化鈉，瓊脂，蒸餾水。2.酚紅指標(biāo)劑，比色架及標(biāo)準(zhǔn)比色管或精密PH試紙。3.漏斗，量筒，三角燒瓶，試管等?！痉椒ā?.稱取去脂去腱絞碎的鮮牛肉500克，浸于1000毫升蒸餾水中，冰箱過夜，次日煮沸30分鐘，紗布過濾，蒸餾水補(bǔ)足其量，（也可用牛肉膏3克加蒸餾水1000毫升加熱溶化），即為肉浸液。2.取肉浸液1000毫，氯化鈉5克，蛋白胨10克混合加熱溶化。3.調(diào)整PH為7.6，用濾紙過濾分裝于中試管或三角燒瓶?jī)?nèi)，塞緊棉塞?！居猛尽抗┗A(chǔ)培養(yǎng)基用，營養(yǎng)比肉膏湯好，一般營養(yǎng)要求不高的菌均可生長(zhǎng)。（二）普通瓊脂培養(yǎng)基瓊脂是石花菜等海藻類提取的膠體物質(zhì)，其化學(xué)成份主要是多糖。當(dāng)溫度達(dá)到98℃以上可溶解于水，45【材料與方法】普通肉湯培養(yǎng)基100毫升，加入瓊脂2~3克，加熱溶化，用蒸餾水補(bǔ)足失去水分，調(diào)整PH為7.6后分裝中試管、平皿等器皿，高壓蒸氣15磅滅菌20分鐘，可制成普通瓊脂斜面和普通瓊脂平板?！居猛尽抗┮话慵?xì)菌培養(yǎng)用，并可作無糖基培養(yǎng)基。（三）半固體培養(yǎng)基【材料與方法】取普通肉湯培養(yǎng)基100毫升，加入瓊脂0.5~0.7克，加熱溶化。調(diào)整PH為7.6，分裝于小試管內(nèi)，每管1~5毫升，高壓蒸氣磅滅菌20分鐘，待冷后放入4℃【用途】保存一般菌種用，并可觀察細(xì)菌的動(dòng)力及生化反應(yīng)。（四）血液瓊脂培養(yǎng)基【材料與方法】將高壓滅菌后普通瓊脂培養(yǎng)基。冷至45℃~50【用途】供營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌分離培養(yǎng)用，亦可觀察細(xì)菌的溶血特征。二、細(xì)菌接種技術(shù)及生長(zhǎng)表現(xiàn)由于細(xì)菌感染而致病的各種標(biāo)本及帶菌者所需檢查的各種標(biāo)本，往往并非單一的細(xì)菌，而混有其它非致病菌（人體正常菌群）。因此當(dāng)對(duì)此標(biāo)本須作出細(xì)菌鑒定時(shí)，就必須從標(biāo)本中分離出致病菌，稱為細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)。另外，對(duì)已得到可疑病菌進(jìn)行細(xì)菌鑒定及菌種保存等培養(yǎng)，稱為純培養(yǎng)接種技術(shù)。（一）平板劃線接種法（又稱分離培養(yǎng)法）平板分離劃線的方法較多，其中以分區(qū)劃線法與曲線劃線法較為常用。其目的都要使細(xì)菌呈現(xiàn)單個(gè)菌落生長(zhǎng)，便于同雜菌菌落鑒別。現(xiàn)只介紹分區(qū)劃線法?！静牧稀?.細(xì)菌：大腸桿菌、葡萄球菌18~24小時(shí)普通瓊脂斜面培養(yǎng)物。2.培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。3.酒精燈，接種環(huán)等。【方法】1.右手持接種環(huán)，經(jīng)火焰滅菌，待涼后，挑取大腸桿菌（或葡萄球菌）培養(yǎng)物少許。2.左手斜持瓊脂平板，皿蓋留在桌上，于火焰近處將菌涂于瓊脂平板上端，來回劃線，涂成薄膜（約占平板總表面積的1/10），劃線時(shí)接種環(huán)與平板表面成30~40o角，輕輕接觸，以腕力在平板表面行輕快地滑移動(dòng)作，接種環(huán)不應(yīng)劃破培養(yǎng)基表面。3.燒灼接種環(huán)，殺滅環(huán)上殘留細(xì)菌，待冷（是否冷卻，可先在培養(yǎng)基邊緣處試觸，若瓊脂溶化，表示未涼，稍等再試），從薄膜處取菌作連續(xù)平行劃線（見圖3），約占平板表面1/5左右，再次燒灼接種環(huán)，等三次平行劃線……以同樣方法作第四次，第五次劃線，將平板表面劃完。4.劃線完畢，蓋上平皿蓋，底面向上，用標(biāo)簽或臘筆注明菌名檢驗(yàn)號(hào)碼，接種者班級(jí)，姓名，組別等，置37℃（二）純培養(yǎng)細(xì)菌接種法1.斜面培養(yǎng)基接種法：用于培養(yǎng)，保存菌種及其它實(shí)驗(yàn)用?！静牧稀浚?）大腸桿菌，葡萄球菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。（2）普通瓊脂斜面培養(yǎng)基。（3）接種環(huán)，接種針，酒精燈等?！痉椒ā浚?）取一支斜面培養(yǎng)基及一支純菌種管，并排傾斜放在左手四指中拇指壓住并以手掌支住兩試管底部。右手將白金環(huán)于火焰上滅菌、冷卻。并拔起兩試管的棉塞。（勿放置桌上，如棉塞太緊時(shí)應(yīng)預(yù)先松動(dòng)）。（2）試管口部于火焰上往返通過2~3次滅菌，將滅菌白金環(huán)伸入有菌試管中，取少量細(xì)菌（一般應(yīng)從斜面底部沾取），然后小心移至準(zhǔn)備接種的試管中。（3）接種方法是自管底向上連續(xù)平劃線，若以保存菌為目的時(shí)可自管底上劃一粗直線即可。（4）取出接種環(huán)，將試管上部再經(jīng)火焰滅菌，塞好棉塞，接種環(huán)滅菌后放回原處。（5）若自平皿培養(yǎng)物中取菌時(shí)，只應(yīng)沾取一個(gè)單個(gè)菌落。（6）接種菌應(yīng)作好標(biāo)記，標(biāo)明菌種名稱，日期等，置37℃2.液體培養(yǎng)基接種法：用于增菌及鑒定細(xì)菌生長(zhǎng)特點(diǎn)，如表面生長(zhǎng)，沉淀生長(zhǎng)，均勻混濁生長(zhǎng)等?！静牧吓c方法】操作技術(shù)基本與上法相同，只是接種時(shí)應(yīng)將沾菌之接種環(huán)沿接近液體表面之管內(nèi)壁輕輕摩擦（勿用力振蕩）使細(xì)菌混入培養(yǎng)基內(nèi)，置37℃3.半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)法用于保存菌種及間接觀察細(xì)菌之動(dòng)力（無動(dòng)力之細(xì)菌僅沿穿刺線生長(zhǎng)，清晰可見；有動(dòng)力的細(xì)菌使培養(yǎng)基呈現(xiàn)混濁樣，穿刺線甚至難以看出）。用無菌操作技術(shù)，滅菌穿刺針沾取細(xì)菌后，垂直刺入半固體培養(yǎng)基中央直達(dá)近管底處，再沿原穿刺線抽出即可，置37℃實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2；實(shí)驗(yàn)三細(xì)菌的生化反應(yīng)檢測(cè)（示教）不同細(xì)菌由于所含的酶系統(tǒng)不完全相同，因而對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的分解能力及代謝產(chǎn)物亦不一致，據(jù)此，可用以鑒別細(xì)菌的種類。一、單糖發(fā)酵試驗(yàn)【原理】單糖發(fā)酵是將葡萄糖，乳糖或麥芽糖等分別加入蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)，使其最終濃度為0.75~1％。并加入一定量酚紅指示劑及小倒管，制成單糖發(fā)酵管，接種細(xì)菌經(jīng)37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，若能分解糖產(chǎn)酸則酚紅指示劑由紅變黃，若能分解甲酸有C02和H2【材料】1．菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2．培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵管，乳糖發(fā)酵管等。【方法】1．將傷寒桿菌，大腸桿菌按照液體接種方法分別接種于葡萄糖及乳糖發(fā)酵管內(nèi)。2．置37℃3．觀察結(jié)果：由于一些細(xì)菌能分解某種糖類產(chǎn)酸，所以培養(yǎng)基中PH下降到7.0以下，在酚紅指示劑的顯示下，培養(yǎng)基顏色由紅變黃。產(chǎn)酸者以“+”表示，如果同時(shí)產(chǎn)生氣體，則培養(yǎng)基中小倒管內(nèi)有氣泡出現(xiàn)，此乃產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，以“⊕”表示，不分解，則指示劑不變色，用“-”表示?！窘Y(jié)果】傷寒桿菌大腸桿菌葡萄糖+⊕乳糖-⊕二、V-P(Voges-Proskauer)試驗(yàn)【原理】有些細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧，生成乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中被氧化為二乙酰，再與培養(yǎng)基內(nèi)胍基結(jié)合，生成紅色化合物，V—P試驗(yàn)陽性?！静牧稀?．菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2．培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。3．試劑：V-P試劑[40％氫氧化鉀水溶液(內(nèi)含0.3％肌酸)和6%α-奈酚酒精溶液]?！痉椒ā?.分別接種大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌于兩支葡萄糖蛋白胨水中。2.置37℃培養(yǎng)48小時(shí)后，取出分別加入KOH1ml和α3.觀察結(jié)果：培養(yǎng)液變?yōu)榧t色為陽性，不變色為陰性?！窘Y(jié)果】大腸桿菌：-；產(chǎn)氣桿菌：+三、甲基紅（M、R）試驗(yàn)【原理】某些細(xì)菌如大腸桿菌等分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，繼而分解為甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基PH值降至4.5以下，加入甲基紅指示劑呈紅色，此為陽性反應(yīng)；若產(chǎn)酸量少或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為醇、醛、氣體和水等，則培養(yǎng)基的酸堿度仍在PH6.2以上，加入甲基紅指示劑呈現(xiàn)黃色，為陰性反應(yīng)?！静牧稀?.菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2.培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。3.試劑：甲基紅試劑。【方法】1.分別將大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌接種于兩支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中。2.置37℃【結(jié)果】大腸桿菌：+，產(chǎn)氣桿菌：-。四、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)【原理】枸櫞酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基，其中枸櫞酸鈉為唯一碳源，磷酸二氫銨為唯一氮源。一般細(xì)菌能利用磷酸二氫銨作為氮源，但不一定能分解枸櫞酸鹽取得碳源。因此，根據(jù)可否利用枸櫞酸鹽來鑒別細(xì)菌，如產(chǎn)氣桿菌可利用枸櫞鹽作為碳源，細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，形成菌苔，分解枸櫞酸鹽生成堿性碳酸鹽，使培養(yǎng)基PH上升到7.0以上，由綠色變?yōu)樯钐m色，為枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陽性；而大腸桿菌則不能分解枸櫞酸鹽，得不到碳源，不能生長(zhǎng)，無菌苔形成，培養(yǎng)基顏色不發(fā)生變化，為枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陰性?！静牧稀?.菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2.培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽斜面?！痉椒ā?.分別將大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌接種于兩支枸櫞酸鹽斜面培養(yǎng)基。2.置37℃【結(jié)果】產(chǎn)氣桿菌：+（有菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基變色）大腸桿菌：-（無菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基不變色）五、靛基質(zhì)（Indol）試驗(yàn)【原理】某些細(xì)菌如大腸桿菌，變形桿菌等具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水培養(yǎng)基中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)（無色吲哚），再與歐立希試劑（對(duì)二甲基氨基苯甲醛）反應(yīng)，形成紅色化合物—玫瑰吲哚，即為陽性反應(yīng)?！静牧稀?.菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2.培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基。3.試劑，歐立希（Ehrlich）試劑（對(duì)二甲基氨基苯甲醛）【方法】1.分別將大腸桿菌，傷寒桿菌接種于兩支蛋白胨水培養(yǎng)基中。2.置37℃培養(yǎng)2~3天后，每管沿管壁各加歐立希試劑0【結(jié)果】大腸桿菌：+；傷寒桿菌：-。六、硫化氫（H2S）產(chǎn)生試驗(yàn)【原理】某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸），生成硫化氫。硫化氫遇到培養(yǎng)基中的鉛鹽（醋酸鉛）或鐵鹽（硫酸亞鐵），則形成黑褐色硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物。培養(yǎng)基內(nèi)含有還原劑硫代硫酸鈉，使形成的硫化氫不再氧化。【材料】1.菌種：大腸桿菌，傷塞桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2.培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基?！痉椒ā?.分別以半固體穿刺接種法將大腸桿菌，傷寒桿菌穿刺接種地兩支醋酸鉛培養(yǎng)基內(nèi)。2.置37℃3.觀察結(jié)果：取出后對(duì)光觀察，若沿穿刺線有黑褐色沉淀物，即表示該菌能產(chǎn)生硫化氫（H2S），否則反之?！窘Y(jié)果】大腸桿菌：-（無黑色沉淀線生成）傷寒桿菌：+（有黑色沉淀線生成）七、尿素分解試驗(yàn)【原理】某些細(xì)菌如變形桿菌，具有尿素分解酶，能分解尿素而產(chǎn)生氨，氨溶于水變成氫氧化銨，使培養(yǎng)基變堿而呈紅色即為陽性?！静牧稀?.菌種：變形桿菌，傷寒桿菌18-24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2.培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基?！痉椒ā?.分別以斜面接種法將變形桿菌，傷寒桿菌接種于兩支尿素斜面培養(yǎng)基上。2.置37℃3.取出觀察結(jié)果，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，即尿素分解試驗(yàn)陽性，若不變色，即為尿素分解試驗(yàn)陰性?！窘Y(jié)果】變形桿菌：+；傷寒桿菌：-。八、氧化酶試驗(yàn)【原理】某些細(xì)菌如奈瑟菌和綠膿桿菌，具有氧化酶（靛基酚氧化酶），能將氧化酶試劑（鹽酸二甲基對(duì)苯二胺或四甲基對(duì)苯二胺）氧化成紅色的醌類化合物，即為氧化酶試驗(yàn)陽性。【材料】1.菌種：淋球菌或腦膜炎球菌，白色葡萄球菌18-24小時(shí)巧克力斜面培養(yǎng)物。2.培養(yǎng)基：巧克力平板。3.試劑：0.5-1%鹽酸對(duì)二甲基苯胺（或鹽酸二甲基對(duì)苯二胺或鹽酸對(duì)氨基二甲苯胺）水溶液?！痉椒ā?.將腦膜炎球菌或淋球菌，白色葡萄球菌分別接種于巧克力平板；2.置37℃3.滴加新鮮配制的0.5-1%鹽酸對(duì)二甲基苯胺水溶液于固體培養(yǎng)基上；4.觀察結(jié)果：加試劑后，若菌落出現(xiàn)紅色→深紅色→紫黑色變化均為陽性；反之陰性?！窘Y(jié)果】腦膜炎球菌和淋球菌：+；白色葡萄球菌：-?！咀⒁馐马?xiàng)】1.此項(xiàng)試驗(yàn)應(yīng)避免含鐵物質(zhì)，因遇鐵會(huì)出現(xiàn)假陽性。2.試劑在空氣中易氧化，故應(yīng)新鮮配制。冰箱保存使用不超過兩周。3.若要分離培養(yǎng)腦膜炎球菌，應(yīng)在菌落變成紫黑色之前立即轉(zhuǎn)種。否則細(xì)菌容易死亡?！陡戒洝?．V-P試驗(yàn)劑的配制甲液：α-萘酚6g95%灑精100ml乙液：KOH40g肌酸0.3g蒸餾水100ml2．甲基紅試劑的配制甲基紅0.04g95%酒精60ml蒸餾水40ml先使甲基紅溶解于酒精中，再加入蒸餾水，混合，搖勻即成。3．歐立希（Ehrlich）試劑的配制對(duì)位二甲基氨基苯甲醛4g95%酒精380ml濃硫酸或濃鹽酸80ml三種成分混合即成，瓶口要嚴(yán)密，以免揮發(fā)。4．蛋白胨水培養(yǎng)基的制備成分：蛋白胨10g氯化鈉5g蒸餾水1000ml制法：（1）先用少量蒸餾水將蛋白胨和氯化鈉相混合溶解,再加足蒸餾水量。（2）調(diào)節(jié)pH至7.6、用濾紙過濾。（3）分裝中試管，每管約3-4ml，加塞滅菌后備用。用途：供吲哚試驗(yàn)用5．單糖發(fā)酵管的制備成分：蛋白胨水培養(yǎng)基100ml0.2%酚紅1ml所需糖（葡萄糖或乳糖）0.75-1g制法：（1）將上述成分溶化，混勻分裝于內(nèi)含有倒置小玻璃管的小試管中，每管約2ml，加塞。（2）小倒管排氣，滅菌（8-10磅，20-30分鐘），貯存?zhèn)溆谩Ｓ猛荆汗﹩翁前l(fā)酵試驗(yàn)用。附注：0.2%酚紅配制法酚紅（phenolred）0.2g1/10N苛性鈉（NaOH）8ml蒸餾水92ml將酚紅入研缽徐徐加入苛性鈉研磨，再補(bǔ)足蒸餾水即成。若需長(zhǎng)時(shí)間保存，可高壓滅菌后貯存?zhèn)溆谩?．葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物成分：蛋白胨5g葡萄糖5g制法：（1）將上述成分溶解于蒸餾水中。（2）調(diào)節(jié)pH至7.6，用濾紙過濾除渣。（3）分裝中試管，每管約3-4ml，滅菌后備用。用途：供甲基紅及V-P試驗(yàn)用。7．枸櫞酸鹽斜面培養(yǎng)基的制備成分：磷酸二氫銨0.1g磷酸氫二鉀0.1g硫酸鎂0.02g枸櫞酸鈉0.23g氯化鈉0.5g瓊脂2g蒸餾水100ml0.5%溴麝香草酚藍(lán)酒精溶液2ml制法：（1）先將上述各種鹽類溶解于蒸餾水中，使其完全溶解。（2）矯正pH至6.8，然后加入瓊脂和指標(biāo)劑。（3）搖勻，脫脂棉過濾，分裝中試管，每管約3-5ml。（4）滅菌后置成斜面?zhèn)溆茫ɡ浜鬄榫G色）用途：供枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)用。8．醋酸鉛培養(yǎng)基的制備成分：2%肉湯瓊脂200ml硫代硫酸鈉0.05g醋酸鉛10g蒸餾水100ml制法：（1）先將10g醋酸鉛加入100ml蒸餾水中融化，間歇滅菌或低壓菌后備用（10%醋酸鉛溶液）。（2）加熱溶化2%肉湯瓊脂200ml，加入硫代硫酸鈉0.05g，混合后高壓滅菌。（3）從高壓滅菌鍋取出，待冷卻至45℃（4）分裝小試管，每管約2ml，直立待冷凝后備用。用途：供硫代氫生成試驗(yàn)用。說明：醋酸鉛與硫代硫酸鈉不宜久然。9．尿素培養(yǎng)基的制備成分：蛋白胨1g氯化鈉5g葡萄糖1g蒸餾水900ml瓊脂15~20g0.1%酚紅12ml20%尿素水溶液（無菌）100ml制法：（1）除尿素、瓊脂和酚紅外，其余成分溶于水中，加熱溶化，矯正pH至6.8~6.9。（2）加入瓊脂和酚紅，8~10磅10分鐘滅菌。（3）冷卻至60℃（4）分裝中試管（無菌），每管3~4ml，置成斜面?zhèn)溆?。用途：供尿素分解試?yàn)用。說明：（1）尿素不耐熱，也不能久存，只能用濾器除菌。（2）無菌尿素溶液制備：稱取尿素20g，混合于100ml蒸餾水中，充分搖勻，用G6濾菌器過濾除菌，以達(dá)到無菌的目的。10．巧克力色瓊脂平板的制備成分：肉湯瓊脂100ml無菌脫纖維羊或兔血10ml。制法：（1）將肉湯瓊脂加熱溶化，趁熱加入脫纖維血，搖勻。（2）傾注平板，待冷卻成巧克力色，備用。用途：用于培養(yǎng)腦膜炎雙球菌或淋球菌。說明：加血一定要趁熱加。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3：播放錄象—《細(xì)菌感染的檢查方法和防治原則》

第三次實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌分布及外界因素對(duì)細(xì)菌影響的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1．課堂上全部操作；2．次日預(yù)約看結(jié)果一、自然沉降法檢查空氣中的細(xì)菌【材料】普通瓊脂平板。【方法】取普通瓊脂平板一個(gè)，打開皿蓋，讓培養(yǎng)基直接暴露于空氣中，置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上或需要測(cè)定的地方15~30分鐘。蓋上皿蓋，用記號(hào)筆或蠟筆注明放置地點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)日期和實(shí)驗(yàn)者班級(jí)、姓名等，放入37℃二、傾注法檢查水中的細(xì)菌【材料與方法】1.用無菌吸管吸取勝0.5ml水樣加入肉湯培養(yǎng)基中。2.另取一支未接種的肉湯管做對(duì)照，與上管一起置于37℃溫箱培養(yǎng)18~2【結(jié)果】對(duì)照管應(yīng)透明清亮，試驗(yàn)管變混濁，說明水樣中有活菌存在。并可通過比濁法估計(jì)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖后的數(shù)量。三、人體體表及各種物品表面的細(xì)菌檢查—拭子法和涂抹法【材料】普通瓊脂平板?！痉椒ā咳∑胀ō傊桨逡粋€(gè)，在平板底面用記號(hào)筆或蠟筆將平板分成若干等份，于每份培養(yǎng)基表面分別用手指、衣物、書本、筆等輕輕涂抹（不要擦破培養(yǎng)基）。也可用無菌生理鹽水擦洗衣物等，用無菌棉拭子涂于培養(yǎng)基表面，蓋上皿蓋,分別標(biāo)記清楚。置37℃溫箱培養(yǎng)18~24小時(shí)【注意事項(xiàng)】本實(shí)驗(yàn)檢出的除細(xì)菌外，尚可能有真菌、放線菌等，請(qǐng)注意加以區(qū)別。四、人咽喉部位的細(xì)菌檢查【材料】血液瓊脂平板?！痉椒ā?.咳碟法取血液瓊脂平板一個(gè)，打開皿蓋，將培養(yǎng)基面置于口腔前約10厘米處，用力咳嗽數(shù)次（讓飛沫落在培養(yǎng)基表面），然后蓋上皿蓋，注明被檢查者姓名、實(shí)驗(yàn)日期等。置37℃2.試子法用無菌棉簽涂取扁桃腺兩旁的分泌物，在血瓊脂平板表面涂布成線，然后改用接種環(huán)，作分區(qū)劃線接種，置37℃五、化學(xué)因素對(duì)細(xì)菌的影響（化學(xué)消毒劑的殺菌試驗(yàn)）【材料】1.菌種：葡萄球菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2.培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。3.化學(xué)消毒劑：5%石炭酸、2%碘酒、70%酒精、0.1%升汞。4.其他：直徑0.6cm無菌圓形濾紙片、小鑷子、接種環(huán)等。【方法】1.將瓊脂平板分為四等分，并在其底面做標(biāo)記。2.用接種環(huán)取葡萄球菌瓊脂斜面培養(yǎng)物，密涂于整個(gè)瓊脂培養(yǎng)基表面。3.用小鑷子夾取無菌小濾紙片，分別蘸取上述消毒劑（消毒劑不宜蘸得過多，防止外流）。平貼于各相應(yīng)分區(qū)的中央，蓋上皿蓋，標(biāo)明日期和試驗(yàn)者。4.置37℃六、細(xì)菌的藥物敏感試驗(yàn)【材料】1.菌種：大腸桿菌，葡萄球菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2.培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。3.分別含各種抗生素的直徑0.6cm的圓形紙片（青霉素、鏈霉素、紅霉素、慶大霉素、卡那霉素）、小鑷子等?！痉椒ā?.取瓊脂平板兩個(gè)，每個(gè)平板分為五等份，并做相應(yīng)標(biāo)記。2.用接種環(huán)分別密涂大腸桿菌及葡萄球菌于兩個(gè)瓊脂平板培養(yǎng)基表面。3.用小鑷子以無菌操作技術(shù)先夾取一無菌不含抗生素的濾紙片平貼于平板中央，再分別夾取含抗生素的各種濾紙片平貼于各相應(yīng)區(qū)中央，蓋上皿蓋。注明班級(jí)、姓名、日期等。4.置37℃5.抑菌程度判定：抑菌程度的判定是依照濾紙片周圍細(xì)菌的生長(zhǎng)與抑菌圈直徑大小來判定。對(duì)藥物的敏感程度抑菌環(huán)直徑（mm）不敏感無抑菌環(huán)輕度敏感<10中度敏感10~15高度敏感>15《附錄》抗生素濾紙片的制備方法1.取直徑0.6cm園形濾紙片，每100片置于一小平皿中，15磅滅菌20分鐘，再置于烤箱（60~100℃2.取一定濃度的不同抗生素（見表1）分別注入裝有無菌濾紙片的小平皿內(nèi)，每100片加入1ml抗菌素，浸泡半小時(shí)后，再置37℃溫箱中2~3小時(shí)干燥。干表1常用幾種抗生素的濃度表抗生素名稱濃度（每毫升）標(biāo)記字樣/符號(hào)青霉素200μ青（P）鏈霉素1mg鏈（S）紅霉素1mg紅（E）卡那霉素200μ卡（K）慶大霉素40μ慶（G）七、噬菌體的噬菌作用噬菌體（bacteriophage）具有嚴(yán)格寄生性，對(duì)相應(yīng)的易感細(xì)胞，具有高度的種特異性和型特異性。感染細(xì)胞后，或者裂解宿主細(xì)胞，或者處于溶原狀態(tài)?？蓱?yīng)用噬菌體作細(xì)菌的鑒定、分型、檢查未知細(xì)菌和防治某些疾病?！静牧吓c方法】1.噬菌體的溶菌現(xiàn)象（1）取4支肉湯管，2支接種金黃色葡萄球菌，2支接種大腸桿菌。（2）將上述兩種菌肉湯管各取1支，分別加入金黃色葡萄球菌噬菌體肉湯液0.2ml。（3）將上述4支肉湯管，置37℃2.噬菌體的溶菌斑（1）取普通瓊脂平板1只，分為4等分，注明①、②、③、④。（2）用無菌棉簽在①、②處涂布接種痢疾桿菌，在③處接種大腸桿菌，在④處接種白色葡萄球菌。（3）在②、③、④處各加1小滴痢疾桿菌噬菌體肉泌液，在①處加1滴肉湯。（4）置37℃培養(yǎng)16~1圖5噬菌體的溶菌斑【結(jié)果】1.溶菌現(xiàn)象加有噬菌體的金黃色葡萄球菌肉湯管清亮，其余均混濁。2.溶菌斑如圖5，在②處的中央有一無菌生長(zhǎng)的空斑，即溶菌斑（或蝕斑），其余部位無此現(xiàn)象。八、紫外線的殺菌試驗(yàn)【原理】波長(zhǎng)240nm~280nm的紫外線，因與DNA吸收光譜一致，而具有明顯的殺菌作用。其機(jī)制是使細(xì)菌DNA鏈中兩個(gè)相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體，從而破壞DNA構(gòu)型，干擾其正常復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)菌死亡?！静牧稀?.菌種：大腸桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2.培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。3.無菌黑色圖案紙片，紫外線燈，消毒液?！痉椒ā?.用接種環(huán)取大腸桿菌瓊脂斜面培養(yǎng)物，密涂于普通瓊脂平板培養(yǎng)基表面。2．火焰滅菌小鑷子、待稍涼后，打開平皿蓋，取無菌黑紙片一片平貼于涂有細(xì)菌的平板培養(yǎng)基表面中間。3.將平板暴露于距紫外燈管20~30cm處，打開紫外線燈照射30分鐘。4.照射完畢，無菌操作取出黑紙片，投入消毒液中，蓋上皿蓋，做標(biāo)記，注明日期，試驗(yàn)者等。5.置37℃培養(yǎng)18~24小【結(jié)果】黑紙片遮蓋處細(xì)菌生長(zhǎng)形成灰白色菌苔，形狀同黑紙片形狀。直接暴露在紫外線燈下的培養(yǎng)基表面無生長(zhǎng)或僅有少量的細(xì)菌生長(zhǎng)，形成菌落?！緫?yīng)用】紫外線的殺菌力雖強(qiáng)，但穿透力弱，故僅用于實(shí)驗(yàn)室、手術(shù)室空氣及物體表面的消毒滅菌?！咀⒁馐马?xiàng)】殺菌波長(zhǎng)的紫外線對(duì)人體皮膚，眼睛有損傷作用，使用時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。九、濾過除菌【原理】濾過是一種機(jī)械除菌法，主要用于一些不耐高溫液體的除菌，例如：血清、毒素、抗毒素、藥物等。但濾過不能除去病毒、支原體和L型細(xì)菌。【材料】1.待濾的血清肉湯（燒瓶分裝、有菌）。2.肉湯管3.濾器（已滅菌）和過濾裝置、無菌刻度吸管和試管等?！痉椒ā?.無菌取一環(huán)待濾血清肉湯接種于肉湯管內(nèi)。2.將燒瓶中的血清肉湯倒入濾斗，啟動(dòng)抽氣機(jī)，減壓抽濾。濾畢，關(guān)閉抽氣機(jī)。迅速以無菌刻度吸管吸取瓶中濾液，移置于無菌試管中。3.無菌取一環(huán)濾液接種于另1管肉湯。4.將2管肉湯置37℃【結(jié)果】接種待濾血清肉湯的管呈混濁，接種已濾血清肉湯的管澄清。第四次實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1：血漿凝固酶試驗(yàn)（操作）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2：腸桿菌科細(xì)菌的檢測(cè)（綜合實(shí)驗(yàn)一）1）糞便材料的分離、培養(yǎng)—鑒別培養(yǎng)基；2）次日，雙糖鐵培養(yǎng)基接種初步鑒定。實(shí)驗(yàn)七病原性球菌的檢測(cè)一、主要病原性球菌的形態(tài)、培養(yǎng)特征【形態(tài)示數(shù)】1.葡萄球菌（革蘭染標(biāo)本）：革蘭染色陽性，為正圓形，呈葡萄串狀排列，亦有單個(gè)散在分布。2.鏈球菌（革蘭染色標(biāo)本）：革蘭染色陽性，圓形或卵圓形，呈鏈狀排列。3.肺炎雙球菌（小鼠腹腔液涂片，HiSS染色）：革蘭陽性球菌，矛頭狀成雙排列，平端相對(duì)，尖端相背。莢膜染色片中，菌體呈紅色，菌體周圍的莢膜呈淡紅色或無色。4.腦膜炎雙球菌（腦脊液涂片，美蘭染色）：革蘭陰性球菌，腎形成雙排列，凹面相對(duì)，菌體呈淺蘭色，多位于中性粒細(xì)胞漿內(nèi)，胞漿外也有少數(shù)散在分布。【培養(yǎng)特征】1.葡萄球菌在血液瓊脂平板上的生長(zhǎng)表現(xiàn)：菌落為圓形，中等大小，表面光滑，邊緣整齊，不透明；金黃色葡萄球菌菌落呈現(xiàn)金黃色，而白色葡萄球菌，檸檬色葡萄球菌菌落呈白色或檸檬色（如菌落色素不易區(qū)別時(shí)，用白紙片沾菌落少許有助觀察）；金黃色葡萄球菌的菌落周圍多有透明溶血環(huán)，而其他葡萄球菌一般無溶血環(huán)（僅少數(shù)新分離白色葡萄球菌可呈現(xiàn)微溶血現(xiàn)象）。2.鏈球菌在血液瓊脂平板上的生長(zhǎng)表現(xiàn)：除丙型鏈球菌外，菌落均較微小，如針尖大，圓形，灰色，半透明。根據(jù)溶血性將鏈球菌分為三類。甲型鏈球菌的菌落周圍有小的草綠色溶血環(huán)，乙型鏈球菌有較大的透明溶血環(huán)，丙型鏈球菌不溶血。二、葡萄球菌血漿凝固酶試驗(yàn)（操作）【原理】血漿凝固酶試驗(yàn)是區(qū)別致病性葡萄球菌與非致病葡萄球菌的最重要指標(biāo)。致病性葡萄球能產(chǎn)生血漿凝固酶，此酶的作用類似凝血酶原，在血漿中激活劑的作用下，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白，從而導(dǎo)致血漿凝固（呈現(xiàn)塊狀或顆粒狀）。非致病性葡萄球菌不產(chǎn)生此酶，因而不能凝固血漿。此酶有兩種存在形式：結(jié)合于細(xì)胞壁上血漿凝固酶，采用玻片法測(cè)；游離形式的血漿凝固酶，采用試管法檢測(cè)?！静牧稀?.金黃色、白色葡萄球菌瓊脂斜面18~24小時(shí)培養(yǎng)物。2.1:2人或兔血漿。3.生理鹽水、玻片、接種環(huán)等?！痉椒ā?.取載玻片一張，用蠟筆分成三等份。2.于第一、二格內(nèi)滴加入血漿各1滴，于第三格內(nèi)滴加生理鹽水1滴。3.取金黃色葡萄球菌斜面培養(yǎng)物少許，分別混懸于第三格及第一格內(nèi)，取白色葡萄菌混懸于第二格內(nèi)，分別研磨混勻。靜置2~3分鐘?！窘Y(jié)果】第三格和第二格中細(xì)菌呈出均勻混濁，而第一格中細(xì)菌呈現(xiàn)塊裝或顆粒狀凝固現(xiàn)象，即判定為血漿凝固酶陽性。三、抗鏈球菌溶血素“O”試驗(yàn)【原理】鏈球菌“O”溶血素是A族溶血性鏈球菌的代謝產(chǎn)物之一，能溶解人或兔的紅細(xì)胞，對(duì)氧敏感，如與空氣中的氧接觸；能使蛋白質(zhì)上的-SH基氧化成-S-S基，失去溶血活性。在實(shí)驗(yàn)中可借還原劑的作用，使它重新恢復(fù)溶血活力。溶血素“O”具有很強(qiáng)的抗原性，人感染該菌后，2~3周產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，此種抗體能中和溶血素“O”的溶血活力。因此，測(cè)定患者血清中抗鏈球菌溶血素“O”抗體的效價(jià)，可作為風(fēng)濕熱等疾病的輔助診斷。抗“O”試驗(yàn)的效價(jià)是指完全不溶血之血清最高稀釋度。【材料】1.患者血清：1：50稀釋2.溶血素“O”及還原劑片劑（按說明配制）3.1%兔紅細(xì)胞4.生理鹽水，試管、吸管，37℃【方法】1.取清潔小試管5支，依次排列編號(hào)。2.于第一管注入生理鹽水1.8ml，第二管0.1ml，第三管0.2ml，第四管0.3ml，第五管0.5ml。3.于第一管注入0.2ml1：50稀釋的患者的血清，反復(fù)吹吸三次，混勻。吸出0.4注入第二管，吸出0.3ml注入第三管，吸出0.2ml注入第四管，吸出0.6ml棄去，第五管不加，作為對(duì)照管，此時(shí)，各管的血清稀釋度為1:500、1:625、1:833、1:1250。4.于每管注入還原溶血素“O”0.25ml，置37℃5.取出后于每管注入1%紅細(xì)胞懸液0.25ml，置37℃抗“O”試驗(yàn)操作表材料管號(hào)12345生理鹽水1.80.10.20.30.5(棄去0.6)1：50稀釋血清（ml）0.20.40.30.2-血清稀釋度1:5001:6251:8331:1250對(duì)照還原溶血素“O”0.250.250.250.250.25置37℃1%紅血球0.250.250.250.250.25置37℃【結(jié)果】先觀察對(duì)照管，再依次觀察試驗(yàn)管，溶血者上清呈透明紅色為抗“O”抗體陰性。不溶血者呈均勻混濁為抗“O”抗體陽性。以完全不溶血之血清最高稀釋度作為抗體的效價(jià)。效價(jià)在1：500單位以上者表示病人曾經(jīng)受過溶血性鏈球菌感染，多次試驗(yàn)逐步增高者可作為活動(dòng)性風(fēng)濕病的輔助診斷。逐漸下降者，多處于緩解期。；恒定不變者，多為非活動(dòng)期。四、肺炎雙球菌小鼠毒力試驗(yàn)肺炎球菌中，有少數(shù)菌不產(chǎn)生莢膜，故無致病力，具有莢膜的肺炎球菌致病力強(qiáng)，小白鼠對(duì)肺炎球菌很敏感，故可用作肺炎球菌的毒力鑒定，同時(shí)可用以純化肺炎球菌?！静牧吓c方法】1.取20g左右重的健康小白鼠1只，腹腔或皮下注射肺炎菌菌液0.2ml，飼養(yǎng)觀察。2.待瀕臨死亡時(shí)，及時(shí)解剖，取心血接種血平板作細(xì)菌培養(yǎng)。3.取其腹腔液涂片，作莢膜染色鏡檢。【結(jié)果】1.有毒力的肺炎球菌，能使小白鼠在注射菌液后12~36小時(shí)瀕臨死亡。2.血培養(yǎng)可獲得肺炎球菌純培養(yǎng)物。3.有毒力的肺炎球菌，莢膜染色鏡檢，可見有明顯的莢膜?！咀⒁馐马?xiàng)】1.在實(shí)驗(yàn)中要特別注意無菌操作。2.實(shí)驗(yàn)中，可用無毒力的肺炎球菌作對(duì)照實(shí)驗(yàn)。五、臨床標(biāo)本中化膿性球菌的分離鑒定從臨床標(biāo)本中分離鑒別化膿性球菌時(shí)，可根據(jù)各種化膿球菌不同的生物學(xué)特征，直接涂片鏡檢、分離培養(yǎng)等方法，鑒定出未知的化膿球菌，不僅可為化膿性感染的臨床診斷提供依據(jù)，而且可進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，為臨床選用有效的抗菌藥物提供參考。1.標(biāo)本的采集和處理（1）膿標(biāo)本用無菌棉簽，蘸取患處深部膿液少許，置入無菌小試管內(nèi)，送檢。（2）痰標(biāo)本、用無菌棉簽，挑取病人膿稠痰塊，置放無菌小試管內(nèi)，送檢。（3）咽喉部標(biāo)本令病人把口張大，用壓舌板壓住舌根部，用無菌棉簽，迅速蘸取咽喉部分泌物，置入無菌小試管，送檢。（4）血標(biāo)本疑為化膿性球菌敗血癥患者，在嚴(yán)格無菌操作下，靜脈采血5ml，直接加入50ml的肉湯瓶?jī)?nèi)，立即搖勻，送檢。（5）腦脊液標(biāo)本在嚴(yán)格無菌操作下，作腰椎穿刺取腦脊液，送檢。2.檢驗(yàn)程序根據(jù)檢查的目的要求，按下圖所示，進(jìn)行檢查。

膿、痰、咽喉拭子膿、痰、咽喉拭子病灶分泌物標(biāo)本涂片染色鏡檢形態(tài)排列結(jié)構(gòu)染色性觀察生長(zhǎng)情況菌落特點(diǎn)溶血性色素挑選可疑菌落直接接種血平板涂片染色鏡檢轉(zhuǎn)種液體定向性培養(yǎng)基特殊試驗(yàn)轉(zhuǎn)種血斜面生化反應(yīng)動(dòng)物試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)血液穿刺液（直接接種）肉湯瓶涂片染色鏡檢（培養(yǎng)生長(zhǎng)后）【注意事項(xiàng)】1.上面只表明一般的檢查原則，在實(shí)驗(yàn)檢查中，還需要根據(jù)臨床提供的可能診斷，作定向的檢查。2.若疑為流腦或淋病患者。其標(biāo)本送檢時(shí)，要注意保溫，所用的培養(yǎng)基要提前放入孵箱內(nèi)預(yù)溫。3.欲檢查腦膜炎球菌或淋球菌，其標(biāo)本應(yīng)接種于巧克力色瓊脂平板。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2：實(shí)驗(yàn)八腸道桿菌的檢測(cè)綜合實(shí)驗(yàn)（一）：1．糞便材料的分離、培養(yǎng)—鑒別培養(yǎng)基；2．次日，雙糖鐵培養(yǎng)基接種初步鑒定。一、主要腸道桿菌的形態(tài)、培養(yǎng)特征（示教）（一）形態(tài)觀察1.大腸桿菌（革蘭氏染色標(biāo)本）革蘭氏染色陰性，中等大小球桿菌，兩端純圓，呈現(xiàn)分散排列。2.傷寒桿菌（革蘭氏染色標(biāo)本）革蘭氏染色陰性，中等大小球桿菌，散在分布。3.痢疾桿菌（革蘭氏染色標(biāo)本）革蘭氏陰性桿菌。（二）培養(yǎng)特性1.大腸桿菌：在普通瓊脂平板上形成圓形、中等大小、灰白、半透明，邊緣整齊光滑之菌落，有特殊氣味。在EMB平板上菌落呈現(xiàn)紫黑色，有金屬光澤。在MCK平板上菌落呈紅色。2.傷寒桿菌：在普通瓊脂平板上菌落為園形，中等大小、灰白、半透明，邊緣整齊、表面光滑。在EMB平板上，菌落較小，無色半透明。在MCK平板上菌落較小，無色半透明。3.痢疾桿菌：菌落特征同傷寒桿菌。二、糞便標(biāo)本中腸道病原菌分離鑒定糞便中的細(xì)菌種類很多，要檢出病原菌，通常應(yīng)用具有選擇性或鑒別性的培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是此類培養(yǎng)基中除含有細(xì)菌所需的營養(yǎng)物質(zhì)外，還含有抑菌劑和指示劑?？蛇x擇性的抑制沙門氏桿菌和痢疾以外的其它腸道桿菌生長(zhǎng)，指示劑則可用以鑒別細(xì)菌的生化特性。其檢驗(yàn)程序如下。（一）標(biāo)本采集采取標(biāo)本時(shí)應(yīng)注意病情和病程，盡量在未使用抗菌素之前，選取膿血或粘液部分。取材后應(yīng)立即送檢。如不能立即送檢，可將本本保存于30%甘油緩沖鹽水中。（二）分離培養(yǎng)【材料】EMB平板，MCK平板?！痉椒ㄅc結(jié)果】用接種環(huán)挑取少量糞便標(biāo)本，以分離劃線法接種于EMB平板或MCK平板上，置37℃平板劃線法平板劃線法糞便接種于37EMB平板24小時(shí)37MCK平板24小時(shí)大、紫黑色、有金屬光澤，不透明，為非致病菌菌落小、無色較透明，為可疑菌落大、紅色、不透明為非致病菌落小、無色較透明為可疑菌落（三）初步鑒定【材料】雙糖鐵培養(yǎng)基【方法與結(jié)果】將可疑菌落接種于雙糖鐵培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃上層下層動(dòng)力H2S+eq\o\ac(○,+)+-非致病菌+eq\o\ac(○,+)---+--痢疾桿菌-+++傷寒桿菌-eq\o\ac(○,+)++副傷寒桿菌第五次實(shí)驗(yàn)綜合實(shí)驗(yàn)（二）：1．分離可疑菌的血清學(xué)鑒定—玻片凝集（操作）2．血清學(xué)實(shí)驗(yàn)—肥達(dá)反應(yīng)（操作）3．播放錄象——腸桿菌科（一）血清學(xué)鑒定【材料】傷寒桿菌，甲、乙型副傷桿菌，痢疾桿菌診斷血清，載玻片，生理鹽水等?！痉椒ㄅc結(jié)果】根據(jù)初步鑒定結(jié)果，用已知診斷血清作玻片凝集試驗(yàn)，如發(fā)生凝集，即可確定。如疑集陰性，應(yīng)復(fù)查后再定。（二）繼續(xù)鑒定：根據(jù)需要可進(jìn)一步作生化反應(yīng)，血清學(xué)分型等鑒定。【注意事項(xiàng)】1.作分離培養(yǎng)時(shí)宜取膿血便接種于鑒別培養(yǎng)基或選擇培養(yǎng)基上。2.挑取可疑菌落時(shí)，每份標(biāo)本可選取2~3個(gè)菌落，每個(gè)菌落接種一支雙糖管。3.玻片凝集確定后，如果需要，可保存菌種，以便進(jìn)一步鑒定和研究用?！陡戒洝?、伊紅美蘭（簡(jiǎn)稱EMB）培養(yǎng)基制備1）成份：①pH7.6%無糖瓊脂100毫升②20%乳糖溶液2毫升③2%伊紅水溶液2毫升④0.5%美蘭水溶液1毫升2）制法：將上述成分混合溶化，8~10磅高壓蒸氣滅菌15分鐘，制成平板備用。3）應(yīng)用原理：培養(yǎng)基中含有乳糖，伊紅及美蘭指示劑，伊紅系酸性染料，當(dāng)大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時(shí)，細(xì)菌帶正電荷，而染上伊紅，伊紅與美蘭結(jié)合形成紫黑色化合物，所以菌落呈出紫黑色，且有金屬光澤；致病菌不分解乳糖故其菌落不變色，較透明，培養(yǎng)基中加入的染料還可抑制其他革蘭陽性菌生長(zhǎng)。2、雙糖鐵培養(yǎng)的制備1）成分：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化鈉0.5g，硫代硫酸鈉0.05g，硫酸亞鐵0.5g，葡萄糖0.1g，乳糖1g，瓊脂1g，酚紅0.025g，蒸餾水100ml。2）制法：將上述成分（除瓊脂及酚紅）混合，加熱溶化，矯正PH至7.4~7.6。再加入瓊脂及酚紅，煮沸，分裝小試管內(nèi)，每支約2ml，經(jīng)10磅15分鐘后，置成高層斜面，冷凝后即成。3）使用原理：克氏雙糖鐵培養(yǎng)基中含有葡萄糖、乳糖、硫酸亞鐵及酚紅指示劑等成份。經(jīng)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸時(shí)，使培養(yǎng)基的下層由紅變黃，斜面培養(yǎng)基中雖然也含有葡萄糖但量小，且分解產(chǎn)生的酸為揮發(fā)性酸，所以只發(fā)酵葡萄糖的細(xì)菌斜面仍為紅色；產(chǎn)酸并產(chǎn)氣時(shí)，培養(yǎng)基中有氣泡或裂隙出現(xiàn)。培養(yǎng)基中乳糖含量大，被分解后產(chǎn)酸多，因此不僅培養(yǎng)基下層變黃，而且斜面出由紅變黃，基于上述現(xiàn)象，通常將培養(yǎng)基的斜面部分代表乳糖，下層部分代表葡萄糖。培養(yǎng)基中含有硫酸亞鐵，如有硫化氫產(chǎn)生，則生成黑色硫化鐵，使培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑色。三、肥達(dá)反應(yīng)【原理】肥達(dá)試驗(yàn)是一種試管凝集反應(yīng)。用已知的傷寒桿菌O、H抗原和甲、乙型副傷寒桿菌H抗原，與病人血清作定量凝集試驗(yàn)，以測(cè)定患者血清中無相應(yīng)抗體存在，作為傷寒、副傷寒診斷的參考。【材料】1.患者血清1：10稀釋2.傷寒桿菌O菌液、H菌液、甲、乙型副傷寒H菌液3.生理鹽水、試管、吸管、56℃【方法】1.取清潔小試管32支，分成4排，每排8支，依次編號(hào)。2.于小試管內(nèi)各注入0.5ml生理鹽水。3.于每一排第一管內(nèi)加入1：10稀釋的患者血清0.5ml，用1ml吸管吹吸三次，混勻，吸出0.5ml注入第二管作對(duì)倍稀釋，……依次稀釋至第7管，棄去0.5ml，第8管為對(duì)照。4.從第8管開始，從后向前，第一排各管內(nèi)注入傷寒桿菌H菌液0.5ml；第二排各管注入傷寒桿菌O菌液0.5ml；第三排各加入甲型副作寒桿菌H液0.5ml；第四排各管加入乙型副傷寒桿菌H菌液0.5ml；5.加完菌液后，振蕩試管架，混勻，置于56℃水浴箱2~4小時(shí)，放冰箱過夜，或放置37肥達(dá)氏反應(yīng)操作表單位:ml試管11223345678（對(duì)照）生理鹽水0.50.50.50.50.50.50.50.51:1：10病人血清0.50.50.50.50.50.50.5棄去0.5傷寒桿菌H菌（第1排0.50.50.50.5050.50.50.5血清最終稀釋度1:401:801:1601:3201:6401:12801:2560-結(jié)果【結(jié)果與分析】先觀察對(duì)照管，正確結(jié)果應(yīng)無凝集現(xiàn)象，再觀察各試驗(yàn)管的凝集現(xiàn)象，凝集程度以“+”多少表示之。（++++）最強(qiáng)，上液澄清，細(xì)菌全部凝集沉淀于管底。（+++）強(qiáng)，上液輕度混濁，細(xì)菌大部分凝集沉淀于管底。（++）弱，上液混濁，細(xì)菌少部分凝集。（-）不凝，液體呈乳狀與對(duì)照管相同。效價(jià)判定：以能出現(xiàn)“++”凝集現(xiàn)象的血清最高稀釋度為該血清的凝集效價(jià)。一般認(rèn)為O抗體效價(jià)在1：80以上，H抗體效價(jià)在1：160以上，有輔助診斷意義。但在分析結(jié)果時(shí)，應(yīng)注意以下兩點(diǎn)：（1）非腸熱癥患者，由于曾接種過傷寒，副傷寒疫苗或以往在流行區(qū)有過隱性感染或患過傷寒，副傷寒，以及回憶反應(yīng)等原因，也可呈現(xiàn)陽性結(jié)果。不過，由這些原因所引起的陽性反應(yīng)主要是H抗體升高，O抗體效價(jià)一般不高，同時(shí)，每隔5~7天試血一次，其抗體效價(jià)一般不會(huì)隨病程而升高。上述這些都有別于現(xiàn)癥感染。（2）少數(shù)腸熱癥患者，由于發(fā)病初期曾使用大量抗生素，或機(jī)體有免疫缺陷病，或機(jī)機(jī)反應(yīng)性極弱等原因，抗體效價(jià)可以很低，甚至為陰性結(jié)果。因此不能只根據(jù)肥達(dá)氏試驗(yàn)的結(jié)果去作簡(jiǎn)單肯定或否定的結(jié)論，必須結(jié)合當(dāng)?shù)亓餍星闆r，既往接觸史，以及臨床癥狀和體征，作出正確的判斷。四、大腸桿菌腸毒素試驗(yàn)產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌能引起嬰幼兒及旅流者腹瀉，嚴(yán)重病例可出現(xiàn)霍亂樣腹瀉，并能造成流行。產(chǎn)腸毒素能力與二種可傳遞質(zhì)粒有關(guān)，一種編碼ST（耐熱腸毒素）和LT（不耐熱腸毒素）；另一種只編碼ST。由于此類大腸桿菌在形態(tài)培養(yǎng)和生化反應(yīng)特性上與一般大腸桿菌無區(qū)別，因此，可用檢測(cè)腸毒素的方法來鑒別該菌。該型菌中有產(chǎn)生ST菌株，也有產(chǎn)生ST和LT菌株，故一般分別檢測(cè)ST和LT兩種腸毒素。（一）LT測(cè)定法【原理】LT是蛋白質(zhì)，不耐熱，65℃【材料】1.產(chǎn)腸毒素大腸桿菌肉湯培養(yǎng)濾液（含LT）、生理鹽水、5%戊巴比妥鈉。2.10周齡健康家兔、注射器、小燒杯、天平、兔固定臺(tái)，解剖器械等。【方法】1.家兔禁食1天，仰位固定于兔臺(tái)上，耳靜脈緩慢注入5%戊巴比妥鈉（按0.5ml/kg體重），麻醉后剖腹取出小腸，自回腸末端開始，結(jié)扎3節(jié)腸段，每段長(zhǎng)約10cm。2.向中間腸段注入生理鹽水2ml，前、后兩節(jié)腸段各注入細(xì)菌培養(yǎng)濾液2ml，關(guān)腹。3.18小時(shí)后，再取出小腸，測(cè)量各節(jié)腸段的長(zhǎng)度，并收集各段內(nèi)的腸液稱重，比較?！窘Y(jié)果】1.注射細(xì)菌濾液段腸內(nèi)液體明顯增多。2.此項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果可以鑒定產(chǎn)腸毒素型（LT）大腸桿菌。（二）ST測(cè)定法【原理】ST分子量較小，無免疫原性，耐熱，經(jīng)100℃20分鐘處理不被破壞，可以激活腸粘膜細(xì)胞上的鳥苷環(huán)化酶使胞內(nèi)【材料】1.產(chǎn)腸毒素大腸桿菌培養(yǎng)濾液（含ST）、生理鹽水。2.1~4日齡乳鼠、注射器、胃飼針頭（或細(xì)塑料管）、小燒杯、天平、眼科剪鑷等?！痉椒ā?.取乳鼠2只，編號(hào)，1只經(jīng)胃灌注入生理鹽水0.1ml，另一只灌入細(xì)菌濾液0.1ml，禁食3~4小時(shí)。2.解剖乳鼠，取出全部腸子，稱量乳鼠腸子重量與摘除腸道后其余部分重量，求其重量比。【結(jié)果】腸重/體重的比率：0.09ST陽性0.07~0.09ST可疑0.07以下ST陰性【注意事項(xiàng)】1.灌胃材料中，可按每毫升加入1滴2%伊文氏藍(lán)液，以指示正確灌入胃內(nèi)。2.本實(shí)驗(yàn)可用來鑒定產(chǎn)ST腸毒素大腸桿菌。五、痢疾桿菌熒光菌球試驗(yàn)【原理】將相應(yīng)抗體加在痢疾桿菌的培養(yǎng)液中，雖相互結(jié)合，但細(xì)菌不被殺死，在適宜溫度下仍能生長(zhǎng)，形成痢疾桿菌微小菌團(tuán)。如在抗體上標(biāo)記熒光，則形成痢疾桿菌熒光菌球?！静牧吓c方法】1.將痢疾桿菌接種于含有一定量的熒光抗體的蛋白胨水中，37℃2.蘸取上述培養(yǎng)物接種環(huán)于清法玻片上，放上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。【結(jié)果】熒光球大而發(fā)亮呈園球狀，結(jié)構(gòu)較疏松，周圍近似卷發(fā)狀。隨孵育時(shí)間增長(zhǎng)，菌球結(jié)構(gòu)致密，周圍較園，整齊，菌球周圍有刺毛，孵育時(shí)間短時(shí)，菌球往往呈多形性。

第六次實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1：結(jié)核桿菌的檢測(cè)—抗酸染色（操作）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2：病毒部分的綜合實(shí)驗(yàn)（一）流感病毒分離培養(yǎng)—雞胚接種（操作）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3：播放錄象—多種病毒的電鏡照片實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1：實(shí)驗(yàn)十二結(jié)核桿菌的檢測(cè)結(jié)核桿菌與麻風(fēng)桿菌是分枝桿菌屬中的主要病原菌。結(jié)核桿菌菌體細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲，有分枝生長(zhǎng)趨勢(shì)。菌體含脂量高，與其抗酸特性、抵抗力特性、致病性與免疫性等都有密切關(guān)系。該菌營養(yǎng)要求高，生長(zhǎng)緩慢，形成“菜花狀”菌落。一、結(jié)核桿菌檢驗(yàn)程序結(jié)核病人病灶中查到結(jié)核桿菌，是病原學(xué)診斷的重要依據(jù)，根據(jù)感染部位不同，可采集病人的痰、尿、糞便、腦脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序進(jìn)行檢驗(yàn)。直接涂片①染色鏡檢較厚涂片抗酸染色報(bào)告菌體特征濃縮集落菌后涂片（或熒光染色）報(bào)告菌落特征及抗酸染色結(jié)果37℃數(shù)周報(bào)告菌落特征及抗酸染色結(jié)果37數(shù)周標(biāo)本材料②分離培養(yǎng)標(biāo)本材料固體：改良羅氏培養(yǎng)基標(biāo)本經(jīng)酸、堿處理3-4周觀察病變及檢查結(jié)核桿菌3-4周觀察病變及檢查結(jié)核桿菌注射豚鼠腹股溝皮下③動(dòng)物接種二、結(jié)核桿菌培養(yǎng)特性1.液體培養(yǎng)基（蘇通氏培養(yǎng)基、小川培養(yǎng)基、血清酸性培養(yǎng)基等）結(jié)核桿菌生長(zhǎng)表現(xiàn)：標(biāo)本材料經(jīng)前處理（即酸堿處理，可液化標(biāo)本，也可殺死雜菌，還可濃縮集菌）后接種液體培養(yǎng)基，35℃2.固體培養(yǎng)基（改良羅氏培養(yǎng)基、丙酮酸鈉培養(yǎng)基等）結(jié)核桿菌生長(zhǎng)表現(xiàn)：標(biāo)本材料經(jīng)前處理后，接種固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2-4周，在培養(yǎng)基表面可形成乳白或米黃色、不透明、粗糙顆粒狀或節(jié)狀堆聚的菌落，呈現(xiàn)“菜花狀”3.結(jié)核桿菌快速培養(yǎng)檢測(cè)方法：無菌手續(xù)將前處理后的材料涂片，置液體培養(yǎng)基中，35℃恒三、齊一尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法（操作）【原理】結(jié)核桿菌對(duì)苯胺染料不易著色，若加溫或延長(zhǎng)染色時(shí)間使其著色后，再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色，再經(jīng)美蘭復(fù)染，結(jié)核桿菌及其他分枝桿菌仍呈紅色，而非抗酸菌和細(xì)胞雜質(zhì)等呈藍(lán)色?！静牧稀?.結(jié)核病人痰液：采取清晨第一口粘痰，或濃縮集落菌法處理過的痰標(biāo)本。2．抗酸染色液3.載物玻片、玻片夾、酒精燈、臘筆等。【方法】1.無菌手續(xù)采取痰液涂片，自然干燥，火焰固定。2.用臘筆將涂面局部隔開，滴加石炭酸復(fù)紅染液，酒精燈上加熱至出現(xiàn)蒸氣。切勿沸騰，亦不可使染液干涸。如有干涸的趨勢(shì)，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)加染液。持續(xù)染色5-8分鐘，待冷后流水漂去多余的染液。3.用3%鹽酸酒精清脫色，脫至涂面無色為止，約1-3分鐘，自來水沖洗。4.滴加呂氏美蘭染液復(fù)雜30秒~1分鐘，水洗。自然干燥或吸干后油鏡檢查?！窘Y(jié)果】1.結(jié)核桿菌呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)，略有彎曲的紅色菌體，有的可表現(xiàn)出分枝特征，有的菌體表現(xiàn)有多數(shù)濃染顆粒。結(jié)核桿菌大多分散排列，亦可以見到有縱行條索狀排列。2.涂片染色能查到結(jié)核桿菌者，一般需要每毫升痰液內(nèi)含菌量至少應(yīng)有500個(gè)以上，甚至需達(dá)到5萬以上。故材料多進(jìn)行濃縮集菌處理，以提高檢出陽性率，也造成在染色標(biāo)本片觀察中，不一定每個(gè)視野都能看到結(jié)核桿菌。3.結(jié)核桿菌易發(fā)生變異，在陳舊培養(yǎng)基或臨床治療后標(biāo)本材料中，結(jié)核桿菌往往菌體斷裂，或形成非抗酸性革蘭氏陽性的短桿狀、球狀顆粒，亦稱Much顆粒。4.標(biāo)本已經(jīng)高壓滅菌處理，不影響染色結(jié)果，也保證操作者的安全。四、熒光染色法此系用金胺熒光素染擴(kuò)酸性細(xì)菌的方法，簡(jiǎn)便易行，但不具特異性。金胺染色法有多種、現(xiàn)列于后表，可選擇使用，應(yīng)用熒光顯微鏡檢查結(jié)果?？顾峋鸢窡晒馑厝旧ǚ椒ㄈ緞r(shí)間脫色劑時(shí)間對(duì)比染液時(shí)間結(jié)果金胺—酚染色法金胺0.1g，加5%石炭酸100ml10至15分鐘3%鹽酸酒精1分鐘0.5%高錳酸鉀溶液1分鐘抗酸菌呈金黃色或銀白色熒光，紫外光源呈暗背景,紫蘭光源呈蘭色背景金胺—羅丹明（B）染色法金胺1.5g，羅丹明（B）0.7g，0.7g,甘油75ml，石炭酸10ml，蒸餾水50ml，搖勻，溶解過濾備用15至20分鐘0.5%鹽酸酒精2分鐘5%高錳酸鉀溶液2至4分鐘抗酸菌呈金黃色熒光，背景清晰，無其它熒光物質(zhì)干擾方法染劑時(shí)間脫色劑時(shí)間對(duì)比染液時(shí)間結(jié)果金胺—品紅—美蘭染色法金胺（O）0.1g加95%酒精10ml，石炭石炭酸3ml，蒸餾水87ml混勻，堿性品紅4g溶于75%酒精20ml中緩慢加9%碳酸100ml混勻15分鐘3%鹽酸酒精2分鐘10%呂弗勒氏美蘭水溶液2分鐘熒光鏡檢，抗酸菌呈亮黃色熒光，普通光學(xué)顯微鏡檢，抗酸菌呈紅色，背景及其它細(xì)菌呈蘭色五、結(jié)核桿菌毒力試驗(yàn)——?jiǎng)游镌囼?yàn)法【材料】1.動(dòng)物：體重200~250克豚鼠2只2.結(jié)核桿菌培養(yǎng)物或結(jié)核病人檢驗(yàn)材料（痰、尿、糞、腹水等材料經(jīng)濃縮集菌）3.注射器及消毒用材料等?！痉椒ā?.選取結(jié)核菌素試驗(yàn)為陰性的豚鼠兩只。2.吸取結(jié)核桿菌懸液或病人檢材，注入豚鼠腹股溝皮下0.1ml3.注射后每周定期檢查一次，觀察豚鼠腹股溝淋巴結(jié)是否腫大，局部變硬，化膿及體重減輕、體溫升高等癥狀。4.給豚鼠作結(jié)核菌素試驗(yàn)，是否出現(xiàn)陽性結(jié)果。5.6周后，將豚鼠進(jìn)行解剖，觀察淋巴結(jié)是否腫大，有無干酪性病變，肝、脾、肺等是否腫大，表面有無灰白色結(jié)節(jié)病灶，取可疑病灶進(jìn)行涂片染色鏡檢和分離培養(yǎng)。若為陽性結(jié)果，可報(bào)告“動(dòng)物接種后××天查到有結(jié)核菌感染”。如無癥狀及病變者，可報(bào)告為陰性。六、結(jié)核桿菌濃縮集菌法（以處理痰標(biāo)本為例）材料：結(jié)核病人24小時(shí)痰液，細(xì)口瓶，0.02%酚紅液、汽油，NaOH，無菌生理鹽水等。（一）漂浮法：1.取24小時(shí)痰液15毫升，裝入細(xì)口瓶?jī)?nèi)，加入2倍量0.5%NaOH搖勻，高壓滅菌或煮沸20—30分鐘殺菌。2.待冷后加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振蕩20—30分鐘，用生理鹽水加至液面與瓶口齊，靜置半小時(shí)。3.取瓶口表面油狀物涂于載物玻片上，微微加熱，干后再加，如此重復(fù)5—6次，至厚度適宜，烘干待冷，抗酸染色，油鏡頭檢查。(二)沉淀法：1.取痰液1份或2倍量4%NaOH，高壓無菌或煮沸20—30分鐘后，加入0.02%酚紅指示劑0.1毫升，劇烈振蕩混勻，亦可置37℃2.矯正PH為7.0，3000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，棄去上清液。3.取沉淀物涂片染色鏡檢。若進(jìn)行分離培養(yǎng)和動(dòng)物接種，可免去高壓滅菌或煮沸的程序。《附錄》抗酸染液的配制1.石炭酸復(fù)紅液：稱取鹼性復(fù)紅4克，溶于95%酒精100毫升中成飽和液。再取飽和液10毫升與5%石炭酸溶液90毫升混勻即成。2.3%鹽酸酒精：取濃鹽酸3毫升，95%酒97毫升混合。3.呂弗勒氏鹼性美蘭液：稱取美蘭2克，溶于95%酒精100毫升中，配成飽和液，取飽和液30毫升，再加入蒸餾水100毫升及10%氫氧化鉀水溶液0.1毫升即成。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2：病毒部分的綜合實(shí)驗(yàn)（一）實(shí)驗(yàn)十五流感病毒的分離鑒定流行性感冒病毒簡(jiǎn)稱流感病毒