酵母表達系統(tǒng)教案課件

酵母表達系統(tǒng)陳凱酵母表達系統(tǒng)陳凱1主要內(nèi)容一、酵母表達系統(tǒng)的種類；二、酵母的表達載體；三、釀酒酵母表達系統(tǒng)；四、畢赤酵母表達系統(tǒng)；五、畢赤酵母表達系統(tǒng)中外源基因表達優(yōu)化。第1頁/共31頁主要內(nèi)容第1頁/共31頁2酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單細胞真核生物。（可有性繁殖）第2頁/共31頁酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單3一、酵母表達系統(tǒng)的種類1、釀酒酵母表達系統(tǒng)；2、甲醇營養(yǎng)型酵母表達系統(tǒng)---巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母；3、裂殖酵母表達系統(tǒng)；4、乳酸克魯維亞酵母表達系統(tǒng)；5、Arxulaadeninivorams。第3頁/共31頁一、酵母表達系統(tǒng)的種類第3頁/共31頁4二、酵母的表達載體

酵母表達載體依據(jù)其復制形式分為自主復制型和整合型兩種。1、游離質(zhì)粒載體指帶有自主復制序列（ARS）的復制型質(zhì)粒和帶有酵母內(nèi)源質(zhì)粒2μ環(huán)的衍生質(zhì)粒載體。

它細分為三種：

①酵母附加型質(zhì)粒（YEp）----拷貝數(shù)高較穩(wěn)定；

②酵母復制質(zhì)粒（YRp）-----拷貝數(shù)高但不穩(wěn)定；

③酵母著絲質(zhì)粒（YCp）----每個細胞平均只有一個拷貝，穩(wěn)定。第4頁/共31頁二、酵母的表達載體第4頁/共31頁52、整合載體

整合載體（yeastintegrationplasmid，YIp）指不含酵母自助復制序列，不能獨立復制的載體，但含有整合介導區(qū)，可通過同源重組整合入酵母基因組并隨同酵母染色體一起復制。第5頁/共31頁2、整合載體第5頁/共31頁6三、釀酒酵母表達系統(tǒng)

釀酒酵母是目前了解最完全的真核生物，1996年完成全基因組測序，是一種真核生物模式菌，被FDA認定為安全性生物。1、常用的啟動子1）糖酵解途徑中關鍵酶的啟動子：甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PGK、乙醇脫氫酶基因ADH；2）半乳糖激酶啟動子：GAL1；3）

pho4TS-PHO5啟動子。第6頁/共31頁三、釀酒酵母表達系統(tǒng)第6頁/共31頁72、釀酒酵母分泌系統(tǒng)1）信號肽結(jié)構：2）常用分泌信號肽：①性結(jié)合因子---MF-α；②酸性磷酸酯酶---PHO5；③蔗糖酶---SUC2；④

殺手毒素因子KIL。3）信號肽特點：

①保守性低；②大多異源宿主系統(tǒng)的信號肽不能互用；第7頁/共31頁2、釀酒酵母分泌系統(tǒng)第7頁/共31頁84）MF-α信號肽：①由88個AA組成；②分泌效率高；③在酵母系統(tǒng)具有通用性。第8頁/共31頁4）MF-α信號肽：第8頁/共31頁93、釀酒酵母糖基化系統(tǒng)1）糖基化位點：

Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）2）糖基化類型：

①N-型糖基化：天門冬酰氨酸殘基上的酰胺氮進行糖基化，對蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性及活性較重要。

②O-型糖基化：蘇氨酸/絲氨酸上的羥基氧進行糖基化。3）糖基化特點：過糖基化（超糖基化修飾）第9頁/共31頁3、釀酒酵母糖基化系統(tǒng)第9頁/共31頁104、釀酒酵母表達系統(tǒng)缺點：1）對產(chǎn)物的翻譯后修飾與高等真核生物不同，常發(fā)生超糖基化（N-糖基鏈上出現(xiàn)>100個甘露糖，是正常的十幾倍）；2）不易進行高密度發(fā)酵，表達產(chǎn)物產(chǎn)量低；3）分泌效率低，>30KDa的蛋白幾乎不分泌；4）表達的蛋白C端易被截斷；第10頁/共31頁4、釀酒酵母表達系統(tǒng)缺點：第10頁/共31頁11四、巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)

巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)型酵母，是80年代開發(fā)和研制的一種外源蛋白高效表達系統(tǒng)。1、特點●含醇氧化酶基因（AOX）強啟動子，用甲醇可嚴格調(diào)控外源基因的表達；●外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定；●自身分泌的背景蛋白少；●表達水平高，即可胞內(nèi)表達又能胞外表達；●具有翻譯后修飾系統(tǒng)（糖基化、磷酸化、脂酰化）；●使用簡單，成本低廉；●可高密度發(fā)酵，且發(fā)酵工藝成熟，易放大；第11頁/共31頁四、巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)第11頁/共31頁122、宿主細胞目前廣泛應用于外源基因表達和研究的畢赤酵母宿主菌有兩種主要類型：營養(yǎng)缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌。1）營養(yǎng)缺陷型菌株第12頁/共31頁2、宿主細胞第12頁/共31頁132）蛋白酶缺陷型菌株第13頁/共31頁2）蛋白酶缺陷型菌株第13頁/共31頁143、表達載體由于畢赤酵母沒有穩(wěn)定的游離型載體，故應用整合型載體，通過同源重組整合到酵母染色體來實現(xiàn)穩(wěn)定表達。分泌表達型載體pPICZαAEcoRI、XbaI、KpnI……HIS4α-Factor，Zeoncin第14頁/共31頁3、表達載體分泌表達型載體pPICZαAEco15胞內(nèi)表達型載體第15頁/共31頁胞內(nèi)表達型載體第15頁/共31頁16常用啟動子第16頁/共31頁常用啟動子第16頁/共31頁174、轉(zhuǎn)化及篩選鑒定①表達載體的線性化②感受態(tài)細胞的制備③轉(zhuǎn)化④營養(yǎng)缺陷篩選（His）⑤抗性篩選（G418）⑥鑒定（菌落PCR或表達）第17頁/共31頁4、轉(zhuǎn)化及篩選鑒定①表達載體的線性化②感受態(tài)細胞的制備③轉(zhuǎn)化18（1）表達載體的線性化

未線性化的環(huán)狀質(zhì)粒之間發(fā)生同源重組的幾率非常低，故需使用特定的限制性內(nèi)切酶進行線性化處理。處理的目的：1）防止隨機插入重組時質(zhì)粒在功能區(qū)斷開，造成目的基因表達失活；2）讓同源重組以指定的方式發(fā)生。第18頁/共31頁（1）表達載體的線性化第18頁/共31頁19（2）轉(zhuǎn)化方式第19頁/共31頁（2）轉(zhuǎn)化方式第19頁/共31頁20（3）目的基因的整合方式1）基因插入AOX1或aox1::AGR4位點第20頁/共31頁（3）目的基因的整合方式第20頁/共31頁212）基因替換AOXI位點第21頁/共31頁2）基因替換AOXI位點第21頁/共31頁223）基因插入HIS4位點第22頁/共31頁3）基因插入HIS4位點第22頁/共31頁234）多拷貝插入第23頁/共31頁4）多拷貝插入第23頁/共31頁24（4）篩選1）組氨酸缺陷平板初篩

畢赤酵母菌GS115及KM117在組氨酸脫氫酶位點（His4）有突變，因而不能合成組氨酸。轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒含HIS4基因可與宿主互補，通過MD篩選培養(yǎng)基即可選擇轉(zhuǎn)化子。2）G418平板篩選多拷貝

質(zhì)粒上含有細菌的Kana基因（其與表達盒之間有遺傳連鎖），賦予畢赤酵母遺傳霉素抗性。遺傳霉素抗性水平主要依賴整合的kana基因的數(shù)目；每個單拷貝的基因賦予畢赤酵母約0.25mg/ml的遺傳霉素抗性水平。第24頁/共31頁（4）篩選第24頁/共31頁25五、外源基因表達優(yōu)化1、基因拷貝數(shù)（基因劑量）：

目的基因的拷貝數(shù)對表達量影響極大，不同的基因?qū)截悢?shù)的要求不同。因此，實驗時要對不同拷貝的菌株進行表達量篩選。2、基因序列組成：①A+T含量高的基因在酵母中由于提前終止而不能有效的轉(zhuǎn)錄[序列TAAATAAA/G是酵母的poly（A）識別信號]。因此控制其含量在30%~55%之間是切實可行的方法。②mRNA的5‘-UTR長度及其核苷酸序列對外源基因在酵母中的表達影響很大。因此目的基因的5’-UTR與AOX1基因的（114個AA，AT含量為73%）必須保持盡可能的接近，最好完全符合。第25頁/共31頁五、外源基因表達優(yōu)化1、基因拷貝數(shù)（基因劑量）：第25頁/共263、密碼子優(yōu)化：

各物種存在這密碼子偏愛性的現(xiàn)象，因此采用酵母偏愛的密碼子可顯著提高表達量；4、啟動子：

選擇啟動子時,必須依據(jù)研究目的和外源蛋白的性質(zhì)來選擇最合適的啟動子,有時并不是啟動子越強越好,合理選擇與設計啟動子是提高外源蛋白產(chǎn)量的有效途徑。

5、糖基化修飾：

畢赤酵母的糖基化修飾作用對外源蛋白的表達量和蛋白性質(zhì)都有影響。其糖基化程度雖比釀酒酵母弱，但與天然蛋白相比，仍存糖基化過度問題。

因此在不影響功能的情況下，定向突變糖基化位點、或選擇與糖苷酶進行共表達，來解決該問題。

第26頁/共31頁3、密碼子優(yōu)化：第26頁/共31頁276、信號肽：

根據(jù)不同結(jié)構及性質(zhì)的外源蛋白選擇適當?shù)男盘栯牟⑦M行相應改造，以期實現(xiàn)高效表達。

第27頁/共31頁6、信號肽：第27頁/共31頁287、外源蛋白的降解：1）培養(yǎng)基中加入富含氨基酸和多肽的添加劑（蛋白胨和酪蛋白水解物)

；2）調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值以降低蛋白酶活性；3）添加蛋白酶抑制劑（PMSF、EDTA）；4）使用蛋白酶缺陷菌株；共表達蛋白水解酶抑制劑

5）共表達蛋白水解酶抑制劑（如分泌型白細胞蛋白酶抑制因子—SLPI）；

6）利用過氧化物酶體靶向信號(Peroxisomaltargetingsignal，PTS)與目的蛋白連接；7）在不改變重組蛋白性質(zhì)的前提下，去除蛋白酶的作用位點；8）利用在畢赤酵母中穩(wěn)定的蛋白伴侶與目的蛋白融合表達，可明顯地提高表達量（如二硫鍵異構酶PDI。

第28頁/共31頁7、外源蛋白的降解：第28頁/共31頁29謝謝！第29頁/共31頁謝謝！第29頁/共31頁30甲醇的代謝途徑第30頁/共31頁甲醇的代謝途徑第30頁/共31頁31感謝您的觀看！第31頁/共31頁感謝您的觀看！第31頁/共31頁32酵母表達系統(tǒng)陳凱酵母表達系統(tǒng)陳凱33主要內(nèi)容一、酵母表達系統(tǒng)的種類；二、酵母的表達載體；三、釀酒酵母表達系統(tǒng)；四、畢赤酵母表達系統(tǒng)；五、畢赤酵母表達系統(tǒng)中外源基因表達優(yōu)化。第1頁/共31頁主要內(nèi)容第1頁/共31頁34酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單細胞真核生物。（可有性繁殖）第2頁/共31頁酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單35一、酵母表達系統(tǒng)的種類1、釀酒酵母表達系統(tǒng)；2、甲醇營養(yǎng)型酵母表達系統(tǒng)---巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母；3、裂殖酵母表達系統(tǒng)；4、乳酸克魯維亞酵母表達系統(tǒng)；5、Arxulaadeninivorams。第3頁/共31頁一、酵母表達系統(tǒng)的種類第3頁/共31頁36二、酵母的表達載體

酵母表達載體依據(jù)其復制形式分為自主復制型和整合型兩種。1、游離質(zhì)粒載體指帶有自主復制序列（ARS）的復制型質(zhì)粒和帶有酵母內(nèi)源質(zhì)粒2μ環(huán)的衍生質(zhì)粒載體。

它細分為三種：

①酵母附加型質(zhì)粒（YEp）----拷貝數(shù)高較穩(wěn)定；

②酵母復制質(zhì)粒（YRp）-----拷貝數(shù)高但不穩(wěn)定；

③酵母著絲質(zhì)粒（YCp）----每個細胞平均只有一個拷貝，穩(wěn)定。第4頁/共31頁二、酵母的表達載體第4頁/共31頁372、整合載體

整合載體（yeastintegrationplasmid，YIp）指不含酵母自助復制序列，不能獨立復制的載體，但含有整合介導區(qū)，可通過同源重組整合入酵母基因組并隨同酵母染色體一起復制。第5頁/共31頁2、整合載體第5頁/共31頁38三、釀酒酵母表達系統(tǒng)

釀酒酵母是目前了解最完全的真核生物，1996年完成全基因組測序，是一種真核生物模式菌，被FDA認定為安全性生物。1、常用的啟動子1）糖酵解途徑中關鍵酶的啟動子：甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PGK、乙醇脫氫酶基因ADH；2）半乳糖激酶啟動子：GAL1；3）

pho4TS-PHO5啟動子。第6頁/共31頁三、釀酒酵母表達系統(tǒng)第6頁/共31頁392、釀酒酵母分泌系統(tǒng)1）信號肽結(jié)構：2）常用分泌信號肽：①性結(jié)合因子---MF-α；②酸性磷酸酯酶---PHO5；③蔗糖酶---SUC2；④

殺手毒素因子KIL。3）信號肽特點：

①保守性低；②大多異源宿主系統(tǒng)的信號肽不能互用；第7頁/共31頁2、釀酒酵母分泌系統(tǒng)第7頁/共31頁404）MF-α信號肽：①由88個AA組成；②分泌效率高；③在酵母系統(tǒng)具有通用性。第8頁/共31頁4）MF-α信號肽：第8頁/共31頁413、釀酒酵母糖基化系統(tǒng)1）糖基化位點：

Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）2）糖基化類型：

①N-型糖基化：天門冬酰氨酸殘基上的酰胺氮進行糖基化，對蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性及活性較重要。

②O-型糖基化：蘇氨酸/絲氨酸上的羥基氧進行糖基化。3）糖基化特點：過糖基化（超糖基化修飾）第9頁/共31頁3、釀酒酵母糖基化系統(tǒng)第9頁/共31頁424、釀酒酵母表達系統(tǒng)缺點：1）對產(chǎn)物的翻譯后修飾與高等真核生物不同，常發(fā)生超糖基化（N-糖基鏈上出現(xiàn)>100個甘露糖，是正常的十幾倍）；2）不易進行高密度發(fā)酵，表達產(chǎn)物產(chǎn)量低；3）分泌效率低，>30KDa的蛋白幾乎不分泌；4）表達的蛋白C端易被截斷；第10頁/共31頁4、釀酒酵母表達系統(tǒng)缺點：第10頁/共31頁43四、巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)

巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)型酵母，是80年代開發(fā)和研制的一種外源蛋白高效表達系統(tǒng)。1、特點●含醇氧化酶基因（AOX）強啟動子，用甲醇可嚴格調(diào)控外源基因的表達；●外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定；●自身分泌的背景蛋白少；●表達水平高，即可胞內(nèi)表達又能胞外表達；●具有翻譯后修飾系統(tǒng)（糖基化、磷酸化、脂酰化）；●使用簡單，成本低廉；●可高密度發(fā)酵，且發(fā)酵工藝成熟，易放大；第11頁/共31頁四、巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)第11頁/共31頁442、宿主細胞目前廣泛應用于外源基因表達和研究的畢赤酵母宿主菌有兩種主要類型：營養(yǎng)缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌。1）營養(yǎng)缺陷型菌株第12頁/共31頁2、宿主細胞第12頁/共31頁452）蛋白酶缺陷型菌株第13頁/共31頁2）蛋白酶缺陷型菌株第13頁/共31頁463、表達載體由于畢赤酵母沒有穩(wěn)定的游離型載體，故應用整合型載體，通過同源重組整合到酵母染色體來實現(xiàn)穩(wěn)定表達。分泌表達型載體pPICZαAEcoRI、XbaI、KpnI……HIS4α-Factor，Zeoncin第14頁/共31頁3、表達載體分泌表達型載體pPICZαAEco47胞內(nèi)表達型載體第15頁/共31頁胞內(nèi)表達型載體第15頁/共31頁48常用啟動子第16頁/共31頁常用啟動子第16頁/共31頁494、轉(zhuǎn)化及篩選鑒定①表達載體的線性化②感受態(tài)細胞的制備③轉(zhuǎn)化④營養(yǎng)缺陷篩選（His）⑤抗性篩選（G418）⑥鑒定（菌落PCR或表達）第17頁/共31頁4、轉(zhuǎn)化及篩選鑒定①表達載體的線性化②感受態(tài)細胞的制備③轉(zhuǎn)化50（1）表達載體的線性化

未線性化的環(huán)狀質(zhì)粒之間發(fā)生同源重組的幾率非常低，故需使用特定的限制性內(nèi)切酶進行線性化處理。處理的目的：1）防止隨機插入重組時質(zhì)粒在功能區(qū)斷開，造成目的基因表達失活；2）讓同源重組以指定的方式發(fā)生。第18頁/共31頁（1）表達載體的線性化第18頁/共31頁51（2）轉(zhuǎn)化方式第19頁/共31頁（2）轉(zhuǎn)化方式第19頁/共31頁52（3）目的基因的整合方式1）基因插入AOX1或aox1::AGR4位點第20頁/共31頁（3）目的基因的整合方式第20頁/共31頁532）基因替換AOXI位點第21頁/共31頁2）基因替換AOXI位點第21頁/共31頁543）基因插入HIS4位點第22頁/共31頁3）基因插入HIS4位點第22頁/共31頁554）多拷貝插入第23頁/共31頁4）多拷貝插入第23頁/共31頁56（4）篩選1）組氨酸缺陷平板初篩

畢赤酵母菌GS115及KM117在組氨酸脫氫酶位點（His4）有突變，因而不能合成組氨酸。轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒含HIS4基因可與宿主互補，通過MD篩選培養(yǎng)基即可選擇轉(zhuǎn)化子。2）G418平板篩選多拷貝

質(zhì)粒上含有細菌的Kana基因（其與表達盒之間有遺傳連鎖），賦予畢赤酵母遺傳霉素抗性。遺傳霉素抗性水平主要依賴整合的kana基因的數(shù)目；每個單拷貝的基因賦予畢赤酵母約0.25mg/ml的遺傳霉素抗性水平。第24頁/共31頁（4）篩選第24頁/共31頁57五、外源基因表達優(yōu)化1、基因拷貝數(shù)（基因劑量）：

目的基因的拷貝數(shù)對表達量影響極大，不同的基因?qū)截悢?shù)的要求不同。因此，實驗時要對不同拷貝的菌株進行表達量篩選。2、基因序列組成：①A+T含量高的基因在酵母中由于提前終止而不能有效的轉(zhuǎn)錄[序列TAAATAAA/G是酵母的poly（A）識別信號]。因此控制其含量在30%~55%之間是切實可行的方法。②mRNA的5‘-UTR長度及其核苷酸序列對外源基因在酵母中的表達影響很大。因此目的基因的5’-UTR與AOX1基因的（114個AA，AT含量為73%）必須保持盡可能的接近，最好完全符合。第25頁/共31頁五、外源基因表達優(yōu)化1、基因拷貝數(shù)（基因劑量）：第25頁/共583、密碼子優(yōu)化：

各物種