《蛋白質(zhì)與酶工程實(shí)驗(yàn)》課程教學(xué)大綱

《蛋白質(zhì)與酶工程實(shí)驗(yàn)》課程教學(xué)大綱一、課程基本情況課程代碼：1061149015課程名稱：蛋白質(zhì)與酶工程實(shí)驗(yàn)/ExperimentofProteinandEnzymeEngineering課程類別：專業(yè)必修課程總學(xué)分：1.5總學(xué)時(shí)：24實(shí)驗(yàn)/實(shí)踐學(xué)時(shí)：24適用專業(yè)：生物技術(shù)適用對象：本科先修課程：有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)開課學(xué)院：環(huán)境工程與化學(xué)學(xué)院二、課程簡介《蛋白質(zhì)與酶工程實(shí)驗(yàn)》是生物技術(shù)專業(yè)的必修課程，是現(xiàn)代酶學(xué)和生物工程學(xué)相互結(jié)合而發(fā)展起來的技術(shù)性學(xué)科，具有極強(qiáng)的實(shí)踐性和應(yīng)用性。蛋白質(zhì)與酶工程實(shí)驗(yàn)課程是理論課的延伸，其主要任務(wù)是使學(xué)生掌握常見酶制劑的生產(chǎn)、分離純化、活力測定、固定化及酶反應(yīng)器模型的制作等基本操作技術(shù)，并在各個(gè)教學(xué)環(huán)節(jié)中培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的科學(xué)態(tài)度和團(tuán)隊(duì)合作精神。三、課程教學(xué)目標(biāo)1．課程對畢業(yè)要求的支撐指標(biāo)點(diǎn)6.1基于生物技術(shù)相關(guān)的原理，采用科學(xué)方法，針對生物發(fā)酵、生物分析及診斷領(lǐng)域的實(shí)際問題設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，并具備進(jìn)行實(shí)施的操作能力；指標(biāo)點(diǎn)6.2具備準(zhǔn)確采集、整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際問題進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和討論，獲取合理有效的結(jié)論；2.課程教學(xué)目標(biāo)（1）具備發(fā)酵液預(yù)處理的能力，并通過總活力、總蛋白和比活力的測定對純化手段進(jìn)行評價(jià)，初步具備設(shè)計(jì)酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)工藝的能力；（2）具備酶制劑活力測定的能力，能夠準(zhǔn)確記錄和分析數(shù)據(jù)，對酶制劑產(chǎn)品的質(zhì)量做出判斷，培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的科學(xué)態(tài)度，理解團(tuán)隊(duì)分工合作的必要性。（3）具備固定化酶制劑的活力、回收率測定的能力，掌握初步設(shè)計(jì)酶制劑的固定化方案或構(gòu)建酶反應(yīng)器模型。3.主要教學(xué)內(nèi)容與課程教學(xué)目標(biāo)之間的對應(yīng)關(guān)系課程教學(xué)目標(biāo)教學(xué)內(nèi)容教學(xué)方法目標(biāo)1具備發(fā)酵液預(yù)處理的能力，并通過總活力、總蛋白和比活力的測定對純化手段進(jìn)行評價(jià)，初步具備設(shè)計(jì)酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)工藝的能力；菌種的活化；發(fā)酵培養(yǎng)基的制備；發(fā)酵條件的優(yōu)化；發(fā)酵時(shí)間的確定；發(fā)酵液的固液分離；粗酶制劑的制備；酶制劑的純化；紫外分光光度法測定酶的總活力、總蛋白量、比活力、純化倍數(shù)及回收率等。1.啟發(fā)式教學(xué)2.案例分析3.翻轉(zhuǎn)課堂4.操作指導(dǎo)目標(biāo)2：具備酶制劑活力測定的能力，能夠準(zhǔn)確記錄和分析數(shù)據(jù)，對酶制劑產(chǎn)品的質(zhì)量做出判斷，培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的科學(xué)態(tài)度，理解團(tuán)隊(duì)分工合作的必要性；有機(jī)溶劑制備酶制劑；等電點(diǎn)沉淀法分離純化制備粗酶制劑；酶制劑純化和結(jié)晶；酶制劑產(chǎn)品的活力檢測。1.啟發(fā)式教學(xué)2.案例分析3.翻轉(zhuǎn)課堂4.操作指導(dǎo)目標(biāo)3：具備固定化酶制劑的活力、回收率測定的能力，掌握初步設(shè)計(jì)酶制劑的固定化方案或構(gòu)建酶反應(yīng)器模型。包埋法固定化酶制劑；固定化酶制劑的活力及回收率測定；固定化技術(shù)對酶制劑的影響；固定化酶制備填充床式小型酶反應(yīng)器模型及其應(yīng)用效果檢測。1.啟發(fā)式教學(xué)2.案例分析3.翻轉(zhuǎn)課堂4.操作指導(dǎo)四、教學(xué)內(nèi)容及重難點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一枯草桿菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)α－淀粉酶實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆瘴⑸锇l(fā)酵生產(chǎn)酶制劑的一般工藝；掌握搖瓶培養(yǎng)的方法。實(shí)驗(yàn)原理：微生物發(fā)酵法是實(shí)際生產(chǎn)中酶制劑制取的主要方法。發(fā)酵方法有固體發(fā)酵法和液體發(fā)酵法，生產(chǎn)中多用液體深層發(fā)酵法制備酶。在進(jìn)行大規(guī)模液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)酶制劑之前，必須首先在實(shí)驗(yàn)室對保藏的目的菌種進(jìn)行活化和擴(kuò)大培養(yǎng)，制得生產(chǎn)種子。擴(kuò)大培養(yǎng)多采用搖瓶培養(yǎng)，即在錐形瓶中加入一定量的液體培養(yǎng)基，在搖床上以一定轉(zhuǎn)速搖動(dòng)進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。而搖瓶培養(yǎng)也是實(shí)驗(yàn)室模擬生產(chǎn)上進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶的一種模擬實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟：（1）培養(yǎng)基的制備；（2）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌；（3）接種；（4）培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所需主要設(shè)備及材料：（1）馬鈴薯培養(yǎng)基；（2）淀粉蛋白胨培養(yǎng)基；（3）發(fā)酵培養(yǎng)基；（4）高壓滅菌鍋；（5）超凈工作臺(tái)；（6）三角瓶；（7）離心機(jī)；（8）水浴鍋；（9）搖床培養(yǎng)箱等。實(shí)驗(yàn)二α－淀粉酶的初步純化實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆誃radford法測定蛋白質(zhì)濃度；掌握酶制劑進(jìn)行初步分離的常用方法。實(shí)驗(yàn)原理：α－淀粉酶是一種胞外酶，其初步分離純化通常是將發(fā)酵液經(jīng)過預(yù)處理后采用過濾或離心的方法進(jìn)行固液分離，然后加入硫酸銨進(jìn)行鹽析獲得酶泥，最后干燥獲得酶制劑。在酶的分離純化過程中，通過測定每步操作后酶總活力、總蛋白和比活力，進(jìn)而計(jì)算酶活力回收率和純化倍數(shù)，從而判斷每步使用的純化手段是否適宜目的酶制劑的分離和純化。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟：（1）α-淀粉酶的活力測定；（2）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；（3）發(fā)酵液蛋白質(zhì)濃度的測定；（4）發(fā)酵液的預(yù)處理；（5）鹽析法分離酶制劑。實(shí)驗(yàn)所需主要設(shè)備及材料：（1）Bradford液；（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白母液；（3）離心機(jī)；（4）硫酸銨等。實(shí)驗(yàn)三有機(jī)溶劑沉淀法制備大豆脲酶實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私怆迕傅闹苽溥^程；掌握有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法和結(jié)晶等分離純化酶的方法和原理。實(shí)驗(yàn)原理：脲酶廣泛存在于微生物和動(dòng)植物組織中，1926年Sumner曾用32%的丙酮溶液從刀豆粉中提取脲酶，制得了結(jié)晶。該酶分子量483kD，由6個(gè)亞基組成，等電點(diǎn)4.9,溶于水和稀緩沖液，粗酶較穩(wěn)定，純酶不穩(wěn)定，結(jié)晶酶在低溫下可穩(wěn)定1年以上。本實(shí)驗(yàn)用乙醇從大豆種子中提取脲酶，用有機(jī)溶劑和等電點(diǎn)結(jié)合法沉淀制取該酶。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟：（1）脲酶提?。唬?）脲酶純化；（3）酶的重結(jié)晶。實(shí)驗(yàn)所需主要設(shè)備及材料：（1）冰浴、大容量常速離心機(jī)、50mL,10mL,5mL離心管、1.5mL離心管及其他常規(guī)儀器；（2）新鮮大豆粉；（3）2%醋酸；（4）64%和32%丙酮。實(shí)驗(yàn)四脲酶Km值的測定實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆彰钢苿㎏m值的測定方法。實(shí)驗(yàn)原理：尿素能夠被脲酶催化分解產(chǎn)生碳酸銨。碳酸銨在堿性溶液內(nèi)與奈氏試劑作用，產(chǎn)生橙黃色的碘化雙汞銨，在一定范圍內(nèi)，呈色深淺與碳酸銨多少成正比。故借比色法可測定單位時(shí)間所產(chǎn)生碳酸銨量從而求得酶促反應(yīng)速度。在保持恒溫的合適條件（時(shí)間、溫度及pH），以同一濃度的脲酶催化不同的尿素分解，于一定限度內(nèi)，酶促反應(yīng)速度成正比。因此，用酶促反應(yīng)速度倒數(shù)（1/v）為縱坐標(biāo)，尿素濃度倒數(shù)（1/c）為橫坐標(biāo)，依L、K法作圖，即可求出脲酶的Km值。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟：（1）制備不同濃度梯度的底物；（2）酶促反應(yīng)；（3）記錄時(shí)間，終止反應(yīng)；（4）加入顯色液，分光光度計(jì)測定產(chǎn)物生成量；（5）根據(jù)吸光度值作圖，計(jì)算酶制劑的Km值。實(shí)驗(yàn)所需主要設(shè)備及材料：（1）恒溫水浴鍋，722型分光光度計(jì)，小漏斗，濾紙，移液器等；（2）實(shí)驗(yàn)三中制備的脲酶、無水酒精、尿素（AR）、Na2HPO4,KH2PO4,ZnSO4,NaOH、酒石酸鉀納、KI、碘、汞、奈氏試劑。實(shí)驗(yàn)五凝膠包埋法固定化脲酶實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆彰腹潭ɑ姆椒ê驮?。?shí)驗(yàn)原理：凝膠包埋法是將酶或含酶菌體在各種凝膠內(nèi)部的微孔中，制成一定形狀的固定化酶或固定化菌體。常用的凝膠有瓊脂、海藻酸鈣、明膠、聚丙烯酰胺等。本實(shí)驗(yàn)把脲酶用聚丙烯酰胺凝膠包埋起來，制成固定化脲酶，可廣泛應(yīng)用于人工腎或處理尿素廢水。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟：（1）制備聚丙烯酰胺溶液；（2）加入酶制劑制備含酶凝膠；（3）固化后，稱重，于4℃冰箱中貯藏。實(shí)驗(yàn)所需主要設(shè)備及材料：（1）天平、小燒杯、刀片等；（2）丙烯酸胺，N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺（交聯(lián)劑），磷酸緩沖液（pH7.0），10%過硫酸鉀溶液(引發(fā)劑)，10%亞硫酸氫鈉溶液，實(shí)驗(yàn)三制備的脲酶。實(shí)驗(yàn)六固定化脲酶活力及其回收率的測定實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆展潭ɑ讣夹g(shù)對酶制劑的影響。實(shí)驗(yàn)原理：固定化酶的活力測定方法，有振蕩測定法、酶柱測定法和連續(xù)測定法等多種。常用的振蕩測定法，是將一定質(zhì)量的固定化酶，放在一定形狀、一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在固定化酶最適反應(yīng)條件下，振蕩或攪拌反應(yīng)系統(tǒng)，反應(yīng)一定時(shí)間，取出一定量的反應(yīng)液，進(jìn)行活力測定?；盍y定的反應(yīng)原理和方法，與溶液酶活力測定相同。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟：（1）固定化酶活力測定；（2）游離酶活力測定；（3）計(jì)算酶活力回收率實(shí)驗(yàn)所需主要設(shè)備及材料：（1）恒溫水浴槽、分光光度計(jì)、移液管、比色管及其他常規(guī)儀器用具；（2）實(shí)驗(yàn)五制備的固定化酶；（3）標(biāo)準(zhǔn)氨溶液、1mo1/LH2SO4和納氏試劑等。實(shí)驗(yàn)七填充床式酶反應(yīng)器的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱髋c應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私馓畛浯彩椒磻?yīng)器模型制作過程及其應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)原理：填充床反應(yīng)器（PFR）是當(dāng)前采用最多的一種反應(yīng)器形式，又稱活塞式反應(yīng)器。其突出的特點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率高，要求從填裝固定化酶開始就嚴(yán)格操作，填裝一定要均勻，運(yùn)行時(shí)流速要穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)五中制備的固定化酶進(jìn)行裝柱，柱床高度（H）和直徑（D）之比（H/D），一般以10-20為宜。太大，阻力大，流速慢；過小，底物反應(yīng)不完全。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟：（1）柱的準(zhǔn)備；（2）裝柱；（3）平衡；（4）組裝；（5）應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)所需主要設(shè)備及材料：（1）層析柱或堿式滴定管；（2）恒流泵；（3）儲(chǔ)液瓶；（4）尿素及磷酸緩沖液；（5）標(biāo)準(zhǔn)鹽酸及甲基紅-溴酚綠混合指示劑等。五、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目及學(xué)時(shí)安排序號(hào)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目名稱實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)類型實(shí)驗(yàn)要求每組人數(shù)備注1枯草桿菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)α－淀粉酶4必做32α－淀粉酶的初步純化4必做33有機(jī)溶劑沉淀法制備大豆脲酶4必做34脲酶Km值的簡易測定4必做35凝膠包埋法固定化脲酶4必做36固定化脲酶活力及其回收率的測定4選做3二選一7填充床式酶反應(yīng)器的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱髋c應(yīng)用4選做3合計(jì)24六、考核方式與評分標(biāo)準(zhǔn)1.課程考核方式本課程總成績包括形成性評價(jià)和結(jié)果性評價(jià)，形成性評價(jià)（平時(shí)成績）占70%，主要包括實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)和考勤（20%）、實(shí)驗(yàn)操作（20%）和實(shí)驗(yàn)報(bào)告（30%）；結(jié)果性評價(jià)（期末成績）占30%，主要包括方案設(shè)計(jì)。2.課程教學(xué)目標(biāo)的考核方式序號(hào)課程教學(xué)目標(biāo)考核內(nèi)容考核方式1具備發(fā)酵液預(yù)處理的能力，并通過總活力、總蛋白和比活力的測定對純化手段進(jìn)行評價(jià)，初步具備設(shè)計(jì)酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)工藝的能力；發(fā)酵產(chǎn)酶的基本知識(shí)；培養(yǎng)基的制備和微生物培養(yǎng)操作；發(fā)酵液預(yù)處理的要求及規(guī)范；酶活力指標(biāo)的測定原理和方法實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)、實(shí)驗(yàn)操作效果，實(shí)驗(yàn)報(bào)告，方案設(shè)計(jì)2具備酶制劑活力測定的能力，能夠準(zhǔn)確記錄和分析數(shù)據(jù)，對酶制劑產(chǎn)品的質(zhì)量做出判斷，培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的科學(xué)態(tài)度，理解團(tuán)隊(duì)分工合作的必要性；生物提取酶制劑的基本知識(shí)；各種分離純化方法的原理；酶制劑分離純化方法操作要求及規(guī)范實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)、實(shí)驗(yàn)操作效果，實(shí)驗(yàn)報(bào)告，方案設(shè)計(jì)3具備固定化酶制劑的活力、回收率測定的能力，掌握初步設(shè)計(jì)酶制劑的固定化方案或構(gòu)建酶反應(yīng)器模型。酶制劑固定化的基本原理；固定化酶制劑的活力、回收率測定的方法及操作；設(shè)計(jì)固定化酶制劑的應(yīng)用方案。實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)、實(shí)驗(yàn)操作效果，實(shí)驗(yàn)報(bào)告，方案設(shè)計(jì)3.成績評定標(biāo)準(zhǔn)考核環(huán)節(jié)考核結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)評估項(xiàng)目及權(quán)重優(yōu)秀（90-100分）良好（80-90分）中等（70-80分）及格（60-70分）不及格（＜60分）實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)和考勤（20%）不遲到，不早退，積極預(yù)習(xí)，思路清晰，能夠詳細(xì)了解實(shí)驗(yàn)原理和過程。出勤率較好，能夠做好預(yù)習(xí)工作，基本理解實(shí)驗(yàn)原理和過程。有遲到現(xiàn)象，基本無預(yù)習(xí)，不能較好的掌握實(shí)驗(yàn)原理。遲到次數(shù)較多，無預(yù)習(xí)，不了解實(shí)驗(yàn)流程。缺課次數(shù)較多，無預(yù)習(xí)，不了解實(shí)驗(yàn)流程。實(shí)驗(yàn)操作（20%）操作仔細(xì)規(guī)范，小組分工明確，結(jié)果準(zhǔn)確。操作仔細(xì)認(rèn)真，小組分工明確，結(jié)果可靠。操作認(rèn)真，規(guī)范性不夠，小組分工明確，結(jié)果基本可靠。操作不嚴(yán)謹(jǐn)，小組分工不明確，結(jié)果不準(zhǔn)確。操作有明顯敷衍現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)報(bào)告（30%）內(nèi)容完整充實(shí)，書寫工整規(guī)范，結(jié)果描述準(zhǔn)確，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的問題進(jìn)行有效的分析和討論。內(nèi)容完整，書寫規(guī)范，實(shí)驗(yàn)結(jié)果描述準(zhǔn)確，簡單對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和討論。內(nèi)容完整，書寫規(guī)范，結(jié)果