生物技術(shù)課件-02基因工程常用工具酶

2基因工程常用工具酶2基因工程常用工具酶基因工程的重要特點(diǎn)之一是在體外實(shí)行DNA分子的切割和重新連接。因此，工具酶是DNA體外操作必不可少的工具。取得編碼某種藥物的目的基因，大多需要工具酶－限制性核酸內(nèi)切酶將目的基因與載體DNA連接在一起，也需要工具酶－DNA連接酶。目前，許多廠商都在生產(chǎn)各種優(yōu)質(zhì)工具酶，簡化了分子克隆操作，拓寬了基因工程的研究領(lǐng)域?；蚬こ痰闹匾攸c(diǎn)之一是在體外實(shí)行DNA分子的切割和重新連接世界大型工具酶生產(chǎn)廠商：

（1）NovoNordisk（諾和諾德公司，丹麥）

（2）GistBroccdes（荷蘭）

（3）Cultot（科特公司，芬蘭）

（4）GenencorInternational（杰能科公司，美國）

（5）Solvay（蘇爾威公司，比利時(shí)）

（6）ClrHansen（漢森公司，丹麥）

（7）RhonePonlene（羅蘭，普朗克公司，法國）

（8）Quest（荷蘭）世界大型工具酶生產(chǎn)廠商：

（1）NovoNordisk2.1限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonucleases）：簡稱工具酶，是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶主要從原核生物中分離出來。僅II型限制型核酸內(nèi)切酶已有2000多種，可以識(shí)別200多個(gè)不同的DNA序列。2.1限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restricti2.1.1限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2.1.1.1細(xì)菌的限制—修飾作用1952年，Luria和Human，1953年，Bertani和Weigle發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的限制（restriction）現(xiàn)象：

E.colikPhageλ（k）

E.coliB『E.coliB限制λ（k）』感染不感染2.1.1限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2.1.1.1細(xì)菌的限制噬菌體侵染細(xì)菌噬菌體侵染細(xì)菌仍有少量phageλ(K)可在E.coliB中生存，是因?yàn)檫@些phage對自身進(jìn)行了修飾。大腸桿菌K大腸桿菌B普通的phageλ(K)修飾的phageλ(K)10-4（限制作用）11仍有少量phageλ(K)可在E.2.1.1.2R-M系統(tǒng)細(xì)菌中存在位點(diǎn)特異性限制酶和特異性甲基化酶，構(gòu)成了寄主控制的限制—修飾系統(tǒng)(R-MRestriction-modificationsystem)。R-M系統(tǒng)是細(xì)菌安內(nèi)御外的積極措施。細(xì)菌R-M系統(tǒng)的限制酶可以降解DNA，為避免自身DNA的降解，細(xì)菌可以修飾（甲基化酶）自身DNA，未被修飾的外來DNA則會(huì)被降解。個(gè)別噬菌體在被降解之前已經(jīng)發(fā)生了修飾，則可免予被降解。2.1.1.2R-M系統(tǒng)細(xì)菌中存在位點(diǎn)特異性限制酶和特異2.1.1.3限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1968Linn和Arber從E.coliB中發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅰ1970Smith（美）在流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對其功能研究的突出貢獻(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng)金限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）：在細(xì)胞內(nèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并對DNA分子進(jìn)行切割的一種酶。功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。2.1.1.3限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1968Linn和Arb2.1.2限制性核酸內(nèi)切酶的分類根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的限制修飾活性、相對分子量大小、酶蛋白結(jié)構(gòu)、切割位點(diǎn)及限制作用所需的輔助因子等，將限制性核酸內(nèi)切酶分為三類：I型酶，II型酶，III型酶。2.1.2限制性核酸內(nèi)切酶的分類根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的限制2.1.2限制性核酸內(nèi)切酶的分類特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制和修飾活性單一功能單一功能雙功能識(shí)別與切割位點(diǎn)分別，隨機(jī)切割，相距較遠(yuǎn)同一位點(diǎn)相距5-10bp對基因工程中意義無用非常有用意義不大2.1.2限制性核酸內(nèi)切酶的分類特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制和修飾EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號(hào)若種名頭2個(gè)字母相同則其中一個(gè)可用種名的第一和第三個(gè)字母。2.1.3限制性核酸內(nèi)切酶的命名EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株2.1.4限制性核酸內(nèi)切酶的活性單位50μLBuffer中，含1μg底物DNA，于最適反應(yīng)條件和溫度下，保溫1小時(shí)，能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即為一個(gè)酶單位，用U表示。buffer（pH=8.0）：50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或巰基乙醇100μgBSA/ml（DDT：二硫蘇糖醇BSA：牛血清蛋白）2.1.4限制性核酸內(nèi)切酶的活性單位50μLBuffer2.1.5限制性核酸內(nèi)切酶的切割特點(diǎn)在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。2個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對。斷裂結(jié)果形成的DNA片段，具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。2.1.5限制性核酸內(nèi)切酶的切割特點(diǎn)在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列絕大多數(shù)的Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶都能夠識(shí)別由4-8個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列。限制性核酸內(nèi)切酶就是從其識(shí)別序列內(nèi)切割DNA分子的，因此這些識(shí)別序列又叫核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)或靶序列。識(shí)別序列有連續(xù)的（如GATC）和間斷的(如GANTC)兩種，它們都呈回文結(jié)構(gòu)。ABCC’B’A’A’B’C’CBAA’B’N’

BAABN

B’A’或識(shí)別序列絕大多數(shù)的Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶都能夠識(shí)別由4-8個(gè)核EcoRⅠ5‘……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’不同核酸內(nèi)切酶的特異識(shí)別位點(diǎn)PstⅠ5’……C

TGCAG……3’3’……GACGTC...…5’EcoRⅠ5‘……GAATTC……AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位點(diǎn)核酸內(nèi)切酶HindⅢ對雙鏈DNA分子的切割作用AAGCTTTTCGAAA三種酶切末端平齊末端（如SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）5’粘性末端（如EcoRⅠ）3’粘性末端（如PstⅠ）

5’-GG--CC-3’

3’-CC--GG-5’

5’-GGCC-3’

3’-CCGG-5’

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

5’-G--AATTC-3’

3’-CTTAA--G-5’三種酶切末端平齊末端（如SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）5’同裂酶和同尾酶同裂酶：來源不同的限制酶識(shí)別相同的核苷酸靶序列。產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。如：HpaⅡ和MspⅠ均可切割CCGG。同尾酶：來源不同，識(shí)別的核苷酸靶序列也不相同，但切割后DNA分子產(chǎn)生的粘性末端相同的限制性核酸內(nèi)切酶。同裂酶和同尾酶同裂酶：來源不同的限制酶識(shí)別相同的核苷酸靶序列5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHⅠ5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’BclⅠ5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡBamHⅠBclⅠBglⅡ三種酶可產(chǎn)生相同的5’GATC粘性末端，由這種同尾酶產(chǎn)生的DNA片段可因粘性末端的互補(bǔ)而彼此再連接起來。5’-GGATCC-3’BamHⅠ5’-TGATCA-3’B星活性限制性內(nèi)切酶識(shí)別特異性放寬。

EcoRⅠ在正常情況下識(shí)別GAATTC序列發(fā)生切割，但如果緩沖液中甘油濃度超過5%，其識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生松動(dòng)，可在AATT處發(fā)生切割，EcoRⅠ這種特殊的識(shí)別能力叫做星活性，用EcoRⅠ*表示。星活性可造成位點(diǎn)切割機(jī)率不等，降解不完全。影響因素：甘油濃度12-20%，酶與DNA比例，離子強(qiáng)度，45%聚乙二醇(PEG)，有機(jī)溶劑，8%二甲基亞楓，二價(jià)陽離子，12%乙醇。星活性限制性內(nèi)切酶識(shí)別特異性放寬。2.1.7限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用重組DNA前的切割構(gòu)建新質(zhì)粒構(gòu)建物理圖譜DNA分子雜交用限制性內(nèi)切酶消化受體DNA制備DNA探針亞克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究2.1.7限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用重組DNA前的切割2.2甲基化酶(methylase)Ⅱ類R-M系統(tǒng)由限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶兩種酶分子組成。大多數(shù)限制酶都已分離出相應(yīng)的甲基化酶。甲基化酶也稱修飾酶(modificationenzyme)，用來修飾限制酶的識(shí)別序列，在該序列位點(diǎn)的胞嘧啶（C）5-氨基上加一個(gè)甲基，使得該序列可以被限制性內(nèi)切酶識(shí)別而免于切割。2.2甲基化酶(methylase)Ⅱ類R-M系統(tǒng)由限制性核甲基化酶分兩類：維持性甲基化酶：用于在新合成的DNA鏈上進(jìn)行甲基化的酶。甲基化位置與模板鏈上的相同。構(gòu)建性甲基化酶：用于在非甲基化的DNA鏈上進(jìn)行甲基化的酶。用甲基化酶進(jìn)行甲基化的作用封閉DNA鏈中的某些識(shí)別位點(diǎn)，保護(hù)多余的限制性酶切位點(diǎn)。構(gòu)建新的酶切位點(diǎn)甲基化酶分兩類：2.3DNA連接酶（ligase）能夠催化DNA中相鄰的3’-羥基和5’-磷酸基團(tuán)末端之間形成3′,5′-磷酸二酯鍵的酶。T4DNA連接酶：可連接帶匹配粘性末端的DNA分子，也可使平端的雙鏈DNA分子相互連接。大腸桿菌DNA連接酶：只能連接帶匹配粘末端的DNA分子。2.3DNA連接酶（ligase）能夠催化DNA中相鄰的32.3.1DNA連接酶作用特點(diǎn)DNA連接酶需要在一條DNA鏈的3’－末端具有游離羥基（－OH），另一條鏈5’－末端具有磷酸基（－P）時(shí)才可發(fā)揮作用。3’－OH和5’－P需彼此相鄰，且各自位于與互補(bǔ)鏈上互補(bǔ)堿基配對的兩個(gè)脫氧核苷酸末端。DNＡ連接酶不能連接單鏈DNA分子，只能連接雙螺旋DNA分子的一部分。2.3.1DNA連接酶作用特點(diǎn)DNA連接酶需要在一條DNADNA連接酶只能封閉失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈切口（nick），不能封閉失去一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸所形成的缺口（gap）。DNA連接酶反應(yīng)時(shí)需要能量（NAD＋或ATP）。切口：失去磷酸二酯鍵缺口：失去核苷酸5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’DNA連接酶只能封閉失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈切口（ni2.3.3基因工程常用連接酶2.3.3.1T4噬菌體DNA連接酶由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼，分子量68KD，需ATP?？梢赃B接互補(bǔ)的粘性末端。如：5’…ACGOHpAATTCGT…3’T4DNA連接酶3’…TGCTTAApHOGCA…5’Mg2＋，ATP5’…ACGAATTCGT…3’3’…TGCTTAAGCA…5反應(yīng)系統(tǒng)：ATP，Tris－HCl，MgCl2，DTE（二硫赤蘚糖醇），ATP，pH7.5，4～15℃2.3.3基因工程常用連接酶2.3.3.1T4噬菌體DN也可以連接兩條平起末端的DNA分子，但反應(yīng)速度較慢。5’…CGAOHPCGTA…3’T4DNA連接酶3’…GCTPHOGCAT…5’Mg2＋，ATP5’…CGACGTA…3’3’…GCTGCAT…5’可以實(shí)現(xiàn)分子間或分子內(nèi)連接。

也可以連接兩條平起末端的DNA分子，但反應(yīng)速度較慢。AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′5′5′5′(1)(2)AATTC······GG······CTTAAAATTC······G

G······CTTAA5′5′AATTC······GG······CTTAA5′5′(a)分子間連接(b)分子內(nèi)連接(1)(2)ATGCTATAGCTAT4連接酶T4連接酶AATTC······GG······2.3.3.2大腸桿菌DNA連接酶只催化有匹配粘性末端的DNA分子需有NAD＋（氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）做能源輔助因子。反應(yīng)緩沖體系：Tris－HCl，MgCl2，EDTA，DTE（二硫赤蘚糖醇），NAD，BSA，pH8.0，4－15℃。2.3.3.2大腸桿菌DNA連接酶2.4DNA聚合酶（DNApolymerase）定義：在DNA(或RNA)模板指導(dǎo)下，以4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）為底物，在引物3’-OH末端聚合DNA鏈的一類酶。DNA聚合酶在DNA復(fù)制時(shí)起關(guān)鍵作用。DNA聚合酶主要有三類：聚合酶Ⅰ(polⅠ)、聚合酶Ⅱ(polⅡ)，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其中聚合酶Ⅰ參與DNA修復(fù)，聚合酶Ⅲ參與DNA復(fù)制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。2.4DNA聚合酶（DNApolymerase）定義：在DDNA聚合酶Ⅰ在DNA復(fù)制過程中的作用DNA聚合酶Ⅰ在DNA復(fù)制過程中的作用DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的比較DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的比較

主要的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(全酶)Klenow片段T４DNA聚合酶(T４Phage感染的E.coli)修飾的T７DNA聚合酶(測序酶)TaqDNA聚合酶(耐熱)反轉(zhuǎn)錄酶主要的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(全酶)2.4.1大腸桿菌DNA聚合酶I有大腸桿菌polA基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，MW=109，000D，約有1000個(gè)氨基酸，分子中含有一個(gè)雙硫鍵，一個(gè)硫氫鍵，還含有鋅離子，橢圓型結(jié)構(gòu)。2.4.1大腸桿菌DNA聚合酶I有大腸桿菌polA基因編碼2.4.1.1DNA聚合酶I催化合成DNA互補(bǔ)鏈的條件：（1）四種脫氧核苷酸dNTPs和Mg2＋離子；（2）帶有3’－OH游離基團(tuán)的引物；（3）單鏈或雙鏈模板(DNA或RNA)；2.4.1.2DNA聚合酶I具有三種酶活性：（1）5′→3′聚合酶活性；（2）5′→3′外切酶活性；（3）3′→5′外切外切酶活性。2.4.1.1DNA聚合酶I催化合成DNA互補(bǔ)鏈的條件：（1）5′→3′聚合酶活性：

以單鏈DNA為模板，在DNA引物3’-OH末端聚合上脫氧核苷三磷酸。CCG3’GGCTATCGGE.coliDNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG（1）5′→3′聚合酶活性：CCG（2）5′→3′外切酶活性

以雙鏈DNA或RNA和DNA雜交體為底物，從5’端降解雙鏈DNA或RNA和DNA雜交體的RNA部分。只對DNA配對部分即雙鏈的磷酸二酯鍵有切割作用。

GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coliDNApolIMg2++pC，pT5′（2）5′→3′外切酶活性GATAGCCTCG（3）3′→5′外切酶活性從3’－OH端降解DNA。TCGATAGCCAGCTATE.coliDNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG5′TCGATAAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coliDNApolIMg2++pC，pG，pA5′（3）3′→5′外切酶活性TCGATAGCCE.coli2.4.1.3DNA的切口平移（nicktranslation）

DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要用途是通過DNA切口平移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針。此時(shí)，DNA聚合酶Ⅰ的5’-3’核酸外切酶活性和5’-3’聚合酶活性同時(shí)發(fā)生。5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘-3’外切酶活性5‘-3’聚合酶活性5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘3’5‘↓3’3‘5’未經(jīng)標(biāo)記的核苷酸經(jīng)標(biāo)記的核苷酸2.4.1.3DNA的切口平移（nicktranslat2.4.1.4DNA雜交探針的制備5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’********(a)(b)(c)(d)(e)(a)雙鏈的DNA分子(b)帶有3’-OH末端的單鏈缺口(c)polⅠ從5‘-P移去一個(gè)核苷酸(d)polⅠ將32P標(biāo)記的核苷酸參入取代被移去的核苷酸(e)重復(fù)(c)(d)的步驟，缺口沿5’-3‘方向移動(dòng)，形成32P標(biāo)記的核苷酸合成的DNA鏈2.4.1.4DNA雜交探針的制備5‘3‘5‘3‘5‘3探針（probe）探針：用來探知被測物存在的小DNA或RNA叫做探針。標(biāo)記物：探針上結(jié)合有易被檢測的化合物稱為標(biāo)記物。分子雜交：探針DNA或RNA與被測物的互補(bǔ)結(jié)合叫做分子雜交（molecularhybridization）探針（probe）探針：用來探知被測物存在的小DNA或RNA2.4.2Klenow來源：

E.coliDNAPolymeraseⅠ經(jīng)蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.1970DNApolⅠ枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶C端(76kd)+N端（36kd）

Klenow5’→3’聚合3’→5’外切5’→3’外切2.4.2Klenow來源：DNApolⅠ枯草桿菌蛋白酶或Klenow用途填補(bǔ)限制酶的5′-粘性末端為平齊末端3′-末端標(biāo)記Klenow在無底物時(shí)只進(jìn)行3′→5′外切；有底物存在時(shí)則聚合?？捎肹32P]dNTP對3’凹端進(jìn)行標(biāo)記。在cDNA克隆中，合成cDNA第二條鏈應(yīng)用Sanger雙脫氧法進(jìn)行DNA測序。

5’…CC3’…GGAATT5’…CCTTAA3’3’…GGAATT5’KlenowKlenow用途5’…CC5’…CCTTAA3’Klenow2.4.3Taq

DNA聚合酶(Thermusaqraticus)來源：從耐熱細(xì)胞中純化，已有基因工程酶多種結(jié)構(gòu)：單亞基MW=94000d。活性：聚合最適溫度為75-80℃，不具3′→5′外切酶活性，具5′→3′外切活性。用途：PCR反應(yīng)。測序，高溫下進(jìn)行DNA合成可減少模板二級結(jié)構(gòu)。2.4.3TaqDNA聚合酶(Thermusaqrat2.4.7反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）定義：以RNA為模板合成DNA的DNA聚合酶。用途：（1）逆轉(zhuǎn)錄；（2）對RNA:DNA雜交體中的RNA特異性地降解，免除了在反轉(zhuǎn)錄完成后再用NaOH降解RNA模板的步驟。2.4.7反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscripta2.5末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)：MW=60，000d.活性（1）催化dNTP摻入DNA3′-OH末端。當(dāng)反應(yīng)混合物中只有一種dNTP時(shí)，可以形成同聚物尾。（2）反應(yīng)不需模板DNA，需Co2+用途：克隆DNA片段時(shí)加上互補(bǔ)同聚物末端，便于與載體連接。末端標(biāo)記2.5末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)：MW=60，000d.2.6磷酸酶和磷酸激酶磷酸酶：催化核酸分子脫掉5’磷酸基團(tuán)，將5’－P末端轉(zhuǎn)化為5’－OH。磷酸激酶：催化γ－磷酸從ATP分子轉(zhuǎn)移到DNA或RNA分子的5’—OH末端。PNKasePMase

5′HOATTAGC………CCGTAATCG………GGCOH5′多核苷酸激酶磷酸酶

5′pATTAGC………CCGTAATCG………GGCp5′2.6磷酸酶和磷酸激酶磷酸酶：催化核酸分子脫掉5’磷酸基團(tuán)，2.7單鏈核酸內(nèi)切酶（nuclease）Bal31核酸酶（1）從DNA末端同時(shí)降解兩條鏈。（2）用于基因表達(dá)調(diào)控序列的研究。S1核酸酶（1）降解單鏈核酸。（2）用于把具粘性末端的DNA變?yōu)槠烬R末端的DNA。（3）在DNA部分變性條件下，能在富含AT區(qū)切斷DNA。（4）打開在從mRNA合成雙鏈cDNA時(shí)產(chǎn)生的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。2.7單鏈核酸內(nèi)切酶（nuclease）Bal31核酸酶2.8核酶（ribozyme）具有酶活性的RNA片段。是真核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的內(nèi)含子本身含有的前導(dǎo)序列，能在離體條件下特異地催化內(nèi)含子剪切。1981Cech和Altman首次發(fā)現(xiàn)，并因此獲得1989年的諾貝爾獎(jiǎng)。核酶可以作為RNA的限制性內(nèi)切酶用于基因操作。2.8核酶（ribozyme）具有酶活性的RNA片段。2基因工程常用工具酶2基因工程常用工具酶基因工程的重要特點(diǎn)之一是在體外實(shí)行DNA分子的切割和重新連接。因此，工具酶是DNA體外操作必不可少的工具。取得編碼某種藥物的目的基因，大多需要工具酶－限制性核酸內(nèi)切酶將目的基因與載體DNA連接在一起，也需要工具酶－DNA連接酶。目前，許多廠商都在生產(chǎn)各種優(yōu)質(zhì)工具酶，簡化了分子克隆操作，拓寬了基因工程的研究領(lǐng)域?；蚬こ痰闹匾攸c(diǎn)之一是在體外實(shí)行DNA分子的切割和重新連接世界大型工具酶生產(chǎn)廠商：

（1）NovoNordisk（諾和諾德公司，丹麥）

（2）GistBroccdes（荷蘭）

（3）Cultot（科特公司，芬蘭）

（4）GenencorInternational（杰能科公司，美國）

（5）Solvay（蘇爾威公司，比利時(shí)）

（6）ClrHansen（漢森公司，丹麥）

（7）RhonePonlene（羅蘭，普朗克公司，法國）

（8）Quest（荷蘭）世界大型工具酶生產(chǎn)廠商：

（1）NovoNordisk2.1限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonucleases）：簡稱工具酶，是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶主要從原核生物中分離出來。僅II型限制型核酸內(nèi)切酶已有2000多種，可以識(shí)別200多個(gè)不同的DNA序列。2.1限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restricti2.1.1限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2.1.1.1細(xì)菌的限制—修飾作用1952年，Luria和Human，1953年，Bertani和Weigle發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的限制（restriction）現(xiàn)象：

E.colikPhageλ（k）

E.coliB『E.coliB限制λ（k）』感染不感染2.1.1限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2.1.1.1細(xì)菌的限制噬菌體侵染細(xì)菌噬菌體侵染細(xì)菌仍有少量phageλ(K)可在E.coliB中生存，是因?yàn)檫@些phage對自身進(jìn)行了修飾。大腸桿菌K大腸桿菌B普通的phageλ(K)修飾的phageλ(K)10-4（限制作用）11仍有少量phageλ(K)可在E.2.1.1.2R-M系統(tǒng)細(xì)菌中存在位點(diǎn)特異性限制酶和特異性甲基化酶，構(gòu)成了寄主控制的限制—修飾系統(tǒng)(R-MRestriction-modificationsystem)。R-M系統(tǒng)是細(xì)菌安內(nèi)御外的積極措施。細(xì)菌R-M系統(tǒng)的限制酶可以降解DNA，為避免自身DNA的降解，細(xì)菌可以修飾（甲基化酶）自身DNA，未被修飾的外來DNA則會(huì)被降解。個(gè)別噬菌體在被降解之前已經(jīng)發(fā)生了修飾，則可免予被降解。2.1.1.2R-M系統(tǒng)細(xì)菌中存在位點(diǎn)特異性限制酶和特異2.1.1.3限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1968Linn和Arber從E.coliB中發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅰ1970Smith（美）在流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對其功能研究的突出貢獻(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng)金限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）：在細(xì)胞內(nèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并對DNA分子進(jìn)行切割的一種酶。功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。2.1.1.3限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1968Linn和Arb2.1.2限制性核酸內(nèi)切酶的分類根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的限制修飾活性、相對分子量大小、酶蛋白結(jié)構(gòu)、切割位點(diǎn)及限制作用所需的輔助因子等，將限制性核酸內(nèi)切酶分為三類：I型酶，II型酶，III型酶。2.1.2限制性核酸內(nèi)切酶的分類根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的限制2.1.2限制性核酸內(nèi)切酶的分類特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制和修飾活性單一功能單一功能雙功能識(shí)別與切割位點(diǎn)分別，隨機(jī)切割，相距較遠(yuǎn)同一位點(diǎn)相距5-10bp對基因工程中意義無用非常有用意義不大2.1.2限制性核酸內(nèi)切酶的分類特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制和修飾EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號(hào)若種名頭2個(gè)字母相同則其中一個(gè)可用種名的第一和第三個(gè)字母。2.1.3限制性核酸內(nèi)切酶的命名EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株2.1.4限制性核酸內(nèi)切酶的活性單位50μLBuffer中，含1μg底物DNA，于最適反應(yīng)條件和溫度下，保溫1小時(shí)，能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即為一個(gè)酶單位，用U表示。buffer（pH=8.0）：50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或巰基乙醇100μgBSA/ml（DDT：二硫蘇糖醇BSA：牛血清蛋白）2.1.4限制性核酸內(nèi)切酶的活性單位50μLBuffer2.1.5限制性核酸內(nèi)切酶的切割特點(diǎn)在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。2個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對。斷裂結(jié)果形成的DNA片段，具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。2.1.5限制性核酸內(nèi)切酶的切割特點(diǎn)在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列絕大多數(shù)的Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶都能夠識(shí)別由4-8個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列。限制性核酸內(nèi)切酶就是從其識(shí)別序列內(nèi)切割DNA分子的，因此這些識(shí)別序列又叫核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)或靶序列。識(shí)別序列有連續(xù)的（如GATC）和間斷的(如GANTC)兩種，它們都呈回文結(jié)構(gòu)。ABCC’B’A’A’B’C’CBAA’B’N’

BAABN

B’A’或識(shí)別序列絕大多數(shù)的Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶都能夠識(shí)別由4-8個(gè)核EcoRⅠ5‘……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’不同核酸內(nèi)切酶的特異識(shí)別位點(diǎn)PstⅠ5’……C

TGCAG……3’3’……GACGTC...…5’EcoRⅠ5‘……GAATTC……AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位點(diǎn)核酸內(nèi)切酶HindⅢ對雙鏈DNA分子的切割作用AAGCTTTTCGAAA三種酶切末端平齊末端（如SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）5’粘性末端（如EcoRⅠ）3’粘性末端（如PstⅠ）

5’-GG--CC-3’

3’-CC--GG-5’

5’-GGCC-3’

3’-CCGG-5’

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

5’-G--AATTC-3’

3’-CTTAA--G-5’三種酶切末端平齊末端（如SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）5’同裂酶和同尾酶同裂酶：來源不同的限制酶識(shí)別相同的核苷酸靶序列。產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。如：HpaⅡ和MspⅠ均可切割CCGG。同尾酶：來源不同，識(shí)別的核苷酸靶序列也不相同，但切割后DNA分子產(chǎn)生的粘性末端相同的限制性核酸內(nèi)切酶。同裂酶和同尾酶同裂酶：來源不同的限制酶識(shí)別相同的核苷酸靶序列5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHⅠ5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’BclⅠ5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡBamHⅠBclⅠBglⅡ三種酶可產(chǎn)生相同的5’GATC粘性末端，由這種同尾酶產(chǎn)生的DNA片段可因粘性末端的互補(bǔ)而彼此再連接起來。5’-GGATCC-3’BamHⅠ5’-TGATCA-3’B星活性限制性內(nèi)切酶識(shí)別特異性放寬。

EcoRⅠ在正常情況下識(shí)別GAATTC序列發(fā)生切割，但如果緩沖液中甘油濃度超過5%，其識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生松動(dòng)，可在AATT處發(fā)生切割，EcoRⅠ這種特殊的識(shí)別能力叫做星活性，用EcoRⅠ*表示。星活性可造成位點(diǎn)切割機(jī)率不等，降解不完全。影響因素：甘油濃度12-20%，酶與DNA比例，離子強(qiáng)度，45%聚乙二醇(PEG)，有機(jī)溶劑，8%二甲基亞楓，二價(jià)陽離子，12%乙醇。星活性限制性內(nèi)切酶識(shí)別特異性放寬。2.1.7限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用重組DNA前的切割構(gòu)建新質(zhì)粒構(gòu)建物理圖譜DNA分子雜交用限制性內(nèi)切酶消化受體DNA制備DNA探針亞克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究2.1.7限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用重組DNA前的切割2.2甲基化酶(methylase)Ⅱ類R-M系統(tǒng)由限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶兩種酶分子組成。大多數(shù)限制酶都已分離出相應(yīng)的甲基化酶。甲基化酶也稱修飾酶(modificationenzyme)，用來修飾限制酶的識(shí)別序列，在該序列位點(diǎn)的胞嘧啶（C）5-氨基上加一個(gè)甲基，使得該序列可以被限制性內(nèi)切酶識(shí)別而免于切割。2.2甲基化酶(methylase)Ⅱ類R-M系統(tǒng)由限制性核甲基化酶分兩類：維持性甲基化酶：用于在新合成的DNA鏈上進(jìn)行甲基化的酶。甲基化位置與模板鏈上的相同。構(gòu)建性甲基化酶：用于在非甲基化的DNA鏈上進(jìn)行甲基化的酶。用甲基化酶進(jìn)行甲基化的作用封閉DNA鏈中的某些識(shí)別位點(diǎn)，保護(hù)多余的限制性酶切位點(diǎn)。構(gòu)建新的酶切位點(diǎn)甲基化酶分兩類：2.3DNA連接酶（ligase）能夠催化DNA中相鄰的3’-羥基和5’-磷酸基團(tuán)末端之間形成3′,5′-磷酸二酯鍵的酶。T4DNA連接酶：可連接帶匹配粘性末端的DNA分子，也可使平端的雙鏈DNA分子相互連接。大腸桿菌DNA連接酶：只能連接帶匹配粘末端的DNA分子。2.3DNA連接酶（ligase）能夠催化DNA中相鄰的32.3.1DNA連接酶作用特點(diǎn)DNA連接酶需要在一條DNA鏈的3’－末端具有游離羥基（－OH），另一條鏈5’－末端具有磷酸基（－P）時(shí)才可發(fā)揮作用。3’－OH和5’－P需彼此相鄰，且各自位于與互補(bǔ)鏈上互補(bǔ)堿基配對的兩個(gè)脫氧核苷酸末端。DNＡ連接酶不能連接單鏈DNA分子，只能連接雙螺旋DNA分子的一部分。2.3.1DNA連接酶作用特點(diǎn)DNA連接酶需要在一條DNADNA連接酶只能封閉失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈切口（nick），不能封閉失去一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸所形成的缺口（gap）。DNA連接酶反應(yīng)時(shí)需要能量（NAD＋或ATP）。切口：失去磷酸二酯鍵缺口：失去核苷酸5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’DNA連接酶只能封閉失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈切口（ni2.3.3基因工程常用連接酶2.3.3.1T4噬菌體DNA連接酶由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼，分子量68KD，需ATP?？梢赃B接互補(bǔ)的粘性末端。如：5’…ACGOHpAATTCGT…3’T4DNA連接酶3’…TGCTTAApHOGCA…5’Mg2＋，ATP5’…ACGAATTCGT…3’3’…TGCTTAAGCA…5反應(yīng)系統(tǒng)：ATP，Tris－HCl，MgCl2，DTE（二硫赤蘚糖醇），ATP，pH7.5，4～15℃2.3.3基因工程常用連接酶2.3.3.1T4噬菌體DN也可以連接兩條平起末端的DNA分子，但反應(yīng)速度較慢。5’…CGAOHPCGTA…3’T4DNA連接酶3’…GCTPHOGCAT…5’Mg2＋，ATP5’…CGACGTA…3’3’…GCTGCAT…5’可以實(shí)現(xiàn)分子間或分子內(nèi)連接。

也可以連接兩條平起末端的DNA分子，但反應(yīng)速度較慢。AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′5′5′5′(1)(2)AATTC······GG······CTTAAAATTC······G

G······CTTAA5′5′AATTC······GG······CTTAA5′5′(a)分子間連接(b)分子內(nèi)連接(1)(2)ATGCTATAGCTAT4連接酶T4連接酶AATTC······GG······2.3.3.2大腸桿菌DNA連接酶只催化有匹配粘性末端的DNA分子需有NAD＋（氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）做能源輔助因子。反應(yīng)緩沖體系：Tris－HCl，MgCl2，EDTA，DTE（二硫赤蘚糖醇），NAD，BSA，pH8.0，4－15℃。2.3.3.2大腸桿菌DNA連接酶2.4DNA聚合酶（DNApolymerase）定義：在DNA(或RNA)模板指導(dǎo)下，以4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）為底物，在引物3’-OH末端聚合DNA鏈的一類酶。DNA聚合酶在DNA復(fù)制時(shí)起關(guān)鍵作用。DNA聚合酶主要有三類：聚合酶Ⅰ(polⅠ)、聚合酶Ⅱ(polⅡ)，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其中聚合酶Ⅰ參與DNA修復(fù)，聚合酶Ⅲ參與DNA復(fù)制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。2.4DNA聚合酶（DNApolymerase）定義：在DDNA聚合酶Ⅰ在DNA復(fù)制過程中的作用DNA聚合酶Ⅰ在DNA復(fù)制過程中的作用DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的比較DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的比較

主要的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(全酶)Klenow片段T４DNA聚合酶(T４Phage感染的E.coli)修飾的T７DNA聚合酶(測序酶)TaqDNA聚合酶(耐熱)反轉(zhuǎn)錄酶主要的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(全酶)2.4.1大腸桿菌DNA聚合酶I有大腸桿菌polA基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，MW=109，000D，約有1000個(gè)氨基酸，分子中含有一個(gè)雙硫鍵，一個(gè)硫氫鍵，還含有鋅離子，橢圓型結(jié)構(gòu)。2.4.1大腸桿菌DNA聚合酶I有大腸桿菌polA基因編碼2.4.1.1DNA聚合酶I催化合成DNA互補(bǔ)鏈的條件：（1）四種脫氧核苷酸dNTPs和Mg2＋離子；（2）帶有3’－OH游離基團(tuán)的引物；（3）單鏈或雙鏈模板(DNA或RNA)；2.4.1.2DNA聚合酶I具有三種酶活性：（1）5′→3′聚合酶活性；（2）5′→3′外切酶活性；（3）3′→5′外切外切酶活性。2.4.1.1DNA聚合酶I催化合成DNA互補(bǔ)鏈的條件：（1）5′→3′聚合酶活性：

以單鏈DNA為模板，在DNA引物3’-OH末端聚合上脫氧核苷三磷酸。CCG3’GGCTATCGGE.coliDNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG（1）5′→3′聚合酶活性：CCG（2）5′→3′外切酶活性

以雙鏈DNA或RNA和DNA雜交體為底物，從5’端降解雙鏈DNA或RNA和DNA雜交體的RNA部分。只對DNA配對部分即雙鏈的磷酸二酯鍵有切割作用。

GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coliDNApolIMg2++pC，pT5′（2）5′→3′外切酶活性GATAGCCTCG（3）3′→5′外切酶活性從3’－OH端降解DNA。TCGATAGCCAGCTATE.coliDNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG5′TCGATAAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coliDNApolIMg2++pC，pG，pA5′（3）3′→5′外切酶活性TCGATAGCCE.coli2.4.1.3DNA的切口平移（nicktranslation）

DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要用途是通過DNA切口平移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針。此時(shí)，DNA聚合酶Ⅰ的5’-3’核酸外切酶活性和5’-3’聚合酶活性同時(shí)發(fā)生。5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘-3’外切酶活性5‘-3’聚合酶活性5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘3’5‘↓3’3‘5’未經(jīng)標(biāo)記的核苷酸經(jīng)標(biāo)記的核苷酸2.4.1.3DNA的切口平移（nicktranslat2.4.1.4DNA雜交探針的制備5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’********(a)(b)(c