蛋白質(zhì)科學進展

一、名詞解釋NMR：即核磁共振，由于具有磁矩（描述載流線圈或微觀粒子磁性的物理量m=iSn）的原子核在高強度磁場的作用下，可吸收適宜頻率的電磁輻射，而不同分子中原子核的化學環(huán)境不同，將會有不同的共振頻率，產(chǎn)生不同的共振譜。記錄這種波譜即可判斷該原子在分子中所處的相對位置及相對數(shù)目，用于定量分析及分子量的測定，并對有機化合物進行結構分析。X-raydiffraction:根據(jù)X射線穿過物質(zhì)的晶格時所產(chǎn)生的衍射特征，鑒定物質(zhì)成分與結構的方法。利用晶體對X射線的衍射效應，研究晶體的內(nèi)部結構，最終確定出不同的或相同的原子在晶胞內(nèi)的位置（即原子的排列方式）。affinitychromatography：是利用生物大分子與某些相對應的專一分子特異識別和可逆結合的特性而建立起來的一種分離生物大分子的層析方法。親和層析是分離蛋白質(zhì)的一種及有效的方法。isoelectricpoint：兩性離子所帶電荷因溶液的pH值不同而改變，當兩性離子正負電荷數(shù)值相等時,溶液的pH值即其等電點.Denovoproteindesign:所謂蛋白質(zhì)從頭設計就是給定一個目標三維結構，要求找出與已知順序無明顯同源，能折疊成目標結構的氨基酸順序來。蛋白質(zhì)從頭設計與蛋白質(zhì)結構預測恰恰相反，后者是從順序出發(fā)，預測其所折疊成的三維結構。Homology皿。~目而9：是目前最為成功且實用的蛋白質(zhì)結構預測方法，它的前提是已知一個或多個同源蛋白質(zhì)的結構。當兩個蛋白質(zhì)的序列同源性高于35%，一般情況下認為他們的三維結構基本相同.FRET:熒光能量共振轉移是距離很近的兩個熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉移現(xiàn)象。當供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射性的能量轉移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強BRET:即生物發(fā)光共振能量轉移，是建立在非輻射能量轉移的基礎上，當一個發(fā)光酶供體的發(fā)射光譜和熒光受體的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生BRET現(xiàn)象。二、簡答.簡述FRET的工作原理及應用范圍。原理：熒光能量共振轉移是距離很近的兩個熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉移現(xiàn)象。當供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射性的能量轉移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強。應用范圍；在生命科學領域，F(xiàn)RET技術是檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具，可用于檢測某一細胞中兩個蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用。.簡述常用的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)及其優(yōu)劣勢。蛋白表達系統(tǒng)是指由宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系。通過這個體系可以實現(xiàn)外源基因在宿主中表達的目的。一般由以下幾個部分組成：1、宿主。表達蛋白的生物體?？梢詾榧毦?、酵母、植物細胞、動物細胞等。由于各種生物的特性不同，適合表達蛋白的種類也不相同。2、載體。載體的種類與宿主相匹配。根據(jù)宿主不同，分為原核（細菌）表達載體、酵母表達載體、植物表達載體、哺乳動物表達載體、昆蟲表達載體等。載體中含有外源基因片段。通過載體介導，外源基因可以在宿主中表達。3、輔助成分。有的表達系統(tǒng)中還包括了協(xié)助載體進入宿主的輔助成分。比如昆蟲-桿狀病毒表達體系中的桿狀病毒。優(yōu)劣勢：原核蛋白表達系統(tǒng)既是最常用的表達系統(tǒng)，也是最經(jīng)濟實惠的蛋白表達系統(tǒng)。原核蛋白表達系統(tǒng)以大腸桿菌表達系統(tǒng)為代表，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高和表達產(chǎn)物分離純化相對簡單等優(yōu)點，缺點主要是蛋白質(zhì)翻譯后缺乏加工機制，如二硫鍵的形成、蛋白糖基化和正確折疊，得到具有生物活性的蛋白的幾率較小。酵母蛋白表達系統(tǒng)以甲醇畢赤酵母為代表，具有表達量高，可誘導，糖基化機制接近高等真核生物，分泌蛋白易純化，易實現(xiàn)高密發(fā)酵等優(yōu)點。缺點為部分蛋白產(chǎn)物易降解，表達量不可控。哺乳動物細胞和昆蟲細胞表達系統(tǒng)主要優(yōu)點是蛋白翻譯后加工機制最接近體內(nèi)的天然形式，最容易保留生物活性，缺點是表達量通常較低，穩(wěn)定細胞系建立技術難度大，生產(chǎn)成本高。3.簡述利用計算機進行蛋白質(zhì)三維結構預測的常用方法。傳統(tǒng)上蛋白質(zhì)三維結構預測分為同源模建、折疊識別和從頭模擬等方法。同源建模是在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中尋找序列相似的蛋白質(zhì)，以找到的蛋白質(zhì)為模板，構建待測蛋白質(zhì)結構模型。同源建?；趦蓚€原理。第一，一個蛋白質(zhì)的結構由其氨基酸序列唯一決定，知道其一級序列，在理論上就可以獲取其二級結構以及三級結構。第二，蛋白質(zhì)的三級結構在進化中更穩(wěn)定或者說更保守。折疊識別：以結構已知的蛋白質(zhì)的折疊子為模板，尋找給定氨基酸序列可能采取的折疊類型，即折疊識別。某些蛋白質(zhì)在結構已知的數(shù)據(jù)庫中找不到序列同源性大于30%的同源蛋白質(zhì)，但是許多序列同源性很差(小于25%)的蛋白質(zhì)卻存在相同的框架結構-折疊子(folds).此時折疊識別方法得到了成功的應用無論是同源模建還是折疊識別都需要已知的蛋白質(zhì)結構作為模板。而從頭模擬是指不直接依賴相似結構信息而只從氨基酸一級序列中通過生物計算給出高級模型的方法。.簡述超分辨率顯微鏡的工作原理。超分辨顯微鏡是多種超越衍射極限技術的統(tǒng)稱，大多達到納米尺度。⑴SIM：StructuredIlluminationMicroscopy，結構化照明顯微鏡⑵STED：StimulatedEmissionDepletionMicroscopy，受激發(fā)射耗盡顯微鏡⑶PALM/STORM/GSDIM：Photo-ActivatedLocalizationMicroscopy/STochasticOpticalReconstructionMicroscopy/GroundStateDepletionmicroscopyfollowedbyIndividualMoleculereturn，光活化定位顯微鏡/隨機光學重構顯微鏡/基態(tài)耗盡顯微鏡⑷RESOLFT：ReversibleSaturableOpticalLinearFluorescenceTransition，可逆飽和熒光躍遷顯微鏡⑸SSIM：SaturatedStructuredIlluminationMicroscopy，飽和結構化照明顯微鏡⑹CSREM/CLEM:CorrelativeSuperResolutionopticalandElectron⑺Microscopy/CorrelativeLightandElectronMicroscopy,互關聯(lián)超分辨光學和電子顯微鏡SIM，互結構光照明熒光顯微鏡是基于常規(guī)熒光顯微鏡，通過對其照明方式的改進，以特定結構光成像，從現(xiàn)突破衍射極限，獲得高分辨率樣品信息，進而由傅里葉變換獲得樣品顯微圖像的一種光學顯微鏡關聯(lián)光學和電子顯微鏡。STED顯微術中，有效熒光發(fā)光面積的減小是通過受激發(fā)射效應來實現(xiàn)的。一個典型的STED顯微系統(tǒng)中需要兩束照明光，其中一束為激發(fā)光，另外一束為損耗光。當激發(fā)光的照射使得其衍射斑范圍內(nèi)的熒光分子被激發(fā)，其中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)后，損耗光使得部分處于激發(fā)光斑外圍的電子以受激發(fā)射的方式回到基態(tài)，其余位于激發(fā)光斑中心的被激發(fā)電子則不受損耗光的影響，繼續(xù)以自發(fā)熒光的方式回到基態(tài)由于在受激發(fā)射過程中所發(fā)出的熒光和自發(fā)熒光的波長及傳播方向均不同，因此真正被探測器所接受到的光子均是由位于激發(fā)光斑中心部分的熒光樣品通過自發(fā)熒光方式產(chǎn)生的。由此，有效熒光的發(fā)光面積得以減小，從而.簡述冷凍電鏡的工作原理及其應用范圍。原理：樣品經(jīng)過在液氮中的冷凍固定，使得生物大分子中的水分子以玻璃態(tài)的形式存在，保持低溫，將樣品放入顯微鏡，高度相干的電子作為光源從上面照射下來，透過樣品和附近的水層，受到散射，利用探測器和透射系統(tǒng)把散射的信號成像記錄下來，再進行信號處理，最后利用三維重構的技術得到樣品的結構。應用范圍：a。研究那些不適合于應用X-射線晶體學和核磁共振波譜學的分子及其聚合物的結構％研究生物大分子處于不同功能狀態(tài)時的結構C。為X-射線晶體學結構解析提供初始分子置換模型及初始相位D。研究生物大分子復合物的結構￡。研究細胞器甚至是活細胞的結構.簡述親和層析的原理。親和層析是應用生物高分子與配基可逆結合的原理，將配基通過共價鍵牢固結合于載體上而制得的層析系統(tǒng).生物體中許多大分子化合物具有與其結構相對應的專一分子可逆結合的特性，如抗原與抗體，酶與底物或抑制劑，激素與受體等，這種結合往往是專一的而且是可逆的，生物分子間的這種結合力稱為親和力，親和層析的分離原理簡單地說就是通過將具有親和力的兩個分子中的一個固定在不溶性的基質(zhì)（也稱載體）上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進行分離純化。被固定在基質(zhì)上的分子稱為配體，配體與基質(zhì)共價結合，構成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑，蛋白質(zhì)的生物特異性可以幫助選擇特異性的配體，一般是目的蛋白質(zhì)與配體結合而不吸附雜質(zhì)。蛋白質(zhì)吸附后再利用洗脫液的快速變換和加入競爭劑的方法進行洗脫。.簡述點突變技術在蛋白質(zhì)結構研究中的應用和意義。點突變指只有一個堿基對發(fā)生改變。廣義點突變可以是堿基替換，單堿基插入或堿基缺失；狹義點突變也稱作單堿基替換。堿基替換又分為轉換和顛換兩類。點突變具有很高的回復突變率定點突變是指通過聚合酶鏈式反應（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。包括單點突變和多點突變，有的時候研究可能需要多個位點的定點突變，比如改造酶的活性或者動力學特性，研究蛋白之間的相互作用位點等。定點突變法的應用不僅廣泛用于基因工程技術領域，還可用于農(nóng)業(yè)培育抗蟲、抗病的良種，用于醫(yī)學矯正遺傳病、治療癌癥等病。點飽和突變（siteOsaturationmutagenesis）是通過對目的蛋白的編碼基因進行改造，短時間內(nèi)獲取靶位點氨基酸分別被其它19種天然氨基酸所替代的突變子。常用點飽和突變技術：寡核甘酸定向誘變盒式誘變基于PCR的點飽和突變利用點飽和突變技術鑒定蛋白質(zhì)功能位點［3］，提高酶比活力［4］,改善酶熱穩(wěn)定性［5］、底物結合特異性［6］及立體異構特異性［7］等多方面性質(zhì)。.簡述X光衍射分析蛋白質(zhì)三維結構的原理及其應用。原理：X光衍射分析所依賴的基本原理是X衍射現(xiàn)象。X衍射現(xiàn)象利用X射線的波長和晶體中原子的大小及原子間距同數(shù)量級的特性來分析蛋白質(zhì)結構。當X射線入射到樣品晶體分子上時，分子上的每個原子使X射線發(fā)生散射，這些散射波之間相互疊加形成衍射圖形。衍射圖形能給出樣品內(nèi)部結構的許多資料，如原子間的距離、鍵角，分子的立體結構等等。應用：物相分析、點陣常數(shù)的精確測定、應力的測定、晶粒尺寸和點陣畸變的測定、單晶取向和多晶織構測定。.簡述近年來蛋白質(zhì)結晶方法的主要進展。蛋白質(zhì)結晶即蛋白質(zhì)分子從過飽和的溶液中析出形成晶體。結晶的過程是蛋白質(zhì)分子相變的過程。分為晶核形成和晶體生長兩個階段。伴隨著晶核的形成，溶液中蛋白質(zhì)的濃度逐漸降低，推動體系向相對穩(wěn)定的區(qū)域轉變.該區(qū)域晶體長大而晶核數(shù)量不再增加。晶核可以由均相成核或非均相成核兩種過程形成。均相成核是指在大體積過飽和體系中自然形成晶核，體系各部分成核的幾率相同。非均相成核是指晶核優(yōu)先形成在外來粒子或器壁上。晶體生長可分為兩個階段，首先是處于過飽和臨界點的溶液體系中溶質(zhì)分子聚集在一起，其次是從無序集群到有序結構的重組過程。⑴傳統(tǒng)結晶方法：蒸汽擴散法中，將蛋白質(zhì)和結晶因子的混合液滴放置在含高濃度鹽或其他非揮發(fā)性沉淀劑的容器中，液滴與池液處于動態(tài)平衡的體系中。結晶溶液中的水或有機溶劑等揮發(fā)性物質(zhì)因蒸汽壓差別緩慢進入池液中，這種擴散導致待結晶液滴濃縮，從而使溶液達到滿足蛋白質(zhì)晶核形成的過飽和狀態(tài)。批量結晶的目標蛋白質(zhì)和結晶因子一段時間內(nèi)處于穩(wěn)定的體系中.待結晶的液滴孵育在低密度(0.87g/m3)石蠟油中，防止其蒸發(fā)、污染或受物理震動的影響，通常能維持1.3周的時間。與蒸汽擴散結晶法相比，批量結晶法操作簡單，比較適合進行高通量的實驗，現(xiàn)在的儀器能將微量批量結晶的體積控制在lnl左右。透析結晶法，大分子蛋白質(zhì)和小分子結晶劑之間由半透膜分開，兩邊存在的濃度梯度使得小分子結晶劑通過半透膜與大分子蛋白質(zhì)混合，而大分子的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，從而使膜內(nèi)溶液過飽和并產(chǎn)生蛋白質(zhì)晶體。⑵新技術的應用：引晶技術是指將劣質(zhì)的晶體植入與其結晶條件相似但不完全相同的新的體系中。晶種的引入是通過改變結晶母液的化學位移引起晶體的生長，而不是晶種本身引發(fā)晶體生長。某些情況下向母液中植入晶種能誘導晶體生長而其他條件下晶種可能不引發(fā)晶體生長。因此，通過改變化學位移而引起的晶體生長擴大了選中結晶條件的概率。用配體穩(wěn)定蛋白質(zhì)用配體穩(wěn)定蛋白質(zhì)不僅能使蛋白質(zhì)活性更加穩(wěn)定和更容易結晶，而且能提高獲得高質(zhì)量單晶的機會。人工誘導成核，通過有計劃、有選擇地控制核的數(shù)量和核生長的過飽和點會形成高質(zhì)量的晶體。蛋白質(zhì)修飾分子生物學方法可以通過取代特殊氨基酸殘基、修飾特定的側鏈或者合并翻譯后修飾等方式來賦予蛋白“結晶”特性。常用的提高蛋白質(zhì)結晶特性的化學修飾方法是賴氨酸殘基甲基化的還原。這種方法通過提高甲基化的賴氨酸側鏈的疏水性來降低蛋白質(zhì)的溶解度。生物物理技術的應用大量的生物物理技術和方法被用來評價蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性。常用的兩種技術是發(fā)射熒光光譜和光散射技術，它們幫助確定能輔助篩選蛋白質(zhì)結晶的穩(wěn)定條件。前者通過測量熒光的變化來監(jiān)測蛋白質(zhì)的展開或因配體結合引起的構象變化，而動態(tài)光散射可用來測定一個樣本是否適合結晶。盡管近幾年結構生物學的研究飛速發(fā)展，但蛋白質(zhì)結晶很大程度上依然是經(jīng)驗科學。因此，我們應進一步深入認識蛋白質(zhì)的結晶規(guī)律，結合先進的科學技術，采用更多的結晶策略和方法使目標蛋白更容易結晶。.簡述同源建模在蛋白質(zhì)結構研究中的應用和意義。同源建模的基本步驟：模板蛋白的搜索PDB數(shù)據(jù)庫、BLAST獲取模板（一個或者多個）；對比結果校正；主鏈生成；環(huán)區(qū)建模；模型優(yōu)化；合理性檢測。隨著人類基因組計劃的實施和推進，生命科學研究已經(jīng)進入了后基因組時代。近年來，隨著X-ray結晶學、核磁共振NMR、冷凍電鏡cryo—EM等實驗技術的發(fā)展，對蛋白質(zhì)的研究取得了高速的發(fā)展，計算機技術的高速發(fā)展，衍生了很多的交叉學科，利用計算機來輔助研究、輔助設計在實驗和理論研究上都越來越重要，尤其是在研究類似蛋白質(zhì)這樣的巨大數(shù)據(jù)庫的時候。同源性研究的理論依據(jù)是：如果兩個蛋白質(zhì)的序列比較相似，則它們可能有非常接近的三維結構、生化性質(zhì)。一般認為序列同源性大于30%的蛋白質(zhì)可能有同一祖先進化而來，稱為同源蛋白質(zhì)。同源蛋白質(zhì)具有相似的結構和功能。按照蛋白質(zhì)的親緣關系，可以將蛋白質(zhì)按照不同的層次分類，構建演化樹，同源蛋白質(zhì)在演化樹上的演化距離通常較近，處于同一個家族或超家族中。這些信息可以被整理成蛋白質(zhì)分類數(shù)據(jù)庫（例如SCOP、FSSP、CATH等）以備下一步的研究。同源建模法利用結構和屬性已知的同一家族中的其它同源蛋白質(zhì)性質(zhì)，來建立、近似目標蛋白質(zhì)的結構和屬性模型，然后再根據(jù)其它的物理學、化學性質(zhì)進行精化，近年來在很多領域都取得了巨大的成功。目前的同源建模法對于序列一致性大于30%的蛋白質(zhì)序列，已經(jīng)能得到相當好的結構模型。這類方法的最大的優(yōu)點是準確度高，其缺點是只能處理和模板庫中蛋白質(zhì)序列相似性較高的情況。.簡述等電點的原理及其在蛋白質(zhì)分離中的應用。兩性離子所帶電荷因溶液的pH值不同而改變，當兩性離子正負電荷數(shù)值相等時，溶液的pH值即其等電點.蛋白質(zhì)是帶有正電荷和負電荷的兩性電解質(zhì)，蛋白質(zhì)分子的電荷性質(zhì)和數(shù)量則因pH不同而變化。蛋白質(zhì)處于等電點時，其靜電荷為零，由于蛋白質(zhì)分子沒有靜電斥力而趨于沉淀。不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點，利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低的原理，可以把混合物分開。當pH被調(diào)制蛋白質(zhì)混合物中某種成分的等電點pH時，這種蛋白質(zhì)的大部分或者全部將沉淀下來，那些等電點高于或低于該pH的蛋白質(zhì)仍存留在溶液中。這樣等電點處理還有一個好處，就是這樣沉淀的蛋白質(zhì)依然具有天然構象，能重新溶解于適當?shù)膒H和一定濃度的鹽溶液中，便于工業(yè)生產(chǎn)中雜蛋白的回收利用。.簡述蛋白質(zhì)組學的研究思路和其涉及的主要技術。蛋白質(zhì)組研究本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關于疾病發(fā)生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識。蛋白質(zhì)組研究需要有足夠的技術支撐，如質(zhì)譜分析（MS）,酵母雙雜交系統(tǒng)，蛋白質(zhì)微陣列技術以及能夠進行大規(guī)模數(shù)據(jù)處理的計算機系統(tǒng)和軟件等［6］?，F(xiàn)階段蛋白質(zhì)組的研究可分為3個主要步驟：應用雙向凝膠電泳、“雙向”高效柱層析分離蛋白質(zhì)；應用氨基酸組成分析、C或N末端氨基酸序列分析及質(zhì)譜分析鑒定所分離的蛋白質(zhì)；應用生物信息學數(shù)據(jù)庫對鑒定結果進行存儲、處理、對比和分析。13簡述分子定向進化的原理和方法。原理：分子定向進化是利用Taq-DNA聚合酶不具有3-5校對功能的性質(zhì)，并結合基因工程現(xiàn)有技術手段，在待進化蛋白的PCR反應中，配合適當條件，以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，并構建突變庫。憑借定向的選擇方法，選擇所需性質(zhì)的突變體。與自然進化不同，定向進化是人為制造特殊條件，模仿自然進化機制，使進化過程定向進行。方法：定向進化第一步是由一個靶基因或一群相關的家族基因起始創(chuàng)建分子多樣性（突變和/或重組)；然后對該多樣性文庫的基因產(chǎn)物進行篩選，那些編碼改進功能產(chǎn)物的基因被利用來繼續(xù)下一輪進化；重復這個過程直到達到目標。14簡述原子力顯微鏡或光攝在蛋白質(zhì)構象研究中的應用。原子力顯微鏡(AtomicForceMicroscope,AFM),一種可用來研究包括絕緣體在內(nèi)的固體材料表面結構的分析儀器。它通過檢測待測樣品表面和一個微型力敏感元件之間的極微弱的原子間相互作用力來研究物質(zhì)的表面結構及性質(zhì)。將一對微弱力極端敏感的微懸臂一端固定，另一端的微小針尖接近樣品，這時它將與其相互作用，作用力將使得微懸臂發(fā)生形變或運動狀態(tài)發(fā)生變化。掃描樣品時，利用傳感器檢測這些變化，就可獲得作用力分布信息，從而以納米級分辨率獲得表面形貌結構信息及表面粗糙度信息。它可以對蛋白質(zhì)進行表面成像、分析蛋白質(zhì)的大小和體積、測量蛋白質(zhì)空間結構，表征蛋白質(zhì)的結構與功能、了解分子間的相互作用等等。對樣品蛋白的要求：樣品表面平整，高度起伏運10-20um；表面有一定的硬度；基底面平滑；樣品在基底表面要求相對均勻、分散等。由于蛋白樣品本身的特殊性，因此用AFM對其研究主要有兩種模式：接觸模式和輕敲模式。一般情況下，在大氣環(huán)境下掃描，通常使用輕敲模式；在液體環(huán)境下掃描，最好使用接觸模式，有時也可以使用輕敲模式。當空氣中濕度較大，用接觸模式掃描時，會在表面形成一層薄液面，由于液面對針尖所產(chǎn)生的毛細管力遠超過其它的作用力，從而使樣品變形，降低了分辨率。而改用輕敲模式的話，毛細管力對針尖的作用明顯減少，因此在空氣中成像時最好使用輕敲模式。在緩沖液中成像，由于不存在毛細管力的作用，使用接觸模式可以保