(最新整理)革蘭氏染色試驗步驟課件

(最新整理)革蘭氏染色試驗步驟2021/7/261(最新整理)革蘭氏染色試驗步驟2021/7/261實驗一顯微鏡（油鏡）的使用和細菌

的三種基本形態(tài)觀察

一、實驗目的1、學習并掌握油鏡的基本原理和使用方法。2、觀察和識別細菌的三種基本形態(tài)。2021/7/262實驗一顯微鏡（油鏡）的使用和細菌

的三二、基本原理1、增加照明強度在油鏡與載玻片之間加入與玻片的折射率相仿的鏡油，使進入物鏡的光線不會由折射或反射造成損失，基本上全進入鏡頭，結果提高了照明強度，使圖像更加清晰。折射率(n)空氣1.00水1.33香柏油1.52玻璃1.552021/7/263二、基本原理1、增加照明強度2021/7/2632、增加顯微鏡的分辨率

分辨率是指顯微鏡能分辨兩點間最小距離的能力。D值愈小則表明分辨力愈強。D=0.61λ/NANA=n·sinα/2

λ：光波波長NA：物鏡的數(shù)值孔徑值n：介質(zhì)折射率α：鏡口角（總是小于180°）2021/7/2642、增加顯微鏡的分辨率2021/7/264三、實驗器材1、標本：細菌三型玻片。2、試劑：香柏油、鏡頭清洗液（V乙醚:V酒精＝7:3）。3、器具：顯微鏡（有油鏡）、擦鏡紙、玻璃棒等。2021/7/265三、實驗器材1、標本：細菌三型玻片。2021/7/265四、實驗步驟1、放置標本:將染色的細菌三型玻片置于鏡臺上。2、找合適的視野:先用低倍鏡尋找合適的視野并將欲觀察的部位其移到視野中央。3、轉換油鏡：將油鏡轉到工作位置。4、調(diào)節(jié)聚光器與油鏡數(shù)值孔徑一致：將聚光器上升到最高位置，可變光闌開到最大。5、加香柏油：使油鏡鏡頭浸入香柏油中。注意油鏡鏡頭千萬不要壓在玻片標本上。6、調(diào)焦：轉動粗調(diào)焦螺旋，再緩慢地提升油鏡調(diào)焦至物像清晰。注意下降或上升鏡筒或載物臺絕不可用力過猛。

7、觀察:仔細觀察細菌的三種基本形態(tài)8、顯微鏡用畢后的處理:上升鏡筒，取下玻片，清潔油鏡2021/7/266四、實驗步驟1、放置標本:將染色的細菌三型玻片置于鏡臺上。棒狀桿菌2021/7/267棒狀桿菌2021/7/267螺旋菌2021/7/268螺旋菌2021/7/268注意事項1、油鏡工作距離短，故操作時要特別謹慎，切忌用眼睛對著目鏡邊觀察邊下降鏡筒，而應從側面注視。2、調(diào)焦時，應特別注意，切勿將粗調(diào)節(jié)器向反方向(由高向低)轉動而損失鏡頭和玻片。2021/7/269注意事項1、油鏡工作距離短，故操作時要特別謹慎，切忌用眼實驗報告1、繪細菌三種基本形態(tài)圖2、簡述油鏡的工作原理2021/7/2610實驗報告1、繪細菌三種基本形態(tài)圖2021/7/2610實驗二細菌的芽孢染色和

革蘭氏染色法一、實驗目的1、學習并掌握革蘭氏染色和芽孢染色的原理和方法。2、了解革蘭氏染色和芽孢染色在細菌分類鑒定中的重要性。2021/7/2611實驗二細菌的芽孢染色和

革蘭氏染色1、革蘭氏染色原理

革蘭氏染色法是Gram發(fā)明的一種細菌鑒別染色法，通過這種染色方法，可將細菌分為兩大類：一類被染成紫色，稱為革蘭氏陽性細菌；一類被染成紅色，稱為革蘭氏陰性細菌。其染色原理主要根據(jù)兩類細菌的細胞壁化學組成和結構不同。

二、基本原理2021/7/26121、革蘭氏染色原理二、基本原理2021/7/2612二、基本原理通過結晶紫液初染和碘液媒染后，在細菌的細胞膜內(nèi)可形成不溶于水的結晶紫液和碘液的復合物，G+細菌由于其細胞壁較厚，肽聚糖網(wǎng)層次多和交聯(lián)致密，因此遇脫色劑乙醇處理時，因失水而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇的處理不會溶出縫隙，因此能把結晶紫與碘的復合物牢牢留在壁內(nèi)，使其保持紫色。反之，G-細菌的細胞壁薄，外膜層類脂含量高，肽聚糖層薄，交聯(lián)度差，遇脫色劑乙醇后，以類脂為主的外膜迅速溶解，這時薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此細胞褪成無色。再經(jīng)番紅、沙黃等紅色染料復染,就使G-細菌呈現(xiàn)紅色,而G+細菌則保留紫色。1、革蘭氏染色原理染色結果：陽性細菌（G+）：染成紫色染色結果：陰性細菌（G-）：染成紅色2021/7/2613二、基本原理1、革蘭氏染色原理染色結果：陽性細菌（G+）：2、芽孢染色原理

細菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽孢不著色。芽孢染色法就是根據(jù)芽孢既難以染色而一旦著色后又難以脫色這一特點，用著色力強的染色劑孔雀綠或石炭酸，在加熱條件下，延長染色時間，使染料不僅進入菌體也進入芽孢內(nèi)，進入菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色，而芽孢一經(jīng)著色就難以被水洗脫，當用對比度大的復染劑番紅復染后，芽孢仍保留初染劑的綠色，而菌體則被染成復染劑的紅色。2021/7/26142、芽孢染色原理2021/7/2614三、實驗器材1、菌種：大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）或巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）。2、試劑：革蘭氏染液:草酸銨結晶紫染液、盧戈氏典液、95%乙醇、番紅復染液；芽孢染液:5%孔雀綠染色液、0.5%番紅水溶液。3、器具：顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、鑷子、木夾、香柏油、酒精乙醚液、擦鏡紙等。2021/7/2615三、實驗器材1、菌種：大腸埃希氏菌（Escherichia1、革蘭氏染色四、實驗步驟涂片：用接種環(huán)挑取少許菌苔于水滴中混勻后，再挑取2-3環(huán)菌懸液至另一載片上涂開。干燥：室溫自然干燥或電吹風吹干固定：涂片朝上，通過火焰2-3次，染色鏡檢清潔顯微鏡初染：滴加草酸銨結晶紫覆蓋涂片區(qū)域染色2min，水洗。媒染：滴加盧氏碘液，染色1min，水洗。脫色：用滴管加95%乙醇沖洗脫色約30秒，立即水洗。復染：滴加番紅液復染約2min，水洗。2021/7/26161、革蘭氏染色四、實驗步驟涂片：用接種環(huán)挑取少許菌苔于制片染色滴加孔雀綠染液于涂片上，用木夾夾住載玻片在微火上 加熱至染液冒蒸汽時開始計時5min。

加熱過程中要及時添加染色液，切勿讓標本干涸。水洗待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗至流出的水無色為止。復染用番紅染色液復染2min水洗待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗至流出的水無色為止。鏡檢 干燥后用油鏡觀察 2、芽孢染色2021/7/2617制片染色滴加孔雀綠染液于涂片上，用木夾夾住載玻片在微火染色結果（革蘭氏染色）枯草芽孢桿菌（革蘭氏染色）大腸桿菌（革蘭氏染色）2021/7/2618染色結果（革蘭氏染色）枯草芽孢桿菌（革蘭氏染色）大腸桿菌（革染色結果（革蘭氏染色）金黃色葡萄球菌（革蘭氏染色）2021/7/2619染色結果（革蘭氏染色）金黃色葡萄球菌（革蘭氏染色）2021/染色結果（芽孢染色）枯草芽孢桿菌（芽孢染色）2021/7/2620染色結果（芽孢染色）枯草芽孢桿菌（芽孢染色）2021/7/21、革蘭氏染色關鍵是脫色時間，如脫色時間過長，會造成假陰性。如脫色時間過短，會造成假陽性。2、革蘭氏染色的菌種，選用培養(yǎng)18-24h菌齡的細菌為宜。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。3、芽孢染色的菌種的菌齡，應使大部分芽孢仍保留在菌體內(nèi)為宜。芽孢桿菌一般在37℃下培養(yǎng)12-14h效果最佳。4、在孔雀綠加熱過程中，要及時補充染液，切勿讓涂片干涸。注意事項2021/7/26211、革蘭氏染色關鍵是脫色時間，如脫色時間過長，會造成假陰性。實驗報告1、繪枯草芽孢桿菌圖2、將革氏染色結果填于下表菌種菌體顏色菌體形態(tài)（圖示）G+或G-大腸埃希氏菌金黃色葡萄球菌2021/7/2622實驗報告1、繪枯草芽孢桿菌圖菌種菌體顏色菌體形態(tài)（圖示）G+實驗視頻2021/7/2623實驗視頻2021/7/2623實驗三放線菌和真菌的形態(tài)

特征觀察一、實驗目的1、學習觀察放線菌和真菌形態(tài)的基本方法。2、觀察放線菌和真菌的形態(tài)特征。2021/7/2624實驗三放線菌和真菌的形態(tài)

放線菌：放線菌是無隔分枝的菌絲體，為革蘭氏陽性菌。典型放線菌的菌絲體分化產(chǎn)生各種形態(tài)特征：二、基本原理菌絲體基內(nèi)絲菌（較細、透明）氣生菌絲（較粗顏色較深）有無氣生菌絲孢子絲（直、波曲、各種螺旋或輪生）等，是分類鑒定的重要依據(jù)孢子：分生孢子（球形，橢圓，桿狀或柱狀）、孢囊孢子、游動孢子扦片法：將放線菌接種在瓊脂平板上，扦上滅菌蓋玻片后培養(yǎng)，使放線菌菌絲沿著培養(yǎng)基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻片上。觀察時，輕輕取出蓋玻片，可觀察到不同生長時期放線菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)特征。2021/7/2625放線菌：放線菌是無隔分枝的菌絲體，為革蘭氏陽性菌。典型放線真菌酵母菌：單細胞真核生物

形態(tài)：卵圓形、圓形、橢圓形或圓柱形等

繁殖方式：無性：主要為出芽繁殖，產(chǎn)生芽孢子有性：產(chǎn)生子囊孢子

美籃染色優(yōu)點：可區(qū)分死活細胞，活細胞能使藍色變無色，死細胞一直呈藍色。霉菌：霉菌可產(chǎn)生復雜分枝的菌絲體（基內(nèi)菌絲和氣生菌絲），氣生菌絲長到一定階段分化產(chǎn)生分生孢子梗，分生孢子梗上產(chǎn)生生孢子。分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)特征是分類的重要依據(jù)。繁殖方式：主要產(chǎn)生無性孢子和產(chǎn)生有性孢子繁殖乳酸石炭酸棉藍染色優(yōu)點：細胞不變形，不易干燥，防腐，保存時間較長，防止孢子飛散。2021/7/2626真酵母菌：單細胞真核生物霉菌：霉菌可產(chǎn)生復雜分枝的菌絲體（基三、實驗器材1、菌種：細黃鏈霉（Streptomycesmicroflavus）紅酵母（RhodotorulaSP）產(chǎn)黃青霉（Penicilliumchrysogenum）黑曲霉（Aspergillusniger）黑根霉（Rhizopusnigricans）總狀毛霉（Mucorracemosds）

2、培養(yǎng)基：高氏1號瓊脂、麥芽汁瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂或查氏培養(yǎng)基。3、試劑：0.1%美藍染液、乳酸石炭酸棉藍染色液、50%乙醇。4、器具：顯微鏡、培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、鑷子、接種杯、解剖針、擦鏡紙等。2021/7/2627三、實驗器材1、菌種：細黃鏈霉（Streptomycesm放線菌形態(tài)觀察方法（扦片法）四、實驗步驟倒平板：冷至約50℃倒平板約20ml，凝固待用。接種：用接種環(huán)挑取菌種在瓊脂平板上劃線接種。扦片：用滅菌的鑷子夾起蓋玻片以約45℃扦入平板內(nèi)（扦在接種線上）培養(yǎng)：倒置平板，28℃培養(yǎng)5-7天。鏡檢：拔出蓋玻片，擦去背面培養(yǎng)物，將有菌的一面放在載玻片上，直接鏡檢或?qū)⒂芯囊幻娉?，放在滴?.1%美藍染色液載玻片中鏡檢。1蓋玻片2培養(yǎng)基2021/7/2628放線菌形態(tài)觀察方法（扦片法）四、實驗步驟倒平板：冷至約50℃酵母菌形態(tài)觀察方法（美藍浸片法）載玻片中央加一滴0.1%美藍染色液。挑取酵母菌苔少許，置美藍染色液中混合均勻。用鑷子取蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下，以免產(chǎn)生氣泡影響觀察。用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽情況。2021/7/2629酵母菌形態(tài)觀察方法（美藍浸片法）載玻片中央加一滴0.1%美霉菌形態(tài)觀察方法（直接制片法）載玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉藍染色液。從霉菌菌落邊緣挑取少量已產(chǎn)孢子的霉菌菌絲。置于50%乙醇中浸一下以洗去脫落的孢子。放到載玻片的染液中，用解剖針將菌絲分散開。蓋上蓋玻片，置低倍鏡下觀察，必要時換高倍鏡。2021/7/2630霉菌形態(tài)觀察方法（直接制片法）載玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉藍注意事項1、鏡檢時請?zhí)貏e注意放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的粗細和色澤差異。2、染液不宜過多或過少，否則，在蓋上蓋片時，染液過多會溢出，過少會出現(xiàn)大量氣泡而影響觀察。3、制片時，用鑷子或解剖針小心將菌絲分開，要盡可能保持霉菌自然生長狀態(tài)和完整性。2021/7/2631注意事項1、鏡檢時請?zhí)貏e注意放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的粗細放線菌和真菌形態(tài)放線菌酵母菌黑曲霉菌青霉菌2021/7/2632放線菌和真菌形態(tài)放線菌酵母菌黑曲霉菌青霉菌2021/7/26根霉菌形態(tài)根霉菌（無性孢子和有性孢子）2021/7/2633根霉菌形態(tài)根霉菌（無性孢子和有性孢子）2021/7/26332021/7/26342021/7/2634實驗報告繪細黃鏈霉菌、紅酵母菌、產(chǎn)黃青霉菌和黑曲霉菌的形態(tài)圖。2021/7/2635實驗報告2021/7/2635實驗四微生物顯微鏡直接

計數(shù)法

一、實驗目的1、明確血細胞計數(shù)板計數(shù)的原理2、掌握血細胞計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。2021/7/2636實驗四微生物顯微鏡直接

計數(shù)法

常用的測定微生物數(shù)量方法有鏡檢直接計數(shù)法和平板菌落計數(shù)法。鏡檢直接計數(shù)法采用血細胞計數(shù)板。構造如下：

二、基本原理平面圖側面圖蓋玻片計數(shù)室方格網(wǎng)，分為9個大格，中央大格E為計數(shù)室放大的計數(shù)室，分25中格放大的中格，分16小格小格中格計數(shù)室全貌1mm2共分400小格厚1mm，可得總數(shù)2021/7/2637常用的測定微生物數(shù)量方法有鏡檢直接計數(shù)法和平板菌落計二、基本原理計數(shù)室大方格的邊長為1mm，則每一個大方格的面積為1mm2，計數(shù)室與蓋玻片高度為0.1mm，計數(shù)室體積為0.1mm3（萬分之一毫升）。計數(shù)時先計5個中方格（計5個點）的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均數(shù)，再乘以中格數(shù)（25或16），就得出一個大方格（0.1mm3）計數(shù)室中的總菌數(shù)，再乘以104（換算成1mm含菌量）及菌液的稀釋倍數(shù)，即可算出1mm原菌液中的總菌數(shù)值。總菌數(shù)（個/ml）X1+X2+X3+X4+X5

5×25（或16）×104×稀釋倍數(shù)=2021/7/2638二、基本原理計數(shù)室大方格的邊長為1mm，則每一個大方格的面積1、菌種：紅酵母菌（RhodotoralasP）。2、試劑：無菌生理鹽水。3、器具：顯微鏡、血細胞計數(shù)板、吹風機、蓋玻片、無菌滴瓶（內(nèi)裝玻璃珠）、無菌毛細管、擦鏡紙、吸水紙等。三、實驗器材2021/7/26391、菌種：紅酵母菌（RhodotoralasP）。三、實驗四、實驗步驟菌懸液制備：以計數(shù)室內(nèi)每小格5-10酵母菌為宜。清洗計數(shù)板：自來水沖洗計數(shù)板后用吹風機吹干。加菌液：用毛細管吸取酵母菌懸液滴加在蓋玻片邊緣，讓菌液沿縫隙自動進入計數(shù)室。顯微鏡計數(shù)：每個計數(shù)室選5個中格（4個角各1個和中央1個）計數(shù)。計算清洗血細胞計數(shù)板：用水沖凈，后用吹風機吹干，放入計數(shù)板盒中。（切勿用硬物洗刷）總菌數(shù)（個/ml）X1+X2+X3+X4+X5

5×25（16）×104×稀釋倍數(shù)=2021/7/2640四、實驗步驟菌懸液制備：以計數(shù)室內(nèi)每小格5-10酵母菌為宜。注意事項1、取樣前，必須將菌懸液搖勻。2、計數(shù)室內(nèi)不可有氣泡。3、凡壓在中格線上的菌體，切莫四邊全計，常只計上方和右邊兩條線上的。4、計數(shù)時，遇出芽的酵母菌，芽體大小達到母細胞直徑的一半時計為2個。2021/7/2641注意事項1、取樣前，必須將菌懸液搖勻。2021/7/2641實驗報告1、將結果填入下表2021/7/2642實驗報告1、將結果填入下表2021/7/2642實驗五顯微測微尺的使用和

微生物大小的測定

一、實驗目的

1、學習并掌握用顯微測微尺測定微生物大小的原理和方法。2、增強微生物細胞大小的感性認識。2021/7/2643實驗五顯微測微尺的使用和

微生二、實驗原理微生物大小的測定，需要借助于特殊的測量工具——顯微測微尺（包括鏡臺測微尺和目鏡測微尺）鏡臺測微尺：中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般是將1mm等分為100格，每格長0.01mm（即10μm）。目鏡測微尺：可放入接目鏡內(nèi)的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，有等分為50小格和100小格兩種。2021/7/2644二、實驗原理微生物大小的測定，需要借助于特殊的測用目鏡測微尺測量微生物大小時，必須先用鏡臺測微尺校正目鏡測微尺，求出該顯微鏡在一定放大倍數(shù)的目鏡和物鏡下，目鏡測微尺每小格所代表的長度μm（校正值）。然后根據(jù)目鏡測微尺測量的微生物格數(shù)，即可計算出微生物細胞的實際大小。

目鏡測微尺每格長度（μm）兩重合線間鏡臺測微尺格數(shù)×10兩重合線間目鏡測微尺格數(shù)=圖示為目鏡尺47小格對應鏡臺尺7小格校正值＝7×10÷47＝1．49μm2021/7/2645用目鏡測微尺測量微生物大小時，必須先用鏡臺測微尺校正目鏡測微1、菌種：釀酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae

）2、器具：顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、接種環(huán)、載玻片、蓋玻片等。三、實驗器材2021/7/26461、菌種：釀酒酵母菌（Saccharomycescere四、實驗步驟校正低倍鏡清晰地觀察鏡臺測微尺的刻度后，轉動目鏡筒使目鏡尺的刻度與鏡臺尺的刻度平行。移動鏡臺尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺尺和目鏡尺所占的格數(shù)。裝目鏡測微尺目鏡測微尺刻度朝下放在目鏡鏡筒內(nèi)的隔板上校正目鏡測微尺菌體大小測定取下鏡臺測微尺，換上自制紅酵母裝片（水浸片），分別測出5個菌體寬和長所占目鏡測微尺的格數(shù)，然后將所測得的格數(shù)乘以目鏡測微尺校正值，即為酵母菌的實際大小。放鏡臺測微尺計算根據(jù)公式計算出在不同放大倍數(shù)下，目鏡尺的校正值兩重合線間鏡臺測微尺格數(shù)×10目鏡測微尺每格長度（μm）=兩重合線間目鏡測微尺格數(shù)2021/7/2647四、實驗步驟校正低倍鏡清晰地觀察鏡臺測微尺的刻度后，轉動1、觀察時光線不宜過強，否則難以找到鏡臺測微尺的刻度。2、換高倍鏡校正時，務必十分細心，防止物鏡壓壞鏡臺測微尺和損壞鏡頭。注意事項2021/7/26481、觀察時光線不宜過強，否則難以找到鏡臺測微尺的刻度。注意事實驗報告應用顯微鏡測微技術測量酵母菌菌體大小。（一）寫出實驗原理（二）實驗結果：寫出目鏡測微尺的標定公式。將目鏡測微尺的校正結果填入下表：物鏡物鏡倍數(shù)目鏡測微尺格數(shù)鏡臺測微尺格數(shù)目鏡測微尺每小格代表長度（μm）低倍10高倍402021/7/2649實驗報告應用顯微鏡測微技術測量酵母菌菌體大小。物鏡物鏡倍數(shù)3、在高倍鏡下測量酵母菌大小，將結果填入下表：酵母菌編號目鏡測微尺每格代表的長度寬度長度菌體大小寬╳長（μm）目鏡測微尺格數(shù)寬度（μm）目鏡測微尺格數(shù)長度（μm）12345平均2021/7/26503、在高倍鏡下測量酵母菌大小，將結果填入下表：酵母菌編號目鏡實驗六化學和物理因素對

微生物的影響一、實驗目的1、掌握培養(yǎng)基配制的一般方法和干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌的原理和方法。2、了解常用化學消毒劑和紫外線對微生物作用的原理、方法和殺（抑）菌能力。2021/7/2651實驗六化學和物理因素對

微二、實驗原理1、干熱滅菌利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。2、高壓蒸汽滅菌將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋內(nèi)水沸騰而產(chǎn)生蒸汽，從而增加滅菌器內(nèi)的壓力，使沸點增高，得到高于100℃的溫度。導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固

濕熱的穿透力比干熱大濕熱的蒸汽有潛熱存在

2021/7/2652二、實驗原理1、干熱滅菌利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變3、常用化學消毒劑重金屬離子與菌體蛋白質(zhì)結合而使之變性，或與酶蛋白的巰基相結合而使酶失活；重金屬鹽是蛋白質(zhì)沉淀劑，或與代謝產(chǎn)物發(fā)生螯合作用而使之變?yōu)闊o效化合物；有機溶劑(酚、醇、醛等)使蛋白質(zhì)及核酸變性，也可破壞細胞膜透性使內(nèi)含物外溢鹵族元素及其化合物：碘可與蛋白質(zhì)酪氨酸殘基不可逆結合而使蛋白質(zhì)失活，氯氣與水發(fā)生反應產(chǎn)生的強氧化劑也具有殺菌作用；有機染料在低濃度條件下可抑制細菌生長，革蘭氏陽性菌更加敏感；表面活性劑能降低溶液表面張力，這類物質(zhì)作用于微生物細胞膜，改變其透性，同時也能使蛋白質(zhì)發(fā)生變性。4、紫外線紫外線殺菌機理主要是因為它作用于細胞內(nèi)的DNA（脫氧核糖核酸），誘導了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復制。2021/7/26533、常用化學消毒劑重金屬離子與菌體蛋白質(zhì)結合而使之變性，1、菌種：大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）2、培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。3、試劑：2.5％碘酒，5％石炭酸，75％乙醇，0.05％龍膽紫，1%來蘇爾，無菌生理鹽水。4、器具：高壓蒸氣滅菌鍋、電子天平、無菌培養(yǎng)皿、三角瓶、燒杯、量筒、刻度吸管、三角涂棒、玻棒、漏斗、藥匙、pH試紙(PH5.5～9.0)、棉花、牛皮紙、記號筆、棉線、紗布、無菌濾紙片、剪刀、鑷子、等。三、實驗器材2021/7/26541、菌種：大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）三四、實驗步驟(一)化學因素對微生物的影響化學消毒劑對微生物的殺(抑)菌作用(濾紙片法)1、用無菌吸管吸取0.5ml的大腸桿菌（培養(yǎng)24h）菌懸液加入到上述平板中。2、將已滅菌并冷至50℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中（約15～20ml），充分混勻，水平放置待凝固。3、將已凝固好的帶菌平板底皿劃分成4～6等份，每一等份內(nèi)標明一種消毒劑的名稱。4、用無菌鑷子將已滅菌的小圓濾紙片(直徑5mm)分別浸入裝有各種消毒劑溶液的試劑瓶中浸濕。取出濾紙片時要在瓶口瀝去多余藥液，以保證各濾紙片所含消毒劑溶液量基本一致。5、無菌操作將濾紙片貼在平板相應區(qū)域．平板中間貼上浸有無菌生理鹽水的濾紙片作為對照。6、將上述貼好濾紙片的含菌平板倒置放于37℃溫箱中，24h后觀察記錄抑(殺)菌圈的大小。2021/7/2655四、實驗步驟(一)化學因素對微生物的影響2021/7/265

紫外線對微生物的影響1、制備菌懸液（大腸桿菌）2、溶化培養(yǎng)基3、倒平板4、接種（涂布法）5、加一塊滅菌三角形黑紙置平板中央6、打開皿蓋紫外線照射20min7、關閉紫外燈取下黑紙8、倒置培養(yǎng)（37℃培養(yǎng)24h）9、觀察記錄結果8、倒置培養(yǎng)（37℃培養(yǎng)24h）9、觀察記錄結果(二)物理因素對微生物的影響2021/7/2656(二)物理因素對微生物的影響2021/7/2656注意事項1、干熱滅菌結束后，一定要等箱內(nèi)溫度降到70℃左右才能打開箱門取物，否則冷熱空氣相遇會引起玻璃器皿爆炸甚至發(fā)生安全事故！2、高壓蒸汽滅菌完畢，壓力一定要降到“0”時，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內(nèi)壓力驟然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，污染棉塞，甚至引起安全事故！3、濾紙片法測定化學消毒劑的殺(抑)菌作用實驗中，取出濾紙片時要在瓶口瀝去多余藥液，以保證各濾紙片所含消毒劑溶液量基本一致。2021/7/2657注意事項1、干熱滅菌結束后，一定要等箱內(nèi)溫度降到70℃左右實驗報告消毒劑殺(抑)菌圈直徑（mm）2.5％碘酒5％石炭酸75％乙醇0.05％龍膽紫1%來蘇爾2、測量常用幾種化學消毒劑的抑菌圈大小，并將結果填入下表中1、圖示紫外線對微生物生長的影響比較各化學消毒劑抑菌效果

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＞2021/7/2658實驗報告消毒劑殺(抑)菌圈直徑（mm）2.5％碘酒5％石炭酸實驗七

細菌鑒定中常規(guī)生理生化反應

——甲基紅試驗與伏-普試驗

一、實驗目的

了解甲基紅反應與伏-普反應的原理及其在腸道細菌鑒定中的意義。2021/7/2659實驗七

細菌鑒定中常規(guī)生理生化反應

二、基本原理1、甲基紅試驗：某些細菌在糖代謝過程中，將培養(yǎng)基中糖先分解成丙酮酸，丙酮酸再分解成甲基、乙酸、乳酸等，因而使培養(yǎng)基變酸，用甲基紅指示劑[pH4.2（紅色）—6.3（黃色）]，可使培養(yǎng)基由原來的桔黃色變?yōu)榧t色，即甲基紅陽性反應。大腸桿菌為陽性反應，產(chǎn)氣桿菌為陰性反應。2021/7/2660二、基本原理1、甲基紅試驗：某些細菌在糖代謝過程中，將培養(yǎng)基2、伏-普試驗：某些細菌可利用葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進行縮合，脫羧變成乙酰甲基甲醇，此物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰。二乙酰與蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，即伏-普反應陽性，沒有紅色化合物產(chǎn)生則為陰性。產(chǎn)氣腸桿菌伏-普反應陽性，大腸桿菌伏-普反應陰性。2021/7/26612、伏-普試驗：某些細菌可利用葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進行縮

三、實驗器材1.菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌。2.培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。3.試劑：甲基紅指示劑，40%KOH，5%a-萘酚4.器具：恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺，高壓蒸汽滅菌鍋，接種環(huán)，記號筆，滅菌試管等。2021/7/2662

三、實驗器材1.菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌。2四、實驗步驟１、甲基紅實驗（M.R.試驗）（1）接種：

取3支裝有葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基試管，分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱，所接種的菌名和組號，1支接種大腸桿菌，1支接種產(chǎn)氣桿菌，1支不接種，作為對照。（2）培養(yǎng)：將接種的試管置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，加甲基紅指示劑數(shù)滴搖勻（3）結果觀察：呈現(xiàn)紅色者為陽性呈現(xiàn)黃色者為陰性2021/7/2663四、實驗步驟１、甲基紅實驗（M.R.試驗）2021/7/2２、伏-普試驗（V.P.試驗）

（1）接種：取3支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱，所接種的菌名和組號，1支接種大腸桿菌，1支接種產(chǎn)氣桿菌，1支不接種，作為對照。（2）培養(yǎng)：將接種的試管置37℃培養(yǎng)48h后，加入40%KOH5~10滴，然后再加入等量的5%a-萘酚溶液，用力振蕩。（3）保溫：再放入37℃溫箱中保溫30min，以加快反應速度。觀察培養(yǎng)基的顏色變化。（4）結果觀察若培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色，為伏-普反應陽性。2021/7/2664２、伏-普試驗（V.P.試驗）2021/7/2664注意事項1.在測定甲基紅實驗（M.R.試驗）結果時，甲基紅指示劑不可加的太多，以免出現(xiàn)假陽性反應。2.伏—普反應要求在與空氣充分接觸下完成，因此，加入試劑后需充分振搖。2021/7/2665注意事項1.在測定甲基紅實驗（M.R.試驗）結果時，實驗報告實驗現(xiàn)象大腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌未接種試管甲基紅試驗伏普試驗將試驗結果填入下表2021/7/2666實驗報告實驗現(xiàn)象大腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌未接種試管甲基紅試驗伏普試

實驗八不同類群的土壤微生物分離

一、實驗目的

1、了解微生物分離和純化的原理

2、掌握選擇培養(yǎng)基的配制及倒平板的方法和幾種常用的分離純化接種培養(yǎng)和鑒別微生物類群的基本操作技能和微生物的無菌操作技術。2021/7/2667

實驗八不同類群的土壤微生物分離

一、實二、基本原理本實驗采用平板分離法分離土壤中不同類群的微生物，該方法操作簡便，普遍用于微生物的分離與純化選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落，通常是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術來完成。主要根據(jù)菌落特征初步鑒別微生物的基本類群2021/7/2668二、基本原理本實驗采用平板分離法分離土壤中不同類群的微生三、實驗器材1、培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)基，馬丁氏培養(yǎng)基等。2、試劑：土壤懸液，無菌水。3、器具：超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、酒精燈、移液管、三角瓶、接種環(huán)、無菌培養(yǎng)皿、玻璃刮鏟等。2021/7/2669三、實驗器材1、培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)四、實驗步驟1．稀釋涂布平板法（1）培養(yǎng)基的配制：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，高氏Ⅰ號瓊脂培養(yǎng)基；馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基（２）倒平板：將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，高氏Ⅰ號瓊脂培養(yǎng)基；馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至55~60℃，高氏Ⅰ號瓊脂培養(yǎng)基加入10%酚數(shù)滴，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加入鏈霉素溶液?；靹蚝蠓謩e倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿；（３）制備土壤稀釋液：稱取土樣10g，放入盛有90ml無菌水并帶入玻璃珠的三角燒瓶，振動約20min，使土樣與水分混合，將細胞分散.用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取1ml加入另一個盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀釋的土壤溶液；2021/7/2670四、實驗步驟1．稀釋涂布平板法2021/7/2670（４）涂布接種：將上述每種培養(yǎng)基的三個平板地面分別用記號筆寫上10-4，10-5，10-6三種稀釋度，然后用無菌吸管分別由10-4，10-5，10-6三管土壤稀釋液中各取0.1ml對號加入已寫好標記的培養(yǎng)基上，均勻涂布，室溫下靜置5~10min，使菌液吸附進培養(yǎng)基；（５）培養(yǎng)：將高氏Ⅰ號瓊脂培養(yǎng)基平板、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基平板倒置，于28℃恒溫箱中培養(yǎng)3~5天，牛肉膏蛋白胨平板倒置，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)2~3天；（６）菌落鑒別：待菌落長出后，根據(jù)菌落特征初步鑒別微生物的類群，同時將細胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需要再一次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)止；（７）菌種的移植與保存：挑取單個純培養(yǎng)菌落少許，分別移植至上述相應三種培養(yǎng)基試管斜面上，分別置28℃和37℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌苔長滿斜面并確認為純種后置4℃冰箱中保存。

2021/7/2671（４）涂布接種：將上述每種培養(yǎng)基的三個平板地面分別用記號筆2．平板劃線分離法（1）倒平板：按稀釋涂布法倒平板，并用記號標明培養(yǎng)基名稱，土樣編號和實驗日期；（2）劃線接種與培養(yǎng)：在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線接種，然后置恒溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度和方法同上；（３）菌落鑒別：待菌落長出后，根據(jù)菌落特征初步鑒別微生物的類群，同時將細胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需要再一次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)止；（４）菌種的移植與保存：挑取單個純培養(yǎng)菌落少許，分別移植至上述相應三種培養(yǎng)基試管斜面上，分別置28℃和37℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌苔長滿斜面并確認為純種后置4℃冰箱中保存。2021/7/26722．平板劃線分離法2021/7/2672注意事項1、高壓蒸汽滅菌完畢，壓力一定要降到“0”時，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內(nèi)壓力驟然下降，內(nèi)外壓力不平衡，引起培養(yǎng)基暴沸，沖到瓶口污染棉塞，甚至引起安全事故！2.平板不能倒得太薄，為防止平板表面產(chǎn)生冷凝水，倒平板前培養(yǎng)基溫度不能太高。恒溫培養(yǎng)時培養(yǎng)皿應倒置。3.在分離和接種過程中必須進行嚴格的無菌操作。4.用于平板劃線的培養(yǎng)基，瓊脂含量宜高些，否則易劃破培養(yǎng)基。2021/7/2673注意事項1、高壓蒸汽滅菌完畢，壓力一定要降到“0”時，才能打?qū)嶒瀳蟾?、在平板上你分離得到哪種類群的微生物？簡述它們的菌落特征。2、從自然界中篩選能產(chǎn)生高溫蛋白酶的菌株，你將如何完成，請寫出簡明的實驗方案。2021/7/2674實驗報告1、在平板上你分離得到哪種類群的微生物？簡述它們2021/7/26752021/7/26752021/7/26762021/7/2676(最新整理)革蘭氏染色試驗步驟2021/7/2677(最新整理)革蘭氏染色試驗步驟2021/7/261實驗一顯微鏡（油鏡）的使用和細菌

的三種基本形態(tài)觀察

一、實驗目的1、學習并掌握油鏡的基本原理和使用方法。2、觀察和識別細菌的三種基本形態(tài)。2021/7/2678實驗一顯微鏡（油鏡）的使用和細菌

的三二、基本原理1、增加照明強度在油鏡與載玻片之間加入與玻片的折射率相仿的鏡油，使進入物鏡的光線不會由折射或反射造成損失，基本上全進入鏡頭，結果提高了照明強度，使圖像更加清晰。折射率(n)空氣1.00水1.33香柏油1.52玻璃1.552021/7/2679二、基本原理1、增加照明強度2021/7/2632、增加顯微鏡的分辨率

分辨率是指顯微鏡能分辨兩點間最小距離的能力。D值愈小則表明分辨力愈強。D=0.61λ/NANA=n·sinα/2

λ：光波波長NA：物鏡的數(shù)值孔徑值n：介質(zhì)折射率α：鏡口角（總是小于180°）2021/7/26802、增加顯微鏡的分辨率2021/7/264三、實驗器材1、標本：細菌三型玻片。2、試劑：香柏油、鏡頭清洗液（V乙醚:V酒精＝7:3）。3、器具：顯微鏡（有油鏡）、擦鏡紙、玻璃棒等。2021/7/2681三、實驗器材1、標本：細菌三型玻片。2021/7/265四、實驗步驟1、放置標本:將染色的細菌三型玻片置于鏡臺上。2、找合適的視野:先用低倍鏡尋找合適的視野并將欲觀察的部位其移到視野中央。3、轉換油鏡：將油鏡轉到工作位置。4、調(diào)節(jié)聚光器與油鏡數(shù)值孔徑一致：將聚光器上升到最高位置，可變光闌開到最大。5、加香柏油：使油鏡鏡頭浸入香柏油中。注意油鏡鏡頭千萬不要壓在玻片標本上。6、調(diào)焦：轉動粗調(diào)焦螺旋，再緩慢地提升油鏡調(diào)焦至物像清晰。注意下降或上升鏡筒或載物臺絕不可用力過猛。

7、觀察:仔細觀察細菌的三種基本形態(tài)8、顯微鏡用畢后的處理:上升鏡筒，取下玻片，清潔油鏡2021/7/2682四、實驗步驟1、放置標本:將染色的細菌三型玻片置于鏡臺上。棒狀桿菌2021/7/2683棒狀桿菌2021/7/267螺旋菌2021/7/2684螺旋菌2021/7/268注意事項1、油鏡工作距離短，故操作時要特別謹慎，切忌用眼睛對著目鏡邊觀察邊下降鏡筒，而應從側面注視。2、調(diào)焦時，應特別注意，切勿將粗調(diào)節(jié)器向反方向(由高向低)轉動而損失鏡頭和玻片。2021/7/2685注意事項1、油鏡工作距離短，故操作時要特別謹慎，切忌用眼實驗報告1、繪細菌三種基本形態(tài)圖2、簡述油鏡的工作原理2021/7/2686實驗報告1、繪細菌三種基本形態(tài)圖2021/7/2610實驗二細菌的芽孢染色和

革蘭氏染色法一、實驗目的1、學習并掌握革蘭氏染色和芽孢染色的原理和方法。2、了解革蘭氏染色和芽孢染色在細菌分類鑒定中的重要性。2021/7/2687實驗二細菌的芽孢染色和

革蘭氏染色1、革蘭氏染色原理

革蘭氏染色法是Gram發(fā)明的一種細菌鑒別染色法，通過這種染色方法，可將細菌分為兩大類：一類被染成紫色，稱為革蘭氏陽性細菌；一類被染成紅色，稱為革蘭氏陰性細菌。其染色原理主要根據(jù)兩類細菌的細胞壁化學組成和結構不同。

二、基本原理2021/7/26881、革蘭氏染色原理二、基本原理2021/7/2612二、基本原理通過結晶紫液初染和碘液媒染后，在細菌的細胞膜內(nèi)可形成不溶于水的結晶紫液和碘液的復合物，G+細菌由于其細胞壁較厚，肽聚糖網(wǎng)層次多和交聯(lián)致密，因此遇脫色劑乙醇處理時，因失水而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇的處理不會溶出縫隙，因此能把結晶紫與碘的復合物牢牢留在壁內(nèi)，使其保持紫色。反之，G-細菌的細胞壁薄，外膜層類脂含量高，肽聚糖層薄，交聯(lián)度差，遇脫色劑乙醇后，以類脂為主的外膜迅速溶解，這時薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此細胞褪成無色。再經(jīng)番紅、沙黃等紅色染料復染,就使G-細菌呈現(xiàn)紅色,而G+細菌則保留紫色。1、革蘭氏染色原理染色結果：陽性細菌（G+）：染成紫色染色結果：陰性細菌（G-）：染成紅色2021/7/2689二、基本原理1、革蘭氏染色原理染色結果：陽性細菌（G+）：2、芽孢染色原理

細菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽孢不著色。芽孢染色法就是根據(jù)芽孢既難以染色而一旦著色后又難以脫色這一特點，用著色力強的染色劑孔雀綠或石炭酸，在加熱條件下，延長染色時間，使染料不僅進入菌體也進入芽孢內(nèi)，進入菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色，而芽孢一經(jīng)著色就難以被水洗脫，當用對比度大的復染劑番紅復染后，芽孢仍保留初染劑的綠色，而菌體則被染成復染劑的紅色。2021/7/26902、芽孢染色原理2021/7/2614三、實驗器材1、菌種：大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）或巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）。2、試劑：革蘭氏染液:草酸銨結晶紫染液、盧戈氏典液、95%乙醇、番紅復染液；芽孢染液:5%孔雀綠染色液、0.5%番紅水溶液。3、器具：顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、鑷子、木夾、香柏油、酒精乙醚液、擦鏡紙等。2021/7/2691三、實驗器材1、菌種：大腸埃希氏菌（Escherichia1、革蘭氏染色四、實驗步驟涂片：用接種環(huán)挑取少許菌苔于水滴中混勻后，再挑取2-3環(huán)菌懸液至另一載片上涂開。干燥：室溫自然干燥或電吹風吹干固定：涂片朝上，通過火焰2-3次，染色鏡檢清潔顯微鏡初染：滴加草酸銨結晶紫覆蓋涂片區(qū)域染色2min，水洗。媒染：滴加盧氏碘液，染色1min，水洗。脫色：用滴管加95%乙醇沖洗脫色約30秒，立即水洗。復染：滴加番紅液復染約2min，水洗。2021/7/26921、革蘭氏染色四、實驗步驟涂片：用接種環(huán)挑取少許菌苔于制片染色滴加孔雀綠染液于涂片上，用木夾夾住載玻片在微火上 加熱至染液冒蒸汽時開始計時5min。

加熱過程中要及時添加染色液，切勿讓標本干涸。水洗待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗至流出的水無色為止。復染用番紅染色液復染2min水洗待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗至流出的水無色為止。鏡檢 干燥后用油鏡觀察 2、芽孢染色2021/7/2693制片染色滴加孔雀綠染液于涂片上，用木夾夾住載玻片在微火染色結果（革蘭氏染色）枯草芽孢桿菌（革蘭氏染色）大腸桿菌（革蘭氏染色）2021/7/2694染色結果（革蘭氏染色）枯草芽孢桿菌（革蘭氏染色）大腸桿菌（革染色結果（革蘭氏染色）金黃色葡萄球菌（革蘭氏染色）2021/7/2695染色結果（革蘭氏染色）金黃色葡萄球菌（革蘭氏染色）2021/染色結果（芽孢染色）枯草芽孢桿菌（芽孢染色）2021/7/2696染色結果（芽孢染色）枯草芽孢桿菌（芽孢染色）2021/7/21、革蘭氏染色關鍵是脫色時間，如脫色時間過長，會造成假陰性。如脫色時間過短，會造成假陽性。2、革蘭氏染色的菌種，選用培養(yǎng)18-24h菌齡的細菌為宜。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。3、芽孢染色的菌種的菌齡，應使大部分芽孢仍保留在菌體內(nèi)為宜。芽孢桿菌一般在37℃下培養(yǎng)12-14h效果最佳。4、在孔雀綠加熱過程中，要及時補充染液，切勿讓涂片干涸。注意事項2021/7/26971、革蘭氏染色關鍵是脫色時間，如脫色時間過長，會造成假陰性。實驗報告1、繪枯草芽孢桿菌圖2、將革氏染色結果填于下表菌種菌體顏色菌體形態(tài)（圖示）G+或G-大腸埃希氏菌金黃色葡萄球菌2021/7/2698實驗報告1、繪枯草芽孢桿菌圖菌種菌體顏色菌體形態(tài)（圖示）G+實驗視頻2021/7/2699實驗視頻2021/7/2623實驗三放線菌和真菌的形態(tài)

特征觀察一、實驗目的1、學習觀察放線菌和真菌形態(tài)的基本方法。2、觀察放線菌和真菌的形態(tài)特征。2021/7/26100實驗三放線菌和真菌的形態(tài)

放線菌：放線菌是無隔分枝的菌絲體，為革蘭氏陽性菌。典型放線菌的菌絲體分化產(chǎn)生各種形態(tài)特征：二、基本原理菌絲體基內(nèi)絲菌（較細、透明）氣生菌絲（較粗顏色較深）有無氣生菌絲孢子絲（直、波曲、各種螺旋或輪生）等，是分類鑒定的重要依據(jù)孢子：分生孢子（球形，橢圓，桿狀或柱狀）、孢囊孢子、游動孢子扦片法：將放線菌接種在瓊脂平板上，扦上滅菌蓋玻片后培養(yǎng)，使放線菌菌絲沿著培養(yǎng)基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻片上。觀察時，輕輕取出蓋玻片，可觀察到不同生長時期放線菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)特征。2021/7/26101放線菌：放線菌是無隔分枝的菌絲體，為革蘭氏陽性菌。典型放線真菌酵母菌：單細胞真核生物

形態(tài)：卵圓形、圓形、橢圓形或圓柱形等

繁殖方式：無性：主要為出芽繁殖，產(chǎn)生芽孢子有性：產(chǎn)生子囊孢子

美籃染色優(yōu)點：可區(qū)分死活細胞，活細胞能使藍色變無色，死細胞一直呈藍色。霉菌：霉菌可產(chǎn)生復雜分枝的菌絲體（基內(nèi)菌絲和氣生菌絲），氣生菌絲長到一定階段分化產(chǎn)生分生孢子梗，分生孢子梗上產(chǎn)生生孢子。分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)特征是分類的重要依據(jù)。繁殖方式：主要產(chǎn)生無性孢子和產(chǎn)生有性孢子繁殖乳酸石炭酸棉藍染色優(yōu)點：細胞不變形，不易干燥，防腐，保存時間較長，防止孢子飛散。2021/7/26102真酵母菌：單細胞真核生物霉菌：霉菌可產(chǎn)生復雜分枝的菌絲體（基三、實驗器材1、菌種：細黃鏈霉（Streptomycesmicroflavus）紅酵母（RhodotorulaSP）產(chǎn)黃青霉（Penicilliumchrysogenum）黑曲霉（Aspergillusniger）黑根霉（Rhizopusnigricans）總狀毛霉（Mucorracemosds）

2、培養(yǎng)基：高氏1號瓊脂、麥芽汁瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂或查氏培養(yǎng)基。3、試劑：0.1%美藍染液、乳酸石炭酸棉藍染色液、50%乙醇。4、器具：顯微鏡、培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、鑷子、接種杯、解剖針、擦鏡紙等。2021/7/26103三、實驗器材1、菌種：細黃鏈霉（Streptomycesm放線菌形態(tài)觀察方法（扦片法）四、實驗步驟倒平板：冷至約50℃倒平板約20ml，凝固待用。接種：用接種環(huán)挑取菌種在瓊脂平板上劃線接種。扦片：用滅菌的鑷子夾起蓋玻片以約45℃扦入平板內(nèi)（扦在接種線上）培養(yǎng)：倒置平板，28℃培養(yǎng)5-7天。鏡檢：拔出蓋玻片，擦去背面培養(yǎng)物，將有菌的一面放在載玻片上，直接鏡檢或?qū)⒂芯囊幻娉?，放在滴?.1%美藍染色液載玻片中鏡檢。1蓋玻片2培養(yǎng)基2021/7/26104放線菌形態(tài)觀察方法（扦片法）四、實驗步驟倒平板：冷至約50℃酵母菌形態(tài)觀察方法（美藍浸片法）載玻片中央加一滴0.1%美藍染色液。挑取酵母菌苔少許，置美藍染色液中混合均勻。用鑷子取蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下，以免產(chǎn)生氣泡影響觀察。用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽情況。2021/7/26105酵母菌形態(tài)觀察方法（美藍浸片法）載玻片中央加一滴0.1%美霉菌形態(tài)觀察方法（直接制片法）載玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉藍染色液。從霉菌菌落邊緣挑取少量已產(chǎn)孢子的霉菌菌絲。置于50%乙醇中浸一下以洗去脫落的孢子。放到載玻片的染液中，用解剖針將菌絲分散開。蓋上蓋玻片，置低倍鏡下觀察，必要時換高倍鏡。2021/7/26106霉菌形態(tài)觀察方法（直接制片法）載玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉藍注意事項1、鏡檢時請?zhí)貏e注意放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的粗細和色澤差異。2、染液不宜過多或過少，否則，在蓋上蓋片時，染液過多會溢出，過少會出現(xiàn)大量氣泡而影響觀察。3、制片時，用鑷子或解剖針小心將菌絲分開，要盡可能保持霉菌自然生長狀態(tài)和完整性。2021/7/26107注意事項1、鏡檢時請?zhí)貏e注意放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的粗細放線菌和真菌形態(tài)放線菌酵母菌黑曲霉菌青霉菌2021/7/26108放線菌和真菌形態(tài)放線菌酵母菌黑曲霉菌青霉菌2021/7/26根霉菌形態(tài)根霉菌（無性孢子和有性孢子）2021/7/26109根霉菌形態(tài)根霉菌（無性孢子和有性孢子）2021/7/26332021/7/261102021/7/2634實驗報告繪細黃鏈霉菌、紅酵母菌、產(chǎn)黃青霉菌和黑曲霉菌的形態(tài)圖。2021/7/26111實驗報告2021/7/2635實驗四微生物顯微鏡直接

計數(shù)法

一、實驗目的1、明確血細胞計數(shù)板計數(shù)的原理2、掌握血細胞計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。2021/7/26112實驗四微生物顯微鏡直接

計數(shù)法

常用的測定微生物數(shù)量方法有鏡檢直接計數(shù)法和平板菌落計數(shù)法。鏡檢直接計數(shù)法采用血細胞計數(shù)板。構造如下：

二、基本原理平面圖側面圖蓋玻片計數(shù)室方格網(wǎng)，分為9個大格，中央大格E為計數(shù)室放大的計數(shù)室，分25中格放大的中格，分16小格小格中格計數(shù)室全貌1mm2共分400小格厚1mm，可得總數(shù)2021/7/26113常用的測定微生物數(shù)量方法有鏡檢直接計數(shù)法和平板菌落計二、基本原理計數(shù)室大方格的邊長為1mm，則每一個大方格的面積為1mm2，計數(shù)室與蓋玻片高度為0.1mm，計數(shù)室體積為0.1mm3（萬分之一毫升）。計數(shù)時先計5個中方格（計5個點）的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均數(shù)，再乘以中格數(shù)（25或16），就得出一個大方格（0.1mm3）計數(shù)室中的總菌數(shù)，再乘以104（換算成1mm含菌量）及菌液的稀釋倍數(shù)，即可算出1mm原菌液中的總菌數(shù)值?？偩鷶?shù)（個/ml）X1+X2+X3+X4+X5

5×25（或16）×104×稀釋倍數(shù)=2021/7/26114二、基本原理計數(shù)室大方格的邊長為1mm，則每一個大方格的面積1、菌種：紅酵母菌（RhodotoralasP）。2、試劑：無菌生理鹽水。3、器具：顯微鏡、血細胞計數(shù)板、吹風機、蓋玻片、無菌滴瓶（內(nèi)裝玻璃珠）、無菌毛細管、擦鏡紙、吸水紙等。三、實驗器材2021/7/261151、菌種：紅酵母菌（RhodotoralasP）。三、實驗四、實驗步驟菌懸液制備：以計數(shù)室內(nèi)每小格5-10酵母菌為宜。清洗計數(shù)板：自來水沖洗計數(shù)板后用吹風機吹干。加菌液：用毛細管吸取酵母菌懸液滴加在蓋玻片邊緣，讓菌液沿縫隙自動進入計數(shù)室。顯微鏡計數(shù)：每個計數(shù)室選5個中格（4個角各1個和中央1個）計數(shù)。計算清洗血細胞計數(shù)板：用水沖凈，后用吹風機吹干，放入計數(shù)板盒中。（切勿用硬物洗刷）總菌數(shù)（個/ml）X1+X2+X3+X4+X5

5×25（16）×104×稀釋倍數(shù)=2021/7/26116四、實驗步驟菌懸液制備：以計數(shù)室內(nèi)每小格5-10酵母菌為宜。注意事項1、取樣前，必須將菌懸液搖勻。2、計數(shù)室內(nèi)不可有氣泡。3、凡壓在中格線上的菌體，切莫四邊全計，常只計上方和右邊兩條線上的。4、計數(shù)時，遇出芽的酵母菌，芽體大小達到母細胞直徑的一半時計為2個。2021/7/26117注意事項1、取樣前，必須將菌懸液搖勻。2021/7/2641實驗報告1、將結果填入下表2021/7/26118實驗報告1、將結果填入下表2021/7/2642實驗五顯微測微尺的使用和

微生物大小的測定

一、實驗目的

1、學習并掌握用顯微測微尺測定微生物大小的原理和方法。2、增強微生物細胞大小的感性認識。2021/7/26119實驗五顯微測微尺的使用和

微生二、實驗原理微生物大小的測定，需要借助于特殊的測量工具——顯微測微尺（包括鏡臺測微尺和目鏡測微尺）鏡臺測微尺：中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般是將1mm等分為100格，每格長0.01mm（即10μm）。目鏡測微尺：可放入接目鏡內(nèi)的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，有等分為50小格和100小格兩種。2021/7/26120二、實驗原理微生物大小的測定，需要借助于特殊的測用目鏡測微尺測量微生物大小時，必須先用鏡臺測微尺校正目鏡測微尺，求出該顯微鏡在一定放大倍數(shù)的目鏡和物鏡下，目鏡測微尺每小格所代表的長度μm（校正值）。然后根據(jù)目鏡測微尺測量的微生物格數(shù)，即可計算出微生物細胞的實際大小。

目鏡測微尺每格長度（μm）兩重合線間鏡臺測微尺格數(shù)×10兩重合線間目鏡測微尺格數(shù)=圖示為目鏡尺47小格對應鏡臺尺7小格校正值＝7×10÷47＝1．49μm2021/7/26121用目鏡測微尺測量微生物大小時，必須先用鏡臺測微尺校正目鏡測微1、菌種：釀酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae

）2、器具：顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、接種環(huán)、載玻片、蓋玻片等。三、實驗器材2021/7/261221、菌種：釀酒酵母菌（Saccharomycescere四、實驗步驟校正低倍鏡清晰地觀察鏡臺測微尺的刻度后，轉動目鏡筒使目鏡尺的刻度與鏡臺尺的刻度平行。移動鏡臺尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺尺和目鏡尺所占的格數(shù)。裝目鏡測微尺目鏡測微尺刻度朝下放在目鏡鏡筒內(nèi)的隔板上校正目鏡測微尺菌體大小測定取下鏡臺測微尺，換上自制紅酵母裝片（水浸片），分別測出5個菌體寬和長所占目鏡測微尺的格數(shù)，然后將所測得的格數(shù)乘以目鏡測微尺校正值，即為酵母菌的實際大小。放鏡臺測微尺計算根據(jù)公式計算出在不同放大倍數(shù)下，目鏡尺的校正值兩重合線間鏡臺測微尺格數(shù)×10目鏡測微尺每格長度（μm）=兩重合線間目鏡測微尺格數(shù)2021/7/26123四、實驗步驟校正低倍鏡清晰地觀察鏡臺測微尺的刻度后，轉動1、觀察時光線不宜過強，否則難以找到鏡臺測微尺的刻度。2、換高倍鏡校正時，務必十分細心，防止物鏡壓壞鏡臺測微尺和損壞鏡頭。注意事項2021/7/261241、觀察時光線不宜過強，否則難以找到鏡臺測微尺的刻度。注意事實驗報告應用顯微鏡測微技術測量酵母菌菌體大小。（一）寫出實驗原理（二）實驗結果：寫出目鏡測微尺的標定公式。將目鏡測微尺的校正結果填入下表：物鏡物鏡倍數(shù)目鏡測微尺格數(shù)鏡臺測微尺格數(shù)目鏡測微尺每小格代表長度（μm）低倍10高倍402021/7/26125實驗報告應用顯微鏡測微技術測量酵母菌菌體大小。物鏡物鏡倍數(shù)3、在高倍鏡下測量酵母菌大小，將結果填入下表：酵母菌編號目鏡測微尺每格代表的長度寬度長度菌體大小寬╳長（μm）目鏡測微尺格數(shù)寬度（μm）目鏡測微尺格數(shù)長度（μm）12345平均2021/7/261263、在高倍鏡下測量酵母菌大小，將結果填入下表：酵母菌編號目鏡實驗六化學和物理因素對

微生物的影響一、實驗目的1、掌握培養(yǎng)基配制的一般方法和干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌的原理和方法。2、了解常用化學消毒劑和紫外線對微生物作用的原理、方法和殺（抑）菌能力。2021/7/26127實驗六化學和物理因素對

微二、實驗原理1、干熱滅菌利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。2、高壓蒸汽滅菌將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋內(nèi)水沸騰而產(chǎn)生蒸汽，從而增加滅菌器內(nèi)的壓力，使沸點增高，得到高于100℃的溫度。導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固

濕熱的穿透力比干熱大濕熱的蒸汽有潛熱存在

2021/7/26128二、實驗原理1、干熱滅菌利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變3、常用化學消毒劑重金屬離子與菌體蛋白質(zhì)結合而使之變性，或與酶蛋白的巰基相結合而使酶失活；重金屬鹽是蛋白質(zhì)沉淀劑，或與代謝產(chǎn)物發(fā)生螯合作用而使之變?yōu)闊o效化合物；有機溶劑(酚、醇、醛等)使蛋白質(zhì)及核酸變性，也可破壞細胞膜透性使內(nèi)含物外溢鹵族元素及其化合物：碘可與蛋白質(zhì)酪氨酸殘基不可逆結合而使蛋白質(zhì)失活，氯氣與水發(fā)生反應產(chǎn)生的強氧化劑也具有殺菌作用；有機染料在低濃度條件下可抑制細菌生長，革蘭氏陽性菌更加敏感；表面活性劑能降低溶液表面張力，這類物質(zhì)作用于微生物細胞膜，改變其透性，同時也能使蛋白質(zhì)發(fā)生變性。4、紫外線紫外線殺菌機理主要是因為它作用于細胞內(nèi)的DNA（脫氧核糖核酸），誘導了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復制。2021/7/261293、常用化學消毒劑重金屬離子與菌體蛋白質(zhì)結合而使之變性，1、菌種：大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）2、培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。3、試劑：2.5％碘酒，5％石炭酸，75％乙醇，0.05％龍膽紫，1%來蘇爾，無菌生理鹽水。4、器具：高壓蒸氣滅菌鍋、電子天平、無菌培養(yǎng)皿、三角瓶、燒杯、量筒、刻度吸管、三角涂棒、玻棒、漏斗、藥匙、pH試紙(PH5.5～9.0)、棉花、牛皮紙、記號筆、棉線、紗布、無菌濾紙片、剪刀、鑷子、等。三、實驗器材2021/7/261301、菌種：大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）三四、實驗步驟(一)化學因素對微生物的影響化學消毒劑對微生物的殺(抑)菌作用(濾紙片法)1、用無菌吸管吸取0.5ml的大腸桿菌（培養(yǎng)24h）菌懸液加入到上述平板中。2、將已滅菌并冷至50℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中（約15～20ml），充分混勻，水平放置待凝固。3、將已凝固好的帶菌平板底皿劃分成4～6等份，每一等份內(nèi)標明一種消毒劑的名稱。4、用無菌鑷子將已滅菌的小圓濾紙片(直徑5mm)分別浸入裝有各種消毒劑溶液的試劑瓶中浸濕。取出濾紙片時要在瓶口瀝去多余藥液，以保證各濾紙片所含消毒劑溶液量基本一致。5、無菌操作將濾紙片貼在平板相應區(qū)域．平板中間貼上浸有無菌生理鹽水的濾紙片作為對照。6、將上述貼好濾紙片的含菌平板倒置放于37℃溫箱中，24h后觀察記錄抑(殺)菌圈的大小。2021/7/26131四、實驗步驟(一)化學因素對微生物的影響2021/7/265

紫外線對微生物的影響1、制備菌懸液（大腸桿菌）2、溶化培養(yǎng)基3、倒平板4、接種（涂布法）5、加一塊滅菌三角形黑紙置平板中央6、打開皿蓋紫外線照射20min7、關閉紫外燈取下黑紙8、倒置培養(yǎng)（37℃培養(yǎng)24h）9、觀察記錄結果8、倒置培養(yǎng)（37℃培養(yǎng)24h）9、觀察記錄結果(二)物理因素對微生物的影響2021/7/26132(二)物理因素對微生物的影響2021/7/2656注意事項1、干熱滅菌結束后，一定要等箱內(nèi)溫度降到70℃左右才能打開箱門取物，否則冷熱空氣相遇會引起玻璃器皿爆炸甚至發(fā)生安全事故！2、高壓蒸汽滅菌完畢，壓力一定要降到“0”時，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內(nèi)壓力驟然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，污染棉塞，甚至引起安全事故！3、濾紙片法測定化學消毒劑的殺(抑)菌作用實驗中，取出濾紙片時要在瓶口瀝去多余藥液，以保證各濾紙片所含消毒劑溶液量基本一致。2021/7/26133注意事項1、干熱滅菌結束后，一定要等箱內(nèi)溫度降到70℃左右實驗報告消毒劑殺(抑)菌圈直徑（mm）2.5％碘酒5％石炭酸75％乙醇0.05％龍膽紫1%來蘇爾2、測量常用幾種化學消毒劑的抑菌圈大小，并將結果填入下表中1、圖示紫外線對微生物生長的影響比較各化學消毒劑抑菌效果

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＞2021/7/26134實驗報告消毒劑殺(抑)菌圈直徑（mm）2.5％碘酒5％石炭酸實驗七

細菌鑒定中常規(guī)生理生化反應

——甲基紅試驗與伏-普試驗

一、實驗目的

了解甲基紅反應與伏-普反應的原理及其在腸道細菌鑒定中的意義。2021/7/26135實驗七

細菌鑒定中常規(guī)生理生化反應

二、基本原理1、甲基紅試驗：某些細菌在糖代謝過程中，將培養(yǎng)基中糖先分解成丙酮酸，丙酮酸再分解成甲基、乙酸、乳酸等，因而使培養(yǎng)基變酸，用甲基紅指示劑[pH4.2（紅色）—6.3（黃色）]，可使培養(yǎng)基由原來的桔黃色變?yōu)榧t色，即甲基紅陽性反應。大腸桿菌為陽性反應，產(chǎn)氣桿菌為陰性反應。2021/7/26136二、基本原理1、甲基紅試驗：某些細菌在糖代謝過程中，將培養(yǎng)基2、伏-普試驗：某些細菌可利用葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進行縮合，脫羧變成乙酰甲基甲醇，此物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰。二乙酰與蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，即伏-普反應陽性，沒有紅色化合物產(chǎn)生則為陰性。產(chǎn)氣腸桿菌伏-普反應陽性，大腸桿菌伏-普反應陰性。2021/7/261372、伏-普試驗：某些細菌可利用葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進行縮

三、實驗器材1.菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌。2.培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。3.試劑：甲基紅指示劑，40%KOH，5%a-萘酚4.器具：恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺，高壓蒸汽滅菌鍋，接種環(huán)，記號筆，滅菌試管等。2021/7/26138

三、實驗器材1.菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌。2四、實驗步驟１、甲基紅實驗（M.R.試驗）（1）接種：

取3支裝有葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基試管，分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱，所接種的菌名和組號，1支接種大腸桿菌，1支接種