肝膽排泄轉運體課件

藥物排泄的研究進展講演人：王婷婷2014年4月目錄（一）藥物排泄途徑排泄途徑排泄物收集法腎臟大鼠代謝籠法、導尿管法、膀胱造瘺法、輸尿管法膽汁膽總管插入法乳汁乳頭按摩收集唾液腮腺與頜下腺插管收集呼氣密封代謝籠吸收劑收集汗腺轉運體轉運物質典型底物血管側膜Na+-牛磺膽酸共轉運多肽(NTCP)膽汁酸；膽鹽；膽汁酸類似物雌酮-3-硫酸有機陰離子轉運蛋白（OATs）陰離子化合物、中性類固醇、生理物質(如前列腺素類和甲狀腺激素)和某些B類疏水性陽離子前列腺素E2,5-氟尿嘧啶、紫杉酚、茶堿有機陰離子轉運多肽（OATPs）雌二醇-17β-葡糖醛酸、雌酮-3-硫酸、羅舒伐他汀、非索非那定、替米沙坦有機陽離子轉運蛋白（OCTs）有機陽離子藥物及內源性物質(膽堿、胍等)撲熱息痛葡萄糖醛酸苷、MPP+、四乙胺、胍丁胺（三）肝臟藥物轉運體轉運體轉運物質典型底物膽管側膜P-糖蛋白(P-gp)脂溶性較高的陽性或中性藥物多柔比星、長春新堿、紅霉素、塞利洛爾、地西泮等多藥耐藥相關蛋白2(MRP2)陰離子化合物及共軛代謝物普伐他汀、替莫普利拉、甲氨蝶呤、多柔比星、順鉑膽酸鹽外排轉運蛋白（BSEP）未共扼結合的膽酸鹽?；悄懰猁}、甘氨膽酸鹽、膽酸鹽、?；鞘懰?、牛磺鵝去氧膽酸鹽、?；敲撗跄懰猁}、牛熊去氧膽酸鹽和他莫昔芬乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）某些藥物的膽汁排泄多種抗癌藥如甲基蝶呤、多柔比星等（三）肝臟藥物轉運體一、體內試驗基因缺陷動物模型先天遺傳性基因缺陷模型基因敲除模型二、體內/體外試驗

肝臟灌流技術離體肝臟灌流在體肝臟灌流（四）研究肝臟藥物轉運體的常用方法（五）文獻研究頭孢妥侖（CDRT）膽汁排泄的分子機制及其對肝臟轉運蛋白調節(jié)作用的研究在體肝灌流CDRT+抑制劑CDRT出口灌流液膽汁肝攝取率膽汁累積排泄率抑制劑是否影響肝攝取？轉運體參與膽汁排泄大鼠口服不同濃度CDRT一周肝組織總RNART-PCR各轉運體mRNA表達情況膜蛋白WesternBlot證實轉運蛋白表達情況HPLC二、實驗思路

肝臟的血液供應非常豐富，接受兩種來源的血供。（1）門靜脈。主要接受來自胃腸和脾臟的血液；（2）腹腔動脈的分支肝動脈。

門靜脈與肝動脈進入肝臟后，反復分支，在肝小葉周圍形成小葉間動脈和小葉間靜脈進入肝血竇中，再經(jīng)中央靜脈注入肝靜脈。四、實驗方法1.肝灌流實驗肝灌流裝置=灌流系統(tǒng)+恒溫系統(tǒng)+氣體交換系統(tǒng)1.1.實驗相關溶液的配制(1)抗凝緩沖液的配制枸櫞酸三鈉15.6g枸椽酸5.7gddH2O600m1(2)磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制NaCl(58.44)8.0gKCl(74.55)0.2gNa2HPO4.12H2O(358.14)2.9gKH2PO4(136.09)加ddH2O1000ml調pH7.4withHCl(3)灌流緩沖液的配制NaCl(58.44)118mM6.9gKCl(74.55)4.7mM0.35gMgSO4.7H2O(246.27)1.2mM0.30gKH2PO4(136.09)1.2mM0.16gNaHCO3(84.01)25mM2.10gGlu(198.17)5mM0.96gCaCl2(110.99)2.5mM0.28g加ddH2O1000m1調pH7.4withNaOH1.2灌流所需的牛血紅細胞制備

(1)3L新鮮牛血與600m1抗凝緩沖液混勻，過濾，三層紗布置于大漏斗中。使牛血貼壁流下，以免紅細胞因機械外力被破碎;(2)離心,5000rpm,l0min,4℃，將上層的血漿、血小板和白細胞棄去，下層為牛血紅細胞;(3)加入等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS),混勻，離心，3000rpm,l0min,4℃，清洗紅細胞，棄上清;(4)重復步驟(3)3次，收集下層干凈的牛血紅細胞，4℃保存，備灌流時使用。

(2)Wistar雄性大鼠于實驗前夜禁食(不禁水)，烏拉坦麻醉，腹部U型開口，將內臟移至右側，剝離并充分暴露門靜脈、下腔靜脈、右腎動靜脈和膽管;(3)膽管插管，固定，此時可見膽汁緩慢流出;(4)門靜脈插管，固定，用預熱的灌流緩沖液灌流肝臟，流速為12m1/min;(5)迅速剪斷下腔靜脈腹腔段，沖去肝臟內原有的血液，結扎右腎動靜脈;1.4.高效液相色譜法測定樣品中頭孢妥侖的含量(1)色譜條件色譜柱:CapcellpakC18UG1204.6X250mm(日本資生堂);

流動相:0.1%醋酸銨:甲醇(65:35);

流速:0.8ml/min;

檢測波長:295nm;

進樣器溫度:4℃;

進樣體積:25ul

(2)出口灌流液樣品預處理離心，3000rpm,5min,4℃，取上清液90ul置新的Ep管，加內標(25ug/ml)10ul,混勻，再加入甲醇200

u1,混勻，離心12000rpm,15min,4℃。取上清液100u1進樣;(3)膽汁樣品預處理取膽汁樣品10ul，加30u1ddHzO，內標l0ul,混勻，加50u1甲醇，混勻，離心，12000rpm,15min,4℃。取上清液70u1進樣。1.2膽汁累積排泄率Mrp2和Bcrp參與CDRT膽汁排泄