實驗一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)

關(guān)于實驗一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第一頁，共二十五頁，2022年，8月28日實驗?zāi)康模?.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作。2.進(jìn)行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基本進(jìn)行細(xì)菌的劃線培養(yǎng)。3.說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和實驗原理。第二頁，共二十五頁，2022年，8月28日一、基礎(chǔ)知識(一)微生物:1.特點：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡單,個體多數(shù)十分微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進(jìn)行光合作用.2.微生物包括五類病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動物第三頁，共二十五頁，2022年，8月28日(二)培養(yǎng)基1.分類(按物理形態(tài)分)(1)液體培養(yǎng)基(2)固體培養(yǎng)基常用的固體培養(yǎng)基:

瓊脂固體培養(yǎng)基.②微生物在固體培養(yǎng)基表面生長,可以形成肉眼可見的菌落.第四頁，共二十五頁，2022年，8月28日2.培養(yǎng)基內(nèi)所含的基本物質(zhì)(1)水(2)碳源(3)氮源(4)無機(jī)鹽第五頁，共二十五頁，2022年，8月28日3.培養(yǎng)基內(nèi)所需的其他條件(1)pH值如:培養(yǎng)霉菌需酸性、培養(yǎng)細(xì)菌需中性或微堿性(2)特殊營養(yǎng)物質(zhì)----?如：培養(yǎng)乳酸桿菌需要在培養(yǎng)基中添加維生素(3)氧氣的含量如:培養(yǎng)厭氧微生物時需要提供無氧的條件生長因子第六頁，共二十五頁，2022年，8月28日(三)無菌技術(shù)1、獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵:2、無菌技術(shù)的四個方面(參看教材20頁)3、消毒與滅菌(1)消毒：概念：使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物。包括芽孢和孢子嗎？方法:煮沸消毒法巴氏消毒法:如牛奶的消毒化學(xué)藥劑消毒:酒精、氯氣、石碳酸、煤酚皂溶液等紫外線消毒(不包括芽孢和孢子)防止外來雜菌的入侵第七頁，共二十五頁，2022年，8月28日（2）滅菌概念：使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a

灼燒滅菌b

干熱滅菌c

高壓蒸汽滅菌灼燒滅菌微生物的接種工具(接種環(huán)、接種針)或其他金屬用具直接在火焰的充分燃燒層灼燒注意適用范圍第八頁，共二十五頁，2022年，8月28日干熱滅菌

160－170℃；1－2h能耐高溫的需要保持干燥的物品(玻璃器皿)高壓蒸汽滅菌100kPa121℃15-30min通常用于培養(yǎng)基的滅菌第九頁，共二十五頁，2022年，8月28日二、實驗操作（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基計算－稱量－溶化－滅菌－倒平板（二）分離純化大腸桿菌接種方法有：劃線分離法和涂布分離法（三）將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h和24h后，觀察并記錄第十頁，共二十五頁，2022年，8月28日三、課題延伸：菌種的保藏1、斜面保藏（臨時保存）2、甘油保藏（長期保存）第十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日實驗1：大腸桿菌的培養(yǎng)和分離設(shè)備及用品：滅菌鍋或高壓鍋、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈、直徑90mm的培養(yǎng)皿、接種環(huán)和玻璃三角刮刀、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、酒精燈和超凈臺、一次性塑料手套、裝有酒精棉球的廣口瓶、鑷子、有棉塞的試管（15mm×120mm）5支實驗材料：(1)50mlLB液體培養(yǎng)基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、NaCl0.5g、加水50ml。(2)大腸桿菌菌種斜面(3)空白斜面

第十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日實驗步驟(1)滅菌：將配制好的50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB液體培養(yǎng)基分別裝入兩個250ml的三角瓶中，加上封口膜，用高壓鍋進(jìn)行滅菌。(2)制平板：在酒精燈火焰旁將固體培養(yǎng)基分別倒在4個培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基鋪平皿底部，待凝，使之形成平面。(3)接種擴(kuò)大培養(yǎng)：靠近酒精燈火焰將大腸桿菌接種到三角燒瓶的液體培養(yǎng)基中，三角燒瓶在37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h。(4)劃線分離：將搖床上培養(yǎng)12h的菌液在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線，然后將蓋好的培養(yǎng)皿倒置，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。(5)單菌落接種培養(yǎng)：在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在空白斜面上，在37℃下培養(yǎng)24h,4℃冰箱保存。第十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日單菌落第十四頁，共二十五頁，2022年，8月28日實驗討論

實驗完成后，接觸過細(xì)菌的器皿應(yīng)如何處理？實驗完成后，所有接觸過細(xì)菌的器皿都必須先高壓滅菌后再洗滌，特別是培養(yǎng)基，有可能被有害菌體污染，在培養(yǎng)繁殖后，大量有害菌體影響人畜健康，也污染環(huán)境，因此必須高壓滅菌。使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄。對于取樣器的取樣頭，通常是滅菌后在超聲波清洗器中加洗衣粉洗滌綸30min,再用清水洗凈，仍可再用。封口膜也可再用。第十五頁，共二十五頁，2022年，8月28日無菌技術(shù)的四個方面（1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；（3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近旁進(jìn)行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。(三)無菌技術(shù)返回第十六頁，共二十五頁，2022年，8月28日倒平板第十七頁，共二十五頁，2022年，8月28日討論:(1).培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？(2).為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？(3).平板冷凝后，為什么要將平板倒置？(4).在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。返回第十八頁，共二十五頁，2022年，8月28日1、平板劃線法第十九頁，共二十五頁，2022年，8月28日討論:(1).為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？(2).在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？(3).在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。返回第二十頁，共二十五頁，2022年，8月28日2.稀釋涂布法:(1)系列稀釋操作:第二十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日涂布平板操作討論:涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？提示：應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。返回第二十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日返回菌落：單個或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。不同的細(xì)菌的菌落特征不同菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。第二十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日(2)碳源可作為碳源的物質(zhì)有