大腸菌檢測(cè)-科立得酶底物法介紹課件

水中大腸菌群及大腸埃希氏菌檢測(cè)

－科立得酶底物法介紹IDEXXLaboratories美國(guó)愛德士生物科技背景信息－大腸桿菌大腸菌群（totalColiforms)

大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌群主要來(lái)源于人畜糞便，具有指標(biāo)菌的一般特征故以此作為糞便污染指標(biāo)評(píng)價(jià)飲水的衛(wèi)生質(zhì)量。耐熱大腸菌群（糞大腸菌群，F(xiàn)ecalColiforms)

用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分開，在44.5℃仍能生長(zhǎng)的大腸菌群，稱為糞大腸菌群。是水體受人畜糞便污染的比較直接指標(biāo)。大腸埃希氏菌（大腸桿菌，E.Coli.)大腸埃希氏菌是指能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培養(yǎng)液呈黃色，能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培養(yǎng)液在波長(zhǎng)366nm紫外光下產(chǎn)生熒光的細(xì)菌。大腸埃希氏菌是糞大腸菌群的組成部分，是水體受人畜糞便污染的最直接指標(biāo)，水中含有大腸埃希氏菌提示有糞便污染。

相關(guān)背景信息大腸菌群，耐熱大腸菌群，大腸埃希氏菌

耐熱大腸菌群大腸埃希氏菌大腸菌群背景材料－檢測(cè)方法多管發(fā)酵法（MTF)以100mL水樣中大腸菌最可能數(shù)(mostprobablenumber,MPN)表示

培養(yǎng)基制備>試管培養(yǎng)（22－26小時(shí)）陰性結(jié)果（無(wú)產(chǎn)酸，產(chǎn)氣）產(chǎn)酸，產(chǎn)氣平板培養(yǎng)18－24小時(shí)

觀察菌落形態(tài)，挑取特征菌落

革蘭氏染色，鏡檢>證實(shí)試驗(yàn)（36±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24±2h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實(shí)有總大腸菌群存在

背景材料－檢測(cè)方法濾膜法（membranefiltration,MF)用孔徑為0.45μｍ的微孔濾膜過濾水樣，細(xì)菌被截留在濾膜上，將濾膜貼在選擇性培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)在濾膜上的典型大腸菌群菌落數(shù),計(jì)數(shù)單位為菌落形成單位CFU(colonyformingunit)儲(chǔ)備培養(yǎng)基的制備>過濾（需器械滅菌等）>培養(yǎng)（22-24H）

陰性結(jié)果(無(wú)典型菌落）觀察菌落形態(tài),挑取特征菌落

革蘭氏染色，鏡檢證實(shí)試驗(yàn)（36±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24±2h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實(shí)有總大腸菌群存在

背景材料－檢測(cè)方法酶底物法原理：1，大腸菌群細(xì)菌能特異性產(chǎn)生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），該生物酶可以分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，β-半乳糖醛苷），使培養(yǎng)液呈黃色。2，大腸埃希氏菌能特異性產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase），分解MUG（4-甲基-傘形葡萄糖苷酸，4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）,使培養(yǎng)液在波長(zhǎng)366nm紫外光下產(chǎn)生熒光。利用該原理，來(lái)判斷水樣中是否含有大腸菌群及大腸埃希氏菌。

試劑中同時(shí)含有ONPG和MUG，所以本方法可同時(shí)檢測(cè)總大腸菌群和大腸埃希氏菌，51孔法并可以定量。檢測(cè)方法－酶底物法(EnzymeSubstrateTechnique)國(guó)標(biāo)GB/T5750.12—2006采用:DST技術(shù)酶底物法1,方法

采用固定底物技術(shù)（DefinedSubstrateTechnology，DST）之酶底物法，DST技術(shù)的原理就是采用和目標(biāo)細(xì)菌特異性反應(yīng)的培養(yǎng)基,并使之量最小化,比一般酶底物法假陽(yáng)性/陰性的發(fā)生率更底。2，培養(yǎng)基：

采用MinimalMediumONPG-MUG

(MMO-MUG)，即最少化ONPG-MUG培養(yǎng)基每1000mLMMO-MUG培養(yǎng)基所含基本成份為：A硫酸銨(NH4)2SO45.0gB硫酸錳Mn(SO4)20.5mgC硫酸鋅ZnSO40.5mgD硫酸鎂MgSO4100mgE氯化鈉NaCl10gF氯化鈣CaCl250mgG亞硫酸鈉Na2SO340mgH兩性霉素BAmphotericinB1mgIOrtho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)500mgJ4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide(MUG)75mgKSolanium萃取物500mgLN-2-Hydroxyethylpiperazine-N1-2-ethanesulphonicacid鈉鹽5.3gMN-2-Hydroxyethylpiperazine-N1-2-ethanesulphonicacid6.9gMUG的陽(yáng)性反應(yīng)(大腸桿菌E.Coli陽(yáng)性反應(yīng))

(Colilert,Colilert-18,Colisure)Colilert?之應(yīng)用飲用水

源水

瓶裝水

再生水

廢水

食品水畜牧用水

醫(yī)療用水

收錄于“標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試法”內(nèi)

–APHA(美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)),

USEPA,AOAC,USNCIMS,UKDWI,IBWA,WHO……

Colilert?(酶底物法;MMO-MUG;DST)介紹一個(gè)樣品同時(shí)檢測(cè)大腸菌群及大腸埃希氏菌24小時(shí)判斷結(jié)果定性法或定量法

（51孔定量盤）根據(jù)DefinedSubstrateTechnology?(DST)測(cè)量技術(shù)Colilert(MMO-MUG,DST?)針對(duì)目標(biāo)細(xì)菌(Coliforms&E.Coli)的特異性營(yíng)養(yǎng)指示劑(培養(yǎng)基)營(yíng)養(yǎng)指示劑作用時(shí),顏色會(huì)改變或呈現(xiàn)螢光反應(yīng)其它非目標(biāo)細(xì)菌不會(huì)干擾

減少雜菌干擾無(wú)培養(yǎng)基干擾(傳統(tǒng)方式常會(huì)因消毒劑、鹽、

抗生素、毒素、溫度造成抑制反應(yīng))

減少假陽(yáng)性反應(yīng)減少假陰性反應(yīng)

不須確認(rèn)

特異性

-大腸菌群和大腸埃希氏菌測(cè)試結(jié)果快速

判讀容易優(yōu)點(diǎn)m-endoMF*MTF*MLSBMF**Colilert**0%5%10%15%20%25%30%35%40%*Jacobsetal,AEM,1986.**Frickeretal,WaterRes.,1997假陽(yáng)性比較表假陰性比較表

成本比較表測(cè)試時(shí)間比較表定性檢測(cè)操作示范

加入Colilert試劑，搖晃至溶解

36℃培養(yǎng)24小時(shí)，判斷結(jié)果:1,無(wú)顏色變化－陰性2,黃色－大腸桿菌群陽(yáng)性3,黃色且熒光－大腸埃希氏菌陽(yáng)性44.5℃培養(yǎng)24小時(shí)，判斷結(jié)果：1,無(wú)顏色變化－陰性2,黃色－糞大腸陽(yáng)性Quanti-Tray?定量盤操作示范

將定量盤Quanti-Tray?放入程控定量封口機(jī)Sealer封口36℃培養(yǎng)24小時(shí)后，計(jì)算呈陽(yáng)性反應(yīng)的格子，然后對(duì)照MPN表

計(jì)數(shù)（44.5℃培養(yǎng)24小時(shí)用于檢測(cè)糞大腸）Colilert?使用方式為了減少培養(yǎng)箱的負(fù)荷，所有樣品必須回溫至室溫后使用

測(cè)試包打開后直接倒入，請(qǐng)勿敲打

對(duì)照樣品請(qǐng)儲(chǔ)存于陰暗處

請(qǐng)使用運(yùn)送時(shí)刻表以避免對(duì)照樣品過期

測(cè)試物呈陰性反應(yīng)時(shí)，Colilert會(huì)變成微黃色

Quanti-Tray?定量盤方法從定量盤的標(biāo)識(shí)處打開

請(qǐng)把未用完之定量盤留置包裝袋內(nèi)

若要開啟定量盤，請(qǐng)?jiān)诙勘P的最上方壓制“U”型在將樣品倒入。請(qǐng)注意：封口盤的塑料是不易碎的，但背面的鋁箔封是易碎的。用筆在定量盤背面作標(biāo)識(shí)

勿觸碰定量盤里面

在細(xì)菌培養(yǎng)器堆起定量盤，但勿裝入箱中

計(jì)算所有陽(yáng)性格子

免費(fèi)提供Quanti-Tray/2000

軟件

Quanti-Tray?廢棄物處理方式

請(qǐng)遵守地方法規(guī)

陰性反應(yīng)盤可依一般廢棄物丟棄

陽(yáng)性反應(yīng)盤丟棄前應(yīng)以高溫高壓滅菌方式(Autoclave)或混合清水的家用漂白劑處理程控定量封口機(jī)維護(hù)清理多余溢出的液體

插入的橡膠圈可用漂白劑、酒精清潔或以高溫高壓處理

封口機(jī)是鋁合金及不銹鋼制成，因此可用清水、酒精及漂白劑清洗傳統(tǒng)用法的步驟

vs.

ColilertIDEXX

于1984年成立于美國(guó)緬因州，年?duì)I業(yè)額為7億美元,在美國(guó)納斯達(dá)克上市全球有超過3，000名員工,400多種的產(chǎn)品行銷于70以上個(gè)國(guó)家IDEXX

有龐大的研發(fā)團(tuán)隊(duì)并有40-50位具有專業(yè)執(zhí)照的博士致力于簡(jiǎn)易、快速、精準(zhǔn)具經(jīng)濟(jì)效益之測(cè)試產(chǎn)品研發(fā)檢測(cè)及診斷試劑和相關(guān)設(shè)備的全球市場(chǎng)領(lǐng)導(dǎo)者

水質(zhì)

食品

寵物及經(jīng)濟(jì)動(dòng)物愛德士公司(IDEXX)簡(jiǎn)介

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