香蕉穿孔線蟲監(jiān)測(cè)方法

PAGEPAGE4香蕉穿孔線蟲監(jiān)測(cè)方法（試行）為規(guī)范香蕉穿孔線蟲監(jiān)測(cè)工作，及時(shí)發(fā)現(xiàn)新疫情，準(zhǔn)確掌握疫情擴(kuò)散、分布及發(fā)生動(dòng)態(tài)，特制定本監(jiān)測(cè)方法。本方法，適用于全省各地開展香蕉穿孔線蟲監(jiān)測(cè)。1監(jiān)測(cè)準(zhǔn)備收集當(dāng)?shù)靥炷闲强啤ⅧP梨科、芭蕉科、香蕉、甘蔗等觀賞植物和農(nóng)作物的種植情況，以及香蕉穿孔線蟲的發(fā)生歷史和現(xiàn)狀等有關(guān)資料，制定監(jiān)測(cè)計(jì)劃。2監(jiān)測(cè)區(qū)域2.1未發(fā)生區(qū)重點(diǎn)監(jiān)測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域，包括曾發(fā)生過(guò)疫情的花卉生產(chǎn)、銷售基地，境外引進(jìn)天南星科、竹芋科、鳳梨科、棕櫚科和芭蕉科等觀賞植物的集中銷售場(chǎng)所和種植地區(qū)。主要監(jiān)測(cè)是否傳入香蕉穿孔線蟲。2.2發(fā)生區(qū)重點(diǎn)監(jiān)測(cè)發(fā)生疫情的花卉生產(chǎn)和銷售基地。主要監(jiān)測(cè)香蕉穿孔線蟲的發(fā)生動(dòng)態(tài)和擴(kuò)散趨勢(shì)。3監(jiān)測(cè)范圍重點(diǎn)監(jiān)測(cè)天南星科、竹芋科、鳳梨科、棕櫚科和芭蕉科等觀賞植物種植區(qū)和銷售場(chǎng)所。4監(jiān)測(cè)時(shí)期寄主植物的生長(zhǎng)期，一般全年都可進(jìn)行監(jiān)測(cè)。5監(jiān)測(cè)工具工具：鏟、枝剪、砍刀、聚乙烯塑料袋、油性筆、標(biāo)簽、記錄本等。6監(jiān)測(cè)方法6.1未發(fā)生區(qū)監(jiān)測(cè)方法6.1.1訪問(wèn)調(diào)查向花卉生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者、鄉(xiāng)鎮(zhèn)農(nóng)技人員等詢問(wèn)調(diào)查當(dāng)?shù)靥炷闲强频然ɑ苤参锏姆N植和病蟲害發(fā)生情況，特別是苗木來(lái)源和是否有香蕉穿孔線蟲發(fā)生的癥狀，做好訪問(wèn)調(diào)查記錄，分析是否存在香蕉穿孔線蟲可疑發(fā)生區(qū)。對(duì)詢問(wèn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的香蕉穿孔線蟲可疑發(fā)生地區(qū)進(jìn)行深入重點(diǎn)調(diào)查。6.1.2踏查對(duì)訪問(wèn)調(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的香蕉穿孔線蟲可疑發(fā)生區(qū)和其他有代表性的花卉種植和銷售地區(qū)進(jìn)行踏查（目測(cè)觀察）。在花卉生長(zhǎng)期進(jìn)行2-3次踏查，踏查數(shù)量一般應(yīng)不少于種植面積（株數(shù)）的50%。如果發(fā)現(xiàn)癥狀，詳細(xì)記錄所發(fā)現(xiàn)的可疑癥狀（附表1），發(fā)病程度，出現(xiàn)的地點(diǎn)，表現(xiàn)癥狀的面積（株數(shù)），確定疑似發(fā)生區(qū)。6.1.3定點(diǎn)調(diào)查對(duì)踏查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的疑似發(fā)生區(qū)和其他高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域進(jìn)行定點(diǎn)調(diào)查。用GPS確定需定點(diǎn)調(diào)查區(qū)域的地理位置，從苗期開始，在植物生長(zhǎng)期采用5點(diǎn)取樣法或隨機(jī)取樣法進(jìn)行2次以上調(diào)查，統(tǒng)計(jì)疑似發(fā)病株率。結(jié)果記入附表1，同時(shí)，對(duì)疑似病株按照附錄2方法取樣，進(jìn)行室內(nèi)檢測(cè)鑒定。6.1.4經(jīng)鑒定一旦發(fā)現(xiàn)確認(rèn)新疫情，相應(yīng)區(qū)域按發(fā)生區(qū)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。6.2發(fā)生區(qū)監(jiān)測(cè)方法6.2.1發(fā)生區(qū)范圍監(jiān)測(cè)參照6.1各方法采取訪問(wèn)調(diào)查、踏查和定點(diǎn)調(diào)查。6.2.2發(fā)生區(qū)發(fā)生動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)對(duì)發(fā)生區(qū)及其邊界區(qū)域，每月調(diào)查一次，監(jiān)測(cè)香蕉穿孔線蟲的發(fā)生動(dòng)態(tài)。6.3調(diào)查取樣對(duì)調(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的疑似病株和無(wú)明顯癥狀的植物按照附錄1的方法取樣，填寫附表1，并附上田間癥狀照片。7疫情診斷7.1現(xiàn)場(chǎng)診斷在種植、銷售場(chǎng)地，對(duì)香蕉穿孔線蟲的寄主植物進(jìn)行調(diào)查，觀察其生長(zhǎng)狀況，對(duì)地上部分表現(xiàn)疑似癥狀的植株，采集其根部和根際介質(zhì)（土壤）；若地上部無(wú)明顯癥狀表現(xiàn)的，則隨機(jī)抽取部分植株，觀察其根部生長(zhǎng)狀況并采集根和根際介質(zhì)（土壤），并根據(jù)附錄2的方法進(jìn)行抽樣送實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，將現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)抽樣結(jié)果填入附表1。7.2樣品保存采集的植物材料和生長(zhǎng)介質(zhì)樣品放入聚乙烯塑料袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室分離，樣品若不能及時(shí)分離，可將樣品放在20℃～25℃的室內(nèi)，將袋口打開透氣，并注意保濕和避免陽(yáng)光照射，樣品保存時(shí)間不要超過(guò)17.3室內(nèi)鑒定按附錄3的方法分離樣品中的線蟲，采用形態(tài)學(xué)鑒定或分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。鑒定有困難的，送省級(jí)植物檢疫機(jī)構(gòu)或其委托的科研教學(xué)單位鑒定，并詳細(xì)填寫附表2。8監(jiān)測(cè)記錄各監(jiān)測(cè)點(diǎn)詳細(xì)記錄調(diào)查監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)并填寫附表1，將原始調(diào)查記錄表連同相關(guān)照片、影像等資料妥善保存于縣級(jí)植物檢疫機(jī)構(gòu)備查。9監(jiān)測(cè)報(bào)告縣級(jí)植物檢疫機(jī)構(gòu)對(duì)轄區(qū)各監(jiān)測(cè)點(diǎn)的監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行整理匯總按要求上報(bào)。經(jīng)鑒定確認(rèn)發(fā)生新疫情時(shí)，應(yīng)立即上報(bào)。PAGEPAGE13雌蟲：雄蟲：幼蟲：A——整體B——整體M——側(cè)區(qū)C,D——頭部E,F——頭部G——頭部頂面觀H——頭部頂面觀I~K——尾部L——尾部N——側(cè)區(qū)雌蟲：雄蟲：A—頭部，C—尾部B—頭部，DE—尾部附錄1：香蕉穿孔線蟲形態(tài)、生物學(xué)特性及防治措施等1病原特征香蕉穿孔線蟲隸屬于線蟲門(Nematoda)、側(cè)尾腺綱(Secernentea)、墊刃目(Tylenchida)、短體科(Pratylenchidae)、穿孔屬(RadopholusThorne,1949)，學(xué)名Radopholussimiles。雌蟲：蟲體呈線形，從蟲體中部向兩端略漸變細(xì)；熱殺死后，蟲體直或稍向腹面彎。體環(huán)紋清楚；側(cè)區(qū)有4條深淺、粗細(xì)均勻的側(cè)線，部分有網(wǎng)格，側(cè)區(qū)中帶與外帶基本等寬；頭部低，前端平圓，不縊縮或略縊縮，頭環(huán)3～4個(gè)，頭架骨化強(qiáng)；口針和基部球發(fā)達(dá)，食道發(fā)育正常，中食道球卵圓形、有顯著的中食道球瓣，后食道腺長(zhǎng)葉狀從背面或背側(cè)面覆蓋腸；陰門顯著，雙生殖腺、對(duì)伸，受精囊球形、有桿狀的精子；尾通常呈長(zhǎng)圓錐形，偶爾呈近圓柱形，尾的平均長(zhǎng)度通常超過(guò)52m，尾后部透明區(qū)平均長(zhǎng)度通常超過(guò)雄蟲：蟲體呈線形，熱殺死后蟲體直或略向腹面彎。頭部高圓、呈球形，顯著縊縮，具3～5個(gè)頭環(huán)，頭架骨化弱或不明顯；側(cè)線4條；口針和食道顯著退化，口針基部球不明顯或無(wú)；中食道球不清楚；單精巢，前伸，交合刺柄強(qiáng)狀，引帶伸出泄殖腔、末端有小爪狀突，交合傘伸到尾部約2/3處；尾呈長(zhǎng)圓錐形，尾端部形態(tài)多樣，末端鈍圓或有一指狀突。2寄主范圍香蕉穿孔線蟲的寄主范圍非常廣泛，超過(guò)360多種。主要為害的農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物包括香蕉(Musaspp.)、胡椒(Pipernigrum)、柑橘(Citruspp.)、柚子(Citrusmaxima)、檸檬(Citruslimon)、菠蘿(Ananascomosus)、甘蔗(Sacchanumofficinanum)、荔枝(Litchichinensis)、椰子樹(Cocosnucifera)、檳榔樹(Arecacathecu)、可可(Theobromacacao)、咖啡(Coffeaarabica)、茶樹(Camelliasinensis)、生姜(Zingiberofficinale)、花生(Arachishypogaea)、番茄(Lycopersiconesculentum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)等數(shù)10種，此外還嚴(yán)重危害天南星科(Araceae)、竹芋科(Marantaceae)、棕櫚科(Palmae)、芭蕉科(Musaceae)和鳳梨科(Bromeliaceae)的觀賞植物。3為害癥狀不同的寄主植物被香蕉穿孔線蟲危害后所表現(xiàn)的癥狀不完全相同。香蕉植株根部被侵染后，根表面產(chǎn)生紅褐色略凹陷的斑痕，并出現(xiàn)邊緣稍凸起的縱裂縫，將病根縱切開，可見(jiàn)皮層上有紅褐色條斑，隨著病害的發(fā)展，根組織變黑腐爛；香蕉植株地上部表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢，葉片小、枯黃，座果少，果實(shí)小，由于根系被破壞，固著能力弱，蕉株易搖擺、倒伏或翻蔸，故香蕉穿孔線蟲病又稱為“黑頭倒伏病”(blackheadtopingdisease)。柑橘被侵染后，受害根部腫脹，侵染點(diǎn)產(chǎn)生黑色傷痕，根表皮容易脫落，根系萎縮；地上部葉片稀少，葉片小、僵硬和黃化，樹枝末端葉落枯死，季節(jié)性新梢生長(zhǎng)差，開花數(shù)不受影響，但座果少，并且果實(shí)小、很少成熟，病樹呈衰退現(xiàn)象，在土壤缺水和干旱季節(jié)易迅速萎蔫。在發(fā)病柑橘園中，該病以每年約15m的速度擴(kuò)散，故柑橘穿孔線蟲病又稱為柑橘擴(kuò)散性衰退?。╯preadingdecline）。胡椒被侵染后，細(xì)嫩的營(yíng)養(yǎng)根表現(xiàn)出明顯的橙色到紫色斑痕，老根上的斑痕呈棕色、不明顯，根系大量腐爛，細(xì)嫩的營(yíng)養(yǎng)根比主根腐爛快，隨后較大的側(cè)根大量壞死；地上部表現(xiàn)為葉片變黃、下垂，隨后落葉、落花、生長(zhǎng)停止，最后死亡。其它寄主植物被害，一般表現(xiàn)為根部出現(xiàn)大量空腔，韌皮部和形成層可完全毀壞，出現(xiàn)充滿線蟲的間隙，使中柱的其余部分與皮層分開，根部壞死斑呈橙色、紫色或褐色，根部壞死處外部形成裂縫，根腐爛；地上部一般表現(xiàn)為葉片縮小、變色、新枝生長(zhǎng)弱等衰退癥狀或整株萎蔫。4傳播途徑遠(yuǎn)距離傳播靠帶蟲的種植材料以及所沾附的土壤，是新病區(qū)的主要初侵染源，也是病區(qū)再次蔓延的蟲源。在田間，該線蟲還可以通過(guò)植物根系伸長(zhǎng)和相互絞織接觸傳染，水流、農(nóng)事操作和線蟲自身的活動(dòng)也可以傳播。5生物學(xué)特性香蕉穿孔線蟲是遷移型內(nèi)寄生線蟲，主要侵染為害植物的根和球莖等地下組織，雌蟲和二齡及其以上幼蟲均有侵染能力，在寄主植物內(nèi)和土壤中都能完成生活史。香蕉小種在香蕉根部，在24℃～32℃時(shí)的生活史為20～25天；柑橘小種在柑橘根部，24℃～27℃時(shí)的生活史為10～20天。通常該線蟲繁殖和侵染寄主的最適溫度為24℃，最低溫度為12℃，最高溫度為29.5℃～32.5℃；在田間，該線蟲在潮濕土壤(27℃～36℃)中可存活6個(gè)月，在干燥土壤(29℃～39℃)中能存活1個(gè)月；在溫室中，該線蟲在潮濕土壤(25.5℃～28.5℃)中可存活15個(gè)月，在干燥土壤6防控措施（1）嚴(yán)格檢疫：對(duì)來(lái)自疫區(qū)的植物種植材料進(jìn)行嚴(yán)格細(xì)致的檢查，或禁止疫區(qū)的寄主植物種植材料和土壤進(jìn)入無(wú)病區(qū)。（2）檢疫處理：一旦發(fā)現(xiàn)這種線蟲傳入，要立即向政府和檢疫部門報(bào)告，并及時(shí)采取封鎖和鏟除措施。對(duì)發(fā)生疫情的花場(chǎng)、苗圃、果園、田塊，采取嚴(yán)格的控制措施全面銷毀發(fā)病花場(chǎng)、苗圃、果園、田塊中的染疫或可能染疫植物，禁止可能受污染的植物和土壤、工具外傳，防止疫情擴(kuò)散蔓延。清除土壤中植物的根莖殘?bào)w并集中銷毀，土壤用溴甲烷、必速滅或線克等熏蒸性殺線蟲劑處理，并覆蓋黑色薄膜，保持土壤無(wú)雜草等任何活的植物至少6個(gè)月，在侵染區(qū)和非侵染區(qū)之間建立寬5～18m的“隔離帶”。（3）疫區(qū)防治：主要防治措施包括農(nóng)業(yè)防治、種苗處理和化學(xué)防治。農(nóng)業(yè)防治主要是加強(qiáng)栽培管理，增施有機(jī)肥，對(duì)于觀賞植物，要用經(jīng)過(guò)有效消毒的介質(zhì)，并將花盆上架；對(duì)大田作物，可通過(guò)培育淺根系植株減少線蟲的侵染。種苗處理可以采用溫水或殺線劑浸根及其它地下組織，如，香蕉的吸芽可以用53℃～55℃溫水浸20min，也可以將吸芽或球莖在益舒寶60×10-5溶液中浸20min或在25×10-5苯線磷溶液中浸10min；柑橘苗根部可用55℃溫水浸10min，然后轉(zhuǎn)入冷水中處理10min；也可以用益舒寶10×10-5溶液浸30～60min?；瘜W(xué)防治主要是用殺線蟲劑如克線磷附錄2：調(diào)查抽樣方法當(dāng)田間或溫室（大棚）內(nèi)地栽的植物表現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，在發(fā)病點(diǎn)的病株根部，采集表現(xiàn)癥狀的根及其周圍的土壤。對(duì)盆栽的觀賞植物，當(dāng)無(wú)明顯癥狀表現(xiàn)時(shí)，隨機(jī)抽取長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較弱的植株，采集其根和根際介質(zhì)（或土壤），抽樣率按植株數(shù)＞10000株（盆）抽3%～5%，植株數(shù)為100～10000株（盆）抽6%～10%，植株數(shù)＜100株（盆）抽樣最低數(shù)不少于10株（盆）（植株數(shù)不足最低數(shù)的全部抽樣），每株（盆）采集根5g～10g和根際介質(zhì)（或土壤）50g～100g，每40～50株（盆）植物的根和根際介質(zhì)（或土壤）分別混合成1個(gè)根樣和1個(gè)土樣。當(dāng)抽樣數(shù)少于100株（盆）時(shí)，至少組成2個(gè)混合樣品。當(dāng)盆栽的花卉表現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，可以采集整個(gè)病株的根系及其周圍的介質(zhì)（或土壤）做為1個(gè)獨(dú)立的樣品。采集的樣品放在塑料袋中封好袋口，貼上標(biāo)簽，防止不同樣品相混。當(dāng)田間或溫室（大棚）內(nèi)地栽的植物沒(méi)有明顯癥狀表現(xiàn)時(shí)，可采用對(duì)角線、棋盤式、平行跳躍式或拉鏈?zhǔn)诫S機(jī)取樣方法，確定取樣點(diǎn)，在1hm2～2hm2的地塊上至少取20～30個(gè)點(diǎn)，在取樣點(diǎn)的植株根部，鏟去表層土壤、雜草和其它雜物，取營(yíng)養(yǎng)根10g~20g，根際土壤100~200g，將各點(diǎn)土壤混合均勻后，倒去部分土壤，保留1000g~2000g土壤作為一個(gè)土樣，根放在一起作為1個(gè)根樣。可根據(jù)植物根系的深淺，采集營(yíng)養(yǎng)根或須根及其周圍土壤。附錄3：香蕉穿孔線蟲分離方法1直接解剖法將表現(xiàn)可疑癥狀的病根表面洗凈，剪成1cm～2cm小段，放在裝有適量清水的培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下用鑷子和解剖針?biāo)洪_組織，線蟲就會(huì)從組織中游到水中，挑取若干條線蟲置于凹玻片上，制成臨時(shí)玻片供鑒定用。2淺盤貝曼漏斗法在漏斗下面接一段乳膠管，乳膠管上裝一個(gè)止水夾，或在乳膠管另一端套一個(gè)小試管，在漏斗中裝清水至邊沿1cm～2cm處，將漏斗置于架上，趕除乳膠管中的氣泡；將面巾紙鋪在淺篩盤上，然后將土壤、介質(zhì)或剪成1cm長(zhǎng)的根平鋪在淺盤上；將裝著樣品的篩盤輕輕放在漏斗上,若漏斗中的水不能浸沒(méi)樣品，則沿漏斗壁輕輕注入清水，使漏斗中的水剛好浸沒(méi)樣品；根組織也可用小型攪拌機(jī)攪碎后再用淺盤漏斗法分離。線蟲由于其趨水性、鉆孔性和自身的重量下沉至漏斗下的乳膠管或小試管中，24h~48h后，用小培養(yǎng)皿接在乳膠管下，松開止水夾，收集線蟲懸浮液，或直接把乳膠管下的小試管取下。3過(guò)篩——淺盤貝曼漏斗法將土壤樣品放入大小適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)，加水充分淘洗，靜置30s～1min后，將上面的懸浮液通過(guò)20目的篩子倒入第二個(gè)容器中，在第一個(gè)容器內(nèi)加入適量清水重復(fù)上述步驟，并用水沖洗篩子，將濾渣里的線蟲盡可能沖洗到第二個(gè)容器中，然后充分?jǐn)噭?dòng)第二個(gè)容器中的混合液使之懸浮，靜置30s～1min后，將懸浮液過(guò)400目的篩子，再在第二個(gè)容器中加適量清水，重復(fù)此步驟，之后用水充分沖洗篩子上的濾渣去除土壤顆粒，再用淺盤貝曼漏斗法進(jìn)一步分離400目篩上的濾渣。此法對(duì)粘性土壤中線蟲的分離效果較好。附錄4：植物線蟲的分離與固定1線蟲的殺死將分離所得的線蟲懸浮液放在試管中，把試管置于試管架上靜止1h～2h，待線蟲沉底后，用吸管小心地吸去上清液，試管底部保留約2cm高的懸浮液，然后將試管放入60℃～65℃的水浴箱中2min～3min殺死少量的線蟲可將線蟲放在凹玻片上的水滴中，手持凹玻片在灑精燈的火焰上來(lái)回5s～6s鐘即可，加熱過(guò)程中，要不斷用手背接觸玻片，感覺(jué)稍燙手即可。加熱過(guò)度會(huì)破壞線蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)，影響觀察。2線蟲的固定已殺死的線蟲必須及時(shí)用固定液固定，防止蟲體腐爛，保持蟲體的形態(tài)不變和內(nèi)部器官的清晰。固定液種類較多，常用的有4%甲醛溶液（福爾馬林:蒸餾水=1:9）、TAF（三羥基乙胺:福爾馬林:蒸餾水=2:7:91）和FG（福爾馬林:甘油:蒸餾水=10:1:89）。少量線蟲被加熱殺死后，可用挑針將線蟲移到固定液中固定，大量的線蟲被加熱殺死后，在線蟲懸浮液中加等量的濃度雙倍的固定液（如8%的甲醛溶液