CRISPR-Cas英教學講解課件

CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其應用CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介CRISPR-Cas系統(tǒng)作用機理CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構建載體構建、導入目的生物或細胞系、篩選CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應用CRISPR-Cas9系統(tǒng)的不足之處提高打靶特異性的策略小結CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介1CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介1.1CRISPR-Cas系統(tǒng)的來源

成簇規(guī)律間隔短回文重復序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種廣泛存在于細菌與古細菌中的，由RNA介導的、可遺傳的獲得性免疫系統(tǒng)。1CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介1.2

CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史1987年，日本課題組在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中，2002年，正式將其命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列2005年發(fā)現(xiàn)CRISPR的間隔序列(spacer)與宿主菌的染色體外的遺傳物質高度同源，推測細菌可能通過CRISPR系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遺傳物質的入侵。2007年，Barrangou等首次發(fā)現(xiàn)細菌可能利用CRSPR系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵；2008年，Marraffini等發(fā)現(xiàn)細菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質粒的轉移，首次利用實驗驗證了CRISPR系統(tǒng)的功能2013年初，MIT

的研究組首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對人293T細胞EMX1

和PVALB基因以及小鼠Nero2A細胞Th基因實現(xiàn)了定點突變。同年Mali利用CRISPR/Cas9在人293T細胞和K652細胞基因的靶位點形成雙鏈或單鏈的切口，從而激活細胞的DNA修復機制高效介導外源基因定點插入。1.2CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史1.3

CRISPR-Cas系統(tǒng)的結構CRISPR-CAS系統(tǒng)的組成主要包括:由不連續(xù)的重復序列R(repeat)與長度相似的間區(qū)序列S(spacers)間隔排列而成的CRISPR簇，前導序列L(leader)以及一系CRISPR相關蛋白基因cas。

1.3CRISPR-Cas系統(tǒng)的結構CRISPR-C

1.4

CRISPR-Cas系統(tǒng)的類型CRISPR/Cas系統(tǒng)有3種類型，其中，產膿鏈球菌的TypeⅡ型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸內切酶，已經在人類細胞、小鼠、斑馬魚中成功實現(xiàn)了基因組定點修飾，目前被廣泛應用于真核細胞的基因組編輯中。Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)包含3個主要基因位點:編碼相關蛋白的位點（Cas9、Cas1、Cas2、Csn2），編碼含重復片段的小RNA位點（CRISPR位點）和1個輔助小片段RNA(tracrRNA位點)。1.4CRISPR-Cas系統(tǒng)的類型CRISPR/Cas2CRISPR-CAS系統(tǒng)的作用機理2.1適應：間隔序列的獲得當外源DNA片段入侵后，CRISPR/Cas識別入侵的核酸和掃描外源DNA潛在的PAM（NGG序列），將臨近PAM

的序列作為候選protospacer，然后在CRISPR基因座的5'端合成重復序列，再將該DNA的1個片段(約20bp)整合到兩個重復序列之間，從而使得菌體擁有“記憶”。2CRISPR-CAS系統(tǒng)的作用機理2.1適應：間隔序2.2表達：表達并加工CRISPR

CRISPR區(qū)域首先轉錄成前體RNA(pre-crRNA)，之后被Cas蛋白剪切成更小的crRNA，即成熟的crRNA，包含1個間隔序列和部分重復序列。同時，tracrRNA

也會被轉錄并和crRNA形成一種雙鏈的RNA結構，再與Cas9蛋白組成具有DNA內切酶活性的復合物。2.2表達：表達并加工CRISPR

CRISPR區(qū)2.3干擾:干擾入侵核酸

復合物在crRNA的引導下，由Cas9

蛋白的核酸結構域對外源DNA分子進行切割。

首先RNA/Cas9復合體沿外源入侵DNA進行掃描，當遇到PAM序列且DNA序列可與crRNA互補配對形成一個R環(huán)時，Cas9蛋白將分別利用HNH與RuvC結構域對DNA的互補鏈與非互補鏈進行切割，而形成DNA的雙鏈斷裂。2.3干擾:干擾入侵核酸

復合物在crRNAPAM（Protospaceradjacentmotif）

在嗜熱鏈球菌中，PAM序列多數為5‘-NGG，而5’-NAG雖然效率低一些，但也可用于靶DNA的定位，可擴展在基因組編輯中靶DNA的選擇范圍。介導切割效率依次為：NGG>NGA>NAG人類基因組中每8bp就會出現(xiàn)一個PAM在Ⅰ型與Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)中，自身基因組CRISPR序列的下游無PAM序列，從而將自身基因組DNA序列與外源DNA序列區(qū)分開，避免自我免疫。PAM（ProtospaceradjacentmotifcrRNA

成熟crRNA可分為5’手柄、3’發(fā)卡結構和間隔序列，5’手柄具有保守性，3’發(fā)卡是核酸內切酶識別位點，5’端重復序列均質性較3’端好，其與PAMs一起保護自身CRISPR序列不被誤切。crRNA末端還含有一段起“種子區(qū)”作用的序列，它決定著尋找靶基因的效率，該區(qū)域僅需1個位點發(fā)生突變即極可能無法正確識別靶基因，但在種子區(qū)外發(fā)生少量突變則不容易導致識別功能失效。CRISPR/Cas9對靶點的識別需要PAM(NGG)和靠近PAM的11bp的種子序列完全保守，14bp(PAM+種子序列)序列中的任何一個堿基突變之后CRISPR/Cas9的切割效率基本降至零。crRNA

成熟crRNA可分為5’手柄、3’發(fā)卡結構和間

tracrRNA(trans-activatingcrRNA)指導RNaseⅢ和Cas9完成前體crRNA的成熟。tracrRNA對靶點的識別和切割是必需的，tracrRNA的5'端與成熟的crRNA3'端有部分序列(約13bp)能夠配對進而形成莖環(huán)結構，對維持crRNA與靶點的配對可能十分重要。

tracrRNA(trans-activatingcrRCas9蛋白

900-1600個氨基酸組成的多結構域蛋白

Cas9REC--在REC識別區(qū)中的一個富含精氨酸的α-螺旋負責與RNA-DNA異源二聚體的3‘端8～12個核苷酸的結合HNH結構域--在crRNA互補鏈PAM元件上游3nt處切割。位于HNH結構域的H840A突變體可導致HNH結構域的失活RuvC結構域--在非互補鏈PAM元件上游的3～8nt處切割。位于RuvC結構域中的D10A突變體可導致RuvC結構域的失活。（RuvC則分為3個亞結構域:RuvCⅠ位于蛋白的N端，RuvCⅡ/Ⅲ分別位于HNH結構域的兩側）PAM結合區(qū)Cas9蛋白

900-1600個氨基酸組成的多結構域蛋白

CRISPR-Cas英教學講解課件3CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構建

3.1sgRNA設計目前，大多數研究將與靶DNA互補的crRNA與tracrRNA融合為一條單獨的引導RNA(singleguideRNA，sgRNA).將sgRNA設計為100nt左右，包含位于5'端20nt的DNA互補區(qū)、crRNA以及位于3'端70～80nt的tracrRNA。通常設計的sgRNA具有二級發(fā)卡結構和1條3'端尾，設計的sgRNA與靶基因有1～3個堿基錯配并不影響編輯效率，但是，靠近PAM元件的12個堿基要嚴格配對.3CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構建

3.1sgRcrRNA/tracrRNA/Cas9sgRNA/Cas9crRNA/tracrRNA/Cas9sgRNA/Cas9目前(2014.10)報道的CRISPR/Cas系統(tǒng)中使用的gRNA有2種結構，一種是M.Jinek等最先提出的，將一部分重復序列和一部分tracrRNA的序列直接拼接到一起形成的嵌合RNA結構。目前(2014.10)報道的CRISPR/Cas系統(tǒng)中使用的另一種與第一種基本相同，只是3‘端更長，添加了完整的tracrRNA序列.關于2種結構的優(yōu)劣，麻省理工學院張峰研究團隊做了細致的研究，他們發(fā)現(xiàn)，3’端越長，gRNA表達豐度越高，相應的打靶效率也越高。為了保證足夠的打靶活性，推薦gRNA的3’端長度不低于67nt為好，而長度為85nt時效率最高.另一種與第一種基本相同，只是3‘端更長，添加了完整的trac在設計Guide序列時，需要特別注意第一個堿基必須是G，如果您選取的Guide序列的第一個堿基不是G，需要自行加上一個G，因為這個G對于起始轉錄非常重要。在線工具設計：麻省理工學院的CRISPRDesign：/德國癌癥研究中心的E-Crisp：/E-CRISP/designcrispr在設計Guide序列時，需要特別注意第一個堿基必須是G，如果3.2NLSCas9蛋白來源于細菌，因此要讓Cas9蛋白高效地轉運到哺乳動物細胞核內，需要在Cas9蛋白的N端或是C端加上真核細胞的核定位信號。對于添加NLS信號的位置，目前尚存在爭議。L.CONG的研究發(fā)現(xiàn)，在Cas9蛋白的N端和C端同時添加NLS信號最能有效的指導Cas9蛋白入核。而P.Mali等在Cas9蛋白的C端添加１個NLS信號構建的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在人類的細胞中最高可以達到25%的敲除效率，表明在C端添加１個NLS信號是足以引導Cas9蛋白進入核中的。但是南京大學的研究人員卻發(fā)現(xiàn)，無論是在Cas9蛋白的N端添加3個還是在N端、C端同時添加SV40核定位信號均不能使Cas9蛋白進入293T細胞的細胞核中，只有在N端添加核定位信號并且在核定位信號和Cas9蛋白之間加上32個氨基酸殘基的接頭才能指導Cas9蛋白入核。這些不一致的結果有可能是由于各個研究中FLAG標簽添加位置的不同引起的，但同時也說明Cas9蛋白在折疊過程中可能干擾了NLS信號識別。3.2NLSCas9蛋白來源于細菌，因此要讓Cas9蛋4載體構建、導入目的生物或細胞系、篩選

4.1載體構建Cas9蛋白和gRNA的表達框可以分開放到2個載體上，也可以直接構建在同1個載體上，方便Cas9蛋白和gRNA的協(xié)同表達。

這2種策略各有好處。比如，構建在同一載體上有利于Cas9蛋白和gRNA的協(xié)同表達，這一點非常適合于難轉染的細胞。而分開放在2個表達載體上則能更方便快速的對候選的gRNA進行打靶效率和脫靶情況的檢測。構建gRNA時，只要基因的序列連接到gRNA骨架上，或者直接合成帶有靶序列的gRNA再連接到表達載體上即可。4載體構建、導入目的生物或細胞系、篩選

4.1載體構4.2導入目的生物或細胞系在人工培養(yǎng)的哺乳細胞中，可通過電穿孔(electroporation)、核轉染(nucleofection)與脂質體介導轉染等方法將非自主復制的質粒DNA導入細胞中，使Cas9與sgＲNA可進行瞬時表達。慢性病毒載體(lentiviralvectors)也已用于在人類或小鼠細胞中組成型表達Cas9與sgＲNA。體外轉錄的ＲNA也可直接注射導入斑馬魚、果蠅或小鼠的胚胎細胞中質粒越大，成功率越低4.2導入目的生物或細胞系4.3篩選

將Cas9、引導ＲNA以及一條含有突變位點的靶DNA的同源重組修復模板共同轉化到目的菌株中。若在Cas9對基因組靶DNA序列產生DNA雙鏈斷裂后，可利用導入的同源重組修復模板進行DNA修復，由于修復模板在識別互補區(qū)或PAM位點中存在突變位點而不能被Cas9再次切割，因而可存活;而未能進行同源重組修復的基因組則由于Cas9的切割降解，無法存活。利用該方法可明顯提高基因組編輯后的篩選效率，且在基因組中不殘留篩選標記。4.3篩選5CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應用基因組編輯技術是一種可以在基因組水平上對DNA序列進行改造的遺傳操作技術。這種技術的原理是構建一個人工內切酶，在預定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細胞內的DNA修復系統(tǒng)修復過程中會產生突變，從而達到定點改造基因組的目的。通過修復途徑，基因組編輯技術可以實現(xiàn)三種基因組改造，即基因敲除，特異突變的引入和定點轉基因5.1CRISPR-Cas9介導的基因組精確編輯技術5CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應用基因組編輯技術是一種可以例子：基因敲除的實驗過程1.在靶基因序列中尋找NGG序列獲得其附近20多個堿基的序列，設計出sgRNA并合成該序列2.將sgRNA及cas9基因連入載體3.轉化感受態(tài)，質粒小提，測序驗證4.細胞培養(yǎng)與細胞轉染5.敲除效果檢測6.建立穩(wěn)定敲除的細胞株例子：基因敲除的實驗過程1.在靶基因序列中尋找NGG序列獲得5.2CRISPR-Cas9介導的轉錄抑制與轉錄激活

抑制：在CRISPR/Cas9的Ⅱ型系統(tǒng)中將Cas9中的切割域突變，會使Cas9蛋白失去對ＤＮＡ的切割活性，但不影響其與ＤＮＡ結合的能力。這種失去ＤＮＡ切割活性的Cas9蛋白被命名為DeadＣas9。將ｄCas9與gRNA在細胞中共表達，則gRNA可以介導ｄCas9蛋白與ＤＮＡ結合。如果ｄCas9結合到靶基因的閱讀框內，可阻斷RNA聚合酶的延伸作用；如果ｄCas9結合到靶基因的啟動子區(qū)域則可阻止基因轉錄的起始.5.2CRISPR-Cas9介導的轉錄抑制與轉錄激活

抑制激活：將dCas蛋白與具有轉錄激活的蛋白質功能域融合則可構建具有轉錄激活活性的CRISPR-on系統(tǒng)。CRISPR轉錄激活系統(tǒng)的靶序列位置對激活效率有重要影響。當靶序列與啟動子的距離合適時，激活效率較高；靶序列處于啟動子上游較遠位置激活效率相對下降；當靶序列與啟動子距離過近，或處于開放閱讀框內時則會產生抑制效應。也就是說使用相同的CRISPR-on系統(tǒng)，不同的crRNA既可以對靶基因激活，也可以抑制靶基因表達。真核細胞的轉錄激活因子可通過將ｄCas9與單純皰疹病毒轉錄激活子ＶＰ16結合獲得。CRISPR-Cas英教學講解課件5.3單切口酶Cas9也可以改造成為單切口酶,只被一個Cas9n（Cas9n為D10A突變的突變體，只能切割與sgRNA直接互補的DNA單鏈）切割產生的單鏈缺口會被高保真性的堿基切除修復途徑(baseexcisionrepair,BER)修復，不會在基因組DNA上造成突變。5.3單切口酶Cas9也可以改造成為單切口酶,只被一個Ca5.4利用多個引導RNA序列可同時進行基因組上多個不同位點的編輯.5.5將CRISPR/Cas9技術與成像技術結合，利用dCas9的基因組定位功能，使小鼠或人的基因組的元件可視化，用于監(jiān)測活體中各元件的動態(tài)變化基因組規(guī)模的功能篩選、特定染色體位點的標記等5.4利用多個引導RNA序列可同時進行基因組上多6CRISPR-Cas9系統(tǒng)的不足之處脫靶效應：早期研究認為crRNA的間隔序列(spacer)與外源DNA的靶位點完全互補配對對于切割是必需的，后來的研究證明spacer與protospacer部分互補配對時切割也可以發(fā)生。CRISPR/Cas系統(tǒng)對打靶位點距離PAM區(qū)較遠的5’區(qū)的識別特異性較低，當出現(xiàn)幾個堿基的錯配時，Cas9蛋白仍然會將序列切開，造成脫靶效應。

V.Pattanayak等的研究顯示，CRISPR/Cas復合體的濃度也與脫靶效應緊密相關。當CRISPR/Cas復合體的濃度較高時，即使錯配發(fā)生在PAM區(qū)內部或者靠近PAM區(qū)的位置，DNA切割也仍然會進行，而這種現(xiàn)象在低濃度時則不會發(fā)生。6CRISPR-Cas9系統(tǒng)的不足之處脫靶效應：早期研究局限性：

CRISPR/Cas9對目的序列的識別與結合必須有PAM的存在。這就使得該系統(tǒng)對基因組的靶向識別位點被限制在平均每8個堿基一個位點。局限性：問題CRISPR/Cas9來源于細菌，它是否會對哺乳動物細胞或個體產生毒性或是否會誘發(fā)哺乳動物細胞或個體的免疫反應？CRISPR/Cas系統(tǒng)是依賴ＤＮＡ復制或者轉錄過程將ＤＮＡ解螺旋還是本身就具有ＤＮＡ解旋能力？CRISPR/Cas9系統(tǒng)如何導入受體并保證CRISPR系統(tǒng)的組份能準確地到達DNA靶序列？如何突破PAM序列的限制、如何建立對Cas9特異性(脫靶效應)的全面評價體系、如何構建不同物種中可通用的Cas9與sgRNA導入與表達系統(tǒng)以及如何更有效的激活同源重組修復等。問題7提高打靶特異性的策略降低sgRNA與Cas9的濃度。這一方法的效果還有待討論。有研究表明該方法可顯著降低脫靶突變/打靶突變的比例，但也有研究稱該方法將同時降低脫靶突變與打靶突變的發(fā)生。利用Cas9的切口酶突變體產生DNA單鏈斷裂。因為與DNA雙鏈斷裂相比，DNA單鏈斷裂將誘導保真性更高的堿基切除修復。7提高打靶特異性的策略降低sgRNA與Cas9的濃度。麻省理工學院張峰實驗室的一種提高CRISPR/Cas系統(tǒng)特異性的新思路。他們開創(chuàng)性的提出，將突變的只能在雙鏈DNA上形成缺口的Cas9n蛋白（Cas9n為D10A突變的突變體，只能切割與sgRNA直接互補的DNA單鏈）配對使用，同時切割雙鏈DNA的正負鏈，形成５′端突出的雙鏈缺口。這一方法可以降低脫靶率50～1500倍，同時不影響基因敲除效率。麻省理工學院張峰實驗室的一種提高CRISPR/Cas系統(tǒng)特異8小結設計和構建方法簡單快捷，成本低廉?；蚓庉嬓蕛?yōu)于ＺＦＮｓ和ＴＡＬＥＮｓ系統(tǒng)?？赏瑫r實現(xiàn)多個基因的打靶。可以方便快捷的改造為基因表達調控工具。

8小結設計和構建方法簡單快捷，成本低廉。CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其應用CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介CRISPR-Cas系統(tǒng)作用機理CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構建載體構建、導入目的生物或細胞系、篩選CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應用CRISPR-Cas9系統(tǒng)的不足之處提高打靶特異性的策略小結CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介1CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介1.1CRISPR-Cas系統(tǒng)的來源

成簇規(guī)律間隔短回文重復序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種廣泛存在于細菌與古細菌中的，由RNA介導的、可遺傳的獲得性免疫系統(tǒng)。1CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介1.2

CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史1987年，日本課題組在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中，2002年，正式將其命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列2005年發(fā)現(xiàn)CRISPR的間隔序列(spacer)與宿主菌的染色體外的遺傳物質高度同源，推測細菌可能通過CRISPR系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遺傳物質的入侵。2007年，Barrangou等首次發(fā)現(xiàn)細菌可能利用CRSPR系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵；2008年，Marraffini等發(fā)現(xiàn)細菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質粒的轉移，首次利用實驗驗證了CRISPR系統(tǒng)的功能2013年初，MIT

的研究組首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對人293T細胞EMX1

和PVALB基因以及小鼠Nero2A細胞Th基因實現(xiàn)了定點突變。同年Mali利用CRISPR/Cas9在人293T細胞和K652細胞基因的靶位點形成雙鏈或單鏈的切口，從而激活細胞的DNA修復機制高效介導外源基因定點插入。1.2CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史1.3

CRISPR-Cas系統(tǒng)的結構CRISPR-CAS系統(tǒng)的組成主要包括:由不連續(xù)的重復序列R(repeat)與長度相似的間區(qū)序列S(spacers)間隔排列而成的CRISPR簇，前導序列L(leader)以及一系CRISPR相關蛋白基因cas。

1.3CRISPR-Cas系統(tǒng)的結構CRISPR-C

1.4

CRISPR-Cas系統(tǒng)的類型CRISPR/Cas系統(tǒng)有3種類型，其中，產膿鏈球菌的TypeⅡ型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸內切酶，已經在人類細胞、小鼠、斑馬魚中成功實現(xiàn)了基因組定點修飾，目前被廣泛應用于真核細胞的基因組編輯中。Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)包含3個主要基因位點:編碼相關蛋白的位點（Cas9、Cas1、Cas2、Csn2），編碼含重復片段的小RNA位點（CRISPR位點）和1個輔助小片段RNA(tracrRNA位點)。1.4CRISPR-Cas系統(tǒng)的類型CRISPR/Cas2CRISPR-CAS系統(tǒng)的作用機理2.1適應：間隔序列的獲得當外源DNA片段入侵后，CRISPR/Cas識別入侵的核酸和掃描外源DNA潛在的PAM（NGG序列），將臨近PAM

的序列作為候選protospacer，然后在CRISPR基因座的5'端合成重復序列，再將該DNA的1個片段(約20bp)整合到兩個重復序列之間，從而使得菌體擁有“記憶”。2CRISPR-CAS系統(tǒng)的作用機理2.1適應：間隔序2.2表達：表達并加工CRISPR

CRISPR區(qū)域首先轉錄成前體RNA(pre-crRNA)，之后被Cas蛋白剪切成更小的crRNA，即成熟的crRNA，包含1個間隔序列和部分重復序列。同時，tracrRNA

也會被轉錄并和crRNA形成一種雙鏈的RNA結構，再與Cas9蛋白組成具有DNA內切酶活性的復合物。2.2表達：表達并加工CRISPR

CRISPR區(qū)2.3干擾:干擾入侵核酸

復合物在crRNA的引導下，由Cas9

蛋白的核酸結構域對外源DNA分子進行切割。

首先RNA/Cas9復合體沿外源入侵DNA進行掃描，當遇到PAM序列且DNA序列可與crRNA互補配對形成一個R環(huán)時，Cas9蛋白將分別利用HNH與RuvC結構域對DNA的互補鏈與非互補鏈進行切割，而形成DNA的雙鏈斷裂。2.3干擾:干擾入侵核酸

復合物在crRNAPAM（Protospaceradjacentmotif）

在嗜熱鏈球菌中，PAM序列多數為5‘-NGG，而5’-NAG雖然效率低一些，但也可用于靶DNA的定位，可擴展在基因組編輯中靶DNA的選擇范圍。介導切割效率依次為：NGG>NGA>NAG人類基因組中每8bp就會出現(xiàn)一個PAM在Ⅰ型與Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)中，自身基因組CRISPR序列的下游無PAM序列，從而將自身基因組DNA序列與外源DNA序列區(qū)分開，避免自我免疫。PAM（ProtospaceradjacentmotifcrRNA

成熟crRNA可分為5’手柄、3’發(fā)卡結構和間隔序列，5’手柄具有保守性，3’發(fā)卡是核酸內切酶識別位點，5’端重復序列均質性較3’端好，其與PAMs一起保護自身CRISPR序列不被誤切。crRNA末端還含有一段起“種子區(qū)”作用的序列，它決定著尋找靶基因的效率，該區(qū)域僅需1個位點發(fā)生突變即極可能無法正確識別靶基因，但在種子區(qū)外發(fā)生少量突變則不容易導致識別功能失效。CRISPR/Cas9對靶點的識別需要PAM(NGG)和靠近PAM的11bp的種子序列完全保守，14bp(PAM+種子序列)序列中的任何一個堿基突變之后CRISPR/Cas9的切割效率基本降至零。crRNA

成熟crRNA可分為5’手柄、3’發(fā)卡結構和間

tracrRNA(trans-activatingcrRNA)指導RNaseⅢ和Cas9完成前體crRNA的成熟。tracrRNA對靶點的識別和切割是必需的，tracrRNA的5'端與成熟的crRNA3'端有部分序列(約13bp)能夠配對進而形成莖環(huán)結構，對維持crRNA與靶點的配對可能十分重要。

tracrRNA(trans-activatingcrRCas9蛋白

900-1600個氨基酸組成的多結構域蛋白

Cas9REC--在REC識別區(qū)中的一個富含精氨酸的α-螺旋負責與RNA-DNA異源二聚體的3‘端8～12個核苷酸的結合HNH結構域--在crRNA互補鏈PAM元件上游3nt處切割。位于HNH結構域的H840A突變體可導致HNH結構域的失活RuvC結構域--在非互補鏈PAM元件上游的3～8nt處切割。位于RuvC結構域中的D10A突變體可導致RuvC結構域的失活。（RuvC則分為3個亞結構域:RuvCⅠ位于蛋白的N端，RuvCⅡ/Ⅲ分別位于HNH結構域的兩側）PAM結合區(qū)Cas9蛋白

900-1600個氨基酸組成的多結構域蛋白

CRISPR-Cas英教學講解課件3CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構建

3.1sgRNA設計目前，大多數研究將與靶DNA互補的crRNA與tracrRNA融合為一條單獨的引導RNA(singleguideRNA，sgRNA).將sgRNA設計為100nt左右，包含位于5'端20nt的DNA互補區(qū)、crRNA以及位于3'端70～80nt的tracrRNA。通常設計的sgRNA具有二級發(fā)卡結構和1條3'端尾，設計的sgRNA與靶基因有1～3個堿基錯配并不影響編輯效率，但是，靠近PAM元件的12個堿基要嚴格配對.3CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構建

3.1sgRcrRNA/tracrRNA/Cas9sgRNA/Cas9crRNA/tracrRNA/Cas9sgRNA/Cas9目前(2014.10)報道的CRISPR/Cas系統(tǒng)中使用的gRNA有2種結構，一種是M.Jinek等最先提出的，將一部分重復序列和一部分tracrRNA的序列直接拼接到一起形成的嵌合RNA結構。目前(2014.10)報道的CRISPR/Cas系統(tǒng)中使用的另一種與第一種基本相同，只是3‘端更長，添加了完整的tracrRNA序列.關于2種結構的優(yōu)劣，麻省理工學院張峰研究團隊做了細致的研究，他們發(fā)現(xiàn)，3’端越長，gRNA表達豐度越高，相應的打靶效率也越高。為了保證足夠的打靶活性，推薦gRNA的3’端長度不低于67nt為好，而長度為85nt時效率最高.另一種與第一種基本相同，只是3‘端更長，添加了完整的trac在設計Guide序列時，需要特別注意第一個堿基必須是G，如果您選取的Guide序列的第一個堿基不是G，需要自行加上一個G，因為這個G對于起始轉錄非常重要。在線工具設計：麻省理工學院的CRISPRDesign：/德國癌癥研究中心的E-Crisp：/E-CRISP/designcrispr在設計Guide序列時，需要特別注意第一個堿基必須是G，如果3.2NLSCas9蛋白來源于細菌，因此要讓Cas9蛋白高效地轉運到哺乳動物細胞核內，需要在Cas9蛋白的N端或是C端加上真核細胞的核定位信號。對于添加NLS信號的位置，目前尚存在爭議。L.CONG的研究發(fā)現(xiàn)，在Cas9蛋白的N端和C端同時添加NLS信號最能有效的指導Cas9蛋白入核。而P.Mali等在Cas9蛋白的C端添加１個NLS信號構建的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在人類的細胞中最高可以達到25%的敲除效率，表明在C端添加１個NLS信號是足以引導Cas9蛋白進入核中的。但是南京大學的研究人員卻發(fā)現(xiàn)，無論是在Cas9蛋白的N端添加3個還是在N端、C端同時添加SV40核定位信號均不能使Cas9蛋白進入293T細胞的細胞核中，只有在N端添加核定位信號并且在核定位信號和Cas9蛋白之間加上32個氨基酸殘基的接頭才能指導Cas9蛋白入核。這些不一致的結果有可能是由于各個研究中FLAG標簽添加位置的不同引起的，但同時也說明Cas9蛋白在折疊過程中可能干擾了NLS信號識別。3.2NLSCas9蛋白來源于細菌，因此要讓Cas9蛋4載體構建、導入目的生物或細胞系、篩選

4.1載體構建Cas9蛋白和gRNA的表達框可以分開放到2個載體上，也可以直接構建在同1個載體上，方便Cas9蛋白和gRNA的協(xié)同表達。

這2種策略各有好處。比如，構建在同一載體上有利于Cas9蛋白和gRNA的協(xié)同表達，這一點非常適合于難轉染的細胞。而分開放在2個表達載體上則能更方便快速的對候選的gRNA進行打靶效率和脫靶情況的檢測。構建gRNA時，只要基因的序列連接到gRNA骨架上，或者直接合成帶有靶序列的gRNA再連接到表達載體上即可。4載體構建、導入目的生物或細胞系、篩選

4.1載體構4.2導入目的生物或細胞系在人工培養(yǎng)的哺乳細胞中，可通過電穿孔(electroporation)、核轉染(nucleofection)與脂質體介導轉染等方法將非自主復制的質粒DNA導入細胞中，使Cas9與sgＲNA可進行瞬時表達。慢性病毒載體(lentiviralvectors)也已用于在人類或小鼠細胞中組成型表達Cas9與sgＲNA。體外轉錄的ＲNA也可直接注射導入斑馬魚、果蠅或小鼠的胚胎細胞中質粒越大，成功率越低4.2導入目的生物或細胞系4.3篩選

將Cas9、引導ＲNA以及一條含有突變位點的靶DNA的同源重組修復模板共同轉化到目的菌株中。若在Cas9對基因組靶DNA序列產生DNA雙鏈斷裂后，可利用導入的同源重組修復模板進行DNA修復，由于修復模板在識別互補區(qū)或PAM位點中存在突變位點而不能被Cas9再次切割，因而可存活;而未能進行同源重組修復的基因組則由于Cas9的切割降解，無法存活。利用該方法可明顯提高基因組編輯后的篩選效率，且在基因組中不殘留篩選標記。4.3篩選5CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應用基因組編輯技術是一種可以在基因組水平上對DNA序列進行改造的遺傳操作技術。這種技術的原理是構建一個人工內切酶，在預定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細胞內的DNA修復系統(tǒng)修復過程中會產生突變，從而達到定點改造基因組的目的。通過修復途徑，基因組編輯技術可以實現(xiàn)三種基因組改造，即基因敲除，特異突變的引入和定點轉基因5.1CRISPR-Cas9介導的基因組精確編輯技術5CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應用基因組編輯技術是一種可以例子：基因敲除的實驗過程1.在靶基因序列中尋找NGG序列獲得其附近20多個堿基的序列，設計出sgRNA并合成該序列2.將sgRNA及cas9基因連入載體3.轉化感受態(tài)，質粒小提，測序驗證4.細胞培養(yǎng)與細胞轉染5.敲除效果檢測6.建立穩(wěn)定敲除的細胞株例子：基因敲除的實驗過程1.在靶基因序列中尋找NGG序列獲得5.2CRISPR-Cas9介導的轉錄抑制與轉錄激活

抑制：在CRISPR/Cas9的Ⅱ型系統(tǒng)中將Cas9中的切割域突變，會使Cas9蛋白失去對ＤＮＡ的切割活性，但不影響其與ＤＮＡ結合的能力。這種失去ＤＮＡ切割活性的Cas9蛋白被命名為DeadＣas9。將ｄCas9與gRNA在細胞中共表達，則gRNA可以介導ｄCas9蛋白與ＤＮＡ結合。如果ｄCas9結合到靶基因的閱讀框內，可阻斷RNA聚合酶的延伸作用；如果ｄCas9結合到靶基因的啟動子區(qū)域則可阻止基因轉錄的起始.5.2CRISPR-Cas9介導的轉錄抑制與轉錄激活

抑制激活：將dCas蛋白與具有轉錄激活的蛋白質功能域融合則可構建具有轉錄激活活性的CRISPR-on系統(tǒng)。CRISPR轉錄激活系統(tǒng)的靶序列位置對激活效率有重要影響。當靶序列與啟動子的距離合適時，激活效率較高；靶序列處于啟動子上游較遠位置激活效率相對下降；當靶序列與啟動子距離過近，或處于開放閱讀框內時則會產生抑制效應。也就是說使用相同的CRISPR-on系統(tǒng)，不同的crRNA既可以對靶基因激活，也可以抑制靶基因表達。真核細胞的轉錄激活因子可通過將ｄCas9與單純皰疹病毒轉錄激活子ＶＰ16結合獲得。CRISPR-Cas英教學講解課件5.3單切口酶C