miRNAs與破骨細胞分化相關的骨代謝疾病,人體解剖學論文

miRNAs與破骨細胞分化相關的骨代謝疾病,人體解剖學論文miRNAs是長度約22個核苷酸的小型、單鏈、非編碼核糖核酸，是最重要的基因調節(jié)因子之一[1].據(jù)最新21.0版miRBase數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，從第1個miRNAlin-4[2]于1993年發(fā)現(xiàn)至今，已發(fā)現(xiàn)的miRNAs達28645條，幾乎分布于所有的真核生物和部分病毒中，華而不實人類有4552條。固然編碼miRNAs的基因只占人類基因組數(shù)量的1%,但可調控超過1/3的蛋白編碼基因[3].miRNAs除可通過與靶基因mRNA的3UTR或5UTR端的特異序列結合外，可以在蛋白翻譯的延伸和終止階段與多核糖體一起介導mRNA翻譯的抑制效應[4],實現(xiàn)對靶基因的轉錄后水平調控。甚至在應激環(huán)境下，miRNAs能提高基因的表示出[5].miRNAs與靶基因組成一個復雜的調控網(wǎng)絡，調節(jié)細胞增殖、分化與凋亡，介入個體發(fā)育、機體代謝等經(jīng)過，控制細胞及個體的重要生命活動。miRNAs與破骨細胞分化miRNAs在骨代謝方面的研究當前主要集中于調控成骨細胞分化，但最新研究表示清楚miRNAs還介入調控破骨細胞的分化和活性。破骨細胞是由造血干細胞的單核-巨噬細胞前體分化而成的唯一具有骨吸收活性的多核細胞，在骨微環(huán)境的動態(tài)平衡中發(fā)揮著舉足輕重的作用。轉錄因子在破骨細胞分化經(jīng)過中扮演著不可或缺的角色，而miRNAs的靶分子大多是在生長發(fā)育或細胞分化中起重要作用的轉錄因子mRNA.Sugatani等[6]在破骨前體細胞中利用siRNA干擾miRNAs合成的重要因子DGCR8〔digeorgesyn-dromecriticalregiongene8〕、Dicer、Ago2〔argo-naute2〕,miR-223生成明顯減少，顯著降低破骨細胞相關轉錄因子表示出并阻遏破骨細胞構成，進而抑制骨吸收。在最新的一項研究中，Sugatani等[7]發(fā)現(xiàn)DGCR8敲除的破骨細胞特征性標記物和關鍵轉錄因子均遭到抑制，而在CD11b+-cre/DicerKO小鼠中，成骨細胞數(shù)量和活性并未受影響，但因破骨細胞數(shù)量和活性的下降，導致骨硬化病的發(fā)生，再次證明介入miRNAs合成的DGCR8對破骨細胞分化的重要性。Mizoguchi等[8]發(fā)現(xiàn)cathepsinK-cre/DicerKO小鼠體內和體外構成的破骨細胞數(shù)量及活性下降，骨組織RT-PCR顯示TRAP〔tartrate-re-sistantacidphosphatase〕、NFATc1〔nuclearfactorofactivatedTcells1〕、Ephrinb2遭到不同程度的抑制；BMMs〔bonemarrow-derivedmacrophages/mon-ocytes〕經(jīng)RANKL〔receptoractivatorofnuclearfac-torkappa-Bligand〕誘導24h后，DicerKO組miR-155顯著下降。研究結果證明這些因子在miRNAs的生物合成中發(fā)揮著重要作用，進而影響破骨細胞的分化。Sugatani等[9]2007年發(fā)現(xiàn)破骨細胞中miR-223表示出低于破骨前體細胞，且pre-miR-223過表示出能夠完全抑制RAW264.7向破骨細胞分化。另一項研究卻發(fā)現(xiàn)，瞬時轉染反義miR-223的RAW264.7顯著抑制向破骨細胞分化[6],提示miR-223對破骨細胞分化有雙向調節(jié)作用，其作用方式可能與其在細胞的表示出水平有關。進一步研究證明了一個正反應通路PU.1/miR-223/NFI-A/M-CSFR:即M-CSF〔macrophagecolonystimulatingfactor〕誘導的PU.1上調miR-223,miR-223靶向負調控NFI-A〔nuclearfactorI-A〕,NFI-A下調引起M-CSFR〔macrophagecolony-stimulatingfactorreceptor〕表示出增加，進而促進破骨細胞分化。Li等[10]在觀察抑制miR-223活性以治療CIA〔collagen-inducedar-thritis〕小鼠有效性的研究中發(fā)現(xiàn)，慢轉miR-223靶序列可有效抑制miR-223活性，進而上調NFI-A表示出，阻遏M-CSFR表示出，降低破骨細胞數(shù)量，增加骨密度，改善類風濕異常感覺和狀態(tài)。Mann等[11]研究了miR-155在RAW264.7細胞向巨噬細胞和破骨細胞分化中的作用。向巨噬細胞分化時miR-155表示出顯著上調，向破骨細胞分化時miR-155表示出明顯下調。在RAW264.7中過表示出miR-155,可顯著抑制TRAP+破骨細胞數(shù)量和骨吸收活性，并可影響破骨細胞早期的融合，證實miR-155在調控破骨細胞分化中發(fā)揮著重要作用。在后續(xù)的實驗中，過表示出miR-155可抑制GPNMB、MITF〔microphthalmia-associatedtranscriptionfac-tor〕、PU.1等表示出；而通過干涉使MITF過表示出則可修復GPNMB的mRNA表示出，熒光素酶活性報告支持miR-155與MITF的3UTR配對。此項研究證明了miR-155能夠通過下調MITF和PU.1而抑制GPNMB和TRAP表示出，進而阻遏破骨細胞分化及骨吸收活性，促進巨噬細胞分化。Zhang等[12]在研究干擾素抑制破骨細胞分化的實驗中發(fā)現(xiàn)，干擾素可誘導miR-155上調，而miR-155可靶向抑制MITF和SOCS1〔suppressorofcytokinesigna-ling1〕表示出以抑制破骨細胞分化。以上研究都表示清楚miR-155在破骨細胞分化經(jīng)過中的重要作用。Sugatani等[13]在研究RANKL誘導BMMs向破骨細胞分化的miRNA表示出譜時，發(fā)現(xiàn)有33個miRNAs下調，38個miRNAs上調，miR-21是兩個顯著上調的miRNAs之一。c-Fos和PU.1能夠誘導miR-21生成，通過ChIP〔chromatinimmunoprecipi-tation〕證實c-Fos可與miR-21啟動子結合。正常表示出miR-21的細胞中PDCD4〔programmedcelldeath4〕沒有蛋白表示出，卻有mRNA表示出，而在慢轉反義miR-21的細胞中具有PDCD4蛋白表示出，提示miR-21能夠通過轉錄后負向調節(jié)靶基因PD-CD4的表示出。以上研究結果揭示了調控骨髓源性單核巨噬細胞系向破骨細胞分化中c-Fos/miR-21/PDCD4這一正反應通路。Mizoguchi等[14]通過對RANKL和未經(jīng)RANKL誘導的BMMs行miRNA陣列分析，miR-31在RANKL誘導24h后顯著上調，提示miR-31可能介入破骨細胞的分化。當使用miR-31拮抗劑時，Phal-loidin染色顯示actin環(huán)遭到損壞呈簇狀小環(huán)，而利用RhoA抑制劑能夠修復miR-31拮抗劑對actin環(huán)的損傷，顯示RhoA為miR-31靶基因。在分析TNF-〔tumornecrosisfactoralpha〕對破骨細胞分化影響時，Kagiya等[15]通過對TNF和RANKL共處理和單獨RANKL處理RAW264.7細胞行miRNA陣列比擬顯示，新發(fā)現(xiàn)一個miR-378在破骨細胞分化經(jīng)過中上調，共處理組以miR-21、miR-29b、miR-146a、miR-155和miR-210上調最為顯著。Lee等[16]采用qRT-PCR研究發(fā)現(xiàn)miR-124表示出可隨BMMs經(jīng)RANKL誘導時間的延長而降低，TargetScan顯示人和小鼠NFATc1的3UTR可與miR-124完全匹配，細胞實驗顯示轉染pre-miR-124能夠明顯抑制NFATc1蛋白表示出，而過表示出NFATc1能夠修復miR-124對破骨細胞的阻遏作用。后續(xù)實驗還發(fā)現(xiàn)，miR-124還可能通過上調DC-STAMP影響細胞融合，下調RhoA和Rac1可抑制破骨前體細胞的增殖和遷移能力。Guo等[17]發(fā)現(xiàn)破骨細胞分化經(jīng)過中miR-125a表示出逐步降低，過表示出miR-125a能夠抑制破骨細胞分化，而抑制miR-125a表示出則促進破骨細胞分化。靶基因軟件預測顯示TRAF6〔TNFreceptor-associat-edfactor6〕的3UTR可與miR-125a不完全匹配，經(jīng)熒光素酶報告基因實驗證實miR-125a靶基由于TRAF6.EMSA和ChIP顯示NFATc1可與miR-125a的啟動子結合抑制其生成，過表示出NFATc1能夠抑制miR-125a生成，而沉默NFATc1表示出則增加miR-125a生成。以上結果闡述了一個TRAF6/NFATc1/miR-125a生物反應經(jīng)過，即：RANKL與破骨細胞質膜上的RANK〔receptoractivatorofnuclearfactorkappa-B〕結合誘導TRAF6表示出，TRAF6引發(fā)上調的NFATc1阻遏miR-125a生成，而miR-125a則在轉錄后水平抑制TRAF6的蛋白表示出。miRNAs與破骨細胞分化相關的骨代謝疾病研究證明miRNAs介入破骨細胞分化的調控，而破骨細胞分化狀態(tài)的異常是絕經(jīng)后骨質疏松癥、骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、骨腫瘤構成和腫瘤骨轉移等骨代謝疾病發(fā)生的重要病因機制。Ou等[18]利用深度測序和iTRAQ蛋白組學分析了CLCN7〔AG〕突變骨質疏松患者的外周血單核細胞，顯示差異表示出的miRNAs有123種，蛋白質有173種，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)miR-320a與ARF1〔ADPribosylationfactor1〕有逐一對應關系，293T細胞進一步證實了miR-320a可反向調控ARF1.Wang等[19]在脛骨平臺骨折預后影響因素的研究中發(fā)現(xiàn)，阻遏miR-9和miR-181a能夠促進破骨前體細胞RAW264.7的遷移能力和破骨細胞的存活率。Sugatani等[20]發(fā)現(xiàn)雌激素可抑制miR-21生成，造成上調的FasL〔fasligand〕與Fas結合，介導破骨細胞的凋亡。而絕經(jīng)后雌激素匱乏可引起miR-21過表示出致破骨細胞凋亡減少、骨吸收過度活潑踴躍。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)低BMD的絕經(jīng)后婦女PBMCs〔peripheralbloodmononuclearcells〕中miR-133a表示出上調，提示人外周血單核細胞中miR-133a可促進其向破骨細胞分化，可能是絕經(jīng)后骨質疏松癥發(fā)生的一個重要機制。Cao等[22]近期對于白種人的類似研究中也發(fā)現(xiàn)，低BMD的絕經(jīng)后婦女miR-422a表示出明顯上調，提示了miR-422a作為絕經(jīng)后骨質疏松生物標志物的可能性。除此之外，Chen等[23]應用miR-NA芯片和qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質疏松癥患者CD14+PBMCs中miRNAs表示出譜的差異，華而不實以miR-503表示出下調最為明顯，骨量正常的絕經(jīng)后女性CD14+PBMCs可表示出miR-503,降低NFATc1mRNA以抑制破骨細胞分化；而抑制miR-503表示出則可明顯上調NFATc1mRNA表示出、促進破骨細胞分化。動物實驗結果也提示：正常小鼠中抑制miR-503表示出可導致骨吸收加強、骨量下降、骨微構造毀壞；而在去卵巢小鼠中恢復miR-503表示出可導致骨密度增加、骨微構造改善。RNA22預測并經(jīng)熒光素酶報告基因顯示miR-503可與RANK的3UTR不完全匹配，抑制RANK的翻譯。Nakasa等[24]在研究PBMCs中miRNA的表示出水平與類風濕性關節(jié)炎骨毀壞關系時發(fā)現(xiàn)，轉染ds-miR146a可抑制c-Jun、PU.1、NFATc1的表示出，降低TRAP〔+〕破骨細胞數(shù)量和骨吸收面積。免疫熒光顯示轉染ds-miR146a組TRAF6熒光基本湮滅，提示miR146a可通過調節(jié)TRAF6表示出來阻遏破骨細胞分化。Pauley等[25]比擬了正常人與類風濕患者PBMCsmiRNAs表示出情況，發(fā)如今類風濕患者PBMCs中miR146a、miR-155、miR-132和miR-16高表示出，提示這些miRNAs可能通過介導破骨細胞分化能力影響類風濕骨毀壞的進展。除此之外，研究證明，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者PBMCs的miR-148a表示出上調。Cheng等[26]應用miRNA微陣列及qRT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)CD14+PBMCs經(jīng)M-CSF和RANKL誘導14d后，在向破骨細胞分化中有27個miRNAs表示出發(fā)生變化，華而不實以miR-148a表示出上調最顯著且隨著誘導時間延長而增加。靶基因預測軟件預測并經(jīng)熒光素酶報告基因檢測，MAFB〔V-mafmusculoaponeuroticfibrosarcomaoncogenehomologB〕為miR-148a的靶基因，miR-148a與MAFB的3UTR結合，在轉錄后水平抑制MAFB翻譯，間接促進NFATc1表示出，促進破骨細胞分化。動物實驗也表示清楚，靜脈注射anti-miR-148a能夠抑制骨吸收、增加骨量。在研究破骨細胞與原發(fā)性骨質疏松癥以及腫瘤骨轉移的關系時，Krzeszinski等[27]發(fā)現(xiàn)過表示出miR-34a的小鼠表現(xiàn)為低骨吸收和高骨量狀態(tài)，對于去卵巢以及乳腺癌/皮膚癌骨轉移的骨質疏松動物給予miR-34a納米顆粒治療后后可使模型動物的骨質疏松異常感覺和狀態(tài)有效緩解，研究表示清楚Tgif2〔transforminggrowthfactor--inducedfactor2〕為miR-34a的直接靶基因，miR-34a作為抑制破骨細胞分化的強有力因子，有望成為防治骨質疏松相關疾病的潛在靶點。為了討論腫瘤骨轉移溶骨性毀壞的機制，Ell等[28]采用共培養(yǎng)方式方法發(fā)現(xiàn)高轉移性腫瘤細胞可有效激活RAW264.7向破骨細胞分化，行miRNA表示出譜顯示RAW264.7的miR-33a、miR-133a、miR-141、miR-190、miR-219表達下調。若在RAW264.7中過表示出上述miRNAs,則NFATc1、cathepsinK蛋白表示出下降，破骨細胞數(shù)與骨吸收面積均遭到不同程度抑制。動物實驗顯示，過表示出上述miRNAs可導致骨體積、骨小梁厚度和破骨細胞數(shù)的下降。在研究多