生物制藥技術(shù)-專題三酶固定化

1酶和細胞的固定化

教師：程琳2第一節(jié)概述第二節(jié)固定化酶的性質(zhì)及其影響因素第三節(jié)固定化酶的制備第四節(jié)固定化細胞第五節(jié)固定化輔酶和原生質(zhì)體第六節(jié)酶反應(yīng)器和固定化酶（細胞）的應(yīng)用主要內(nèi)容3第一節(jié)概述什么是酶？催化特定化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)、RNA或其復(fù)合體。是生物催化劑，能通過降低反應(yīng)的活化能加快反應(yīng)速度，但不改變反應(yīng)的平衡點。絕大多數(shù)酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。具有催化效率高、專一性強、作用條件溫和等特點。4游離酶的缺陷：大多數(shù)游離酶的穩(wěn)定性比較差；游離酶的使用成本較高；一些游離酶存在自水解作用；產(chǎn)物的分離提純困難。5固定化酶的發(fā)展史

在20世紀20年代，就出現(xiàn)了酶工程，以自然酶制劑在工業(yè)上大規(guī)模應(yīng)用的特征，原料以動植物為主1953年，GrubhogerSchleith用重氮化聚氨基聚苯乙烯樹脂對羧肽酶、蛋白酶、核酸酶等進行固定，產(chǎn)生了固定化酶技術(shù)。6

1969年，千田一郎等用固定化氨基?；讣夹g(shù)拆分了DL-氨基酸，生產(chǎn)L-氨基酸，隨后固定化天冬氨酸酶生產(chǎn)L-天冬氨酸等，開創(chuàng)了固定化酶應(yīng)用的局面。1971年，第一次國際酶工程會議在美國召開，會議主題是固定化酶的研制和應(yīng)用,確定固定化酶（ImmobilizedEnzyme）統(tǒng)一名稱71973年，日本首次在工業(yè)上固定化大腸桿菌菌體中天門冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-天門冬氨酸固定化死菌體固定化細胞固定化植物細胞固定化原生質(zhì)體1976年，法國首次用固定化酵母細胞生產(chǎn)啤酒和酒精

1979年固定化毛地黃細胞和長春花細胞成功

1982年日本固定化黃色短桿菌原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸8什么是固定化酶？固定化酶（ImmobilizedEnzyme）：通過物理的或化學(xué)的手段，將酶束縛于水不溶的載體上，或?qū)⒚甘`在一定的空間內(nèi)，限制酶分子的自由流動，但能使酶充分發(fā)揮催化作用水溶性酶水不容性的載體固定化酶固定化技術(shù)9固定化酶制備原則（1）維持酶的催化活性及專一性；（2）有利于生產(chǎn)自動化、連續(xù)化；（3）應(yīng)有最小的空間位阻；（4）酶與載體必須結(jié)合牢固；（5）應(yīng)有最大穩(wěn)定性，載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；（6）成本要低。10長時間使用，在絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性，有利用工藝的連續(xù)化和管道化酶的使用效率提高，適合于多酶反應(yīng)酶反應(yīng)過程可以嚴格控制，有利于工藝自動化和微電腦化極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開1234優(yōu)點固定化酶的優(yōu)點11固定化酶的缺點增加了固定化的成本，使工廠開始投資大只能用于可溶性的底物和小分子底物，對大分子底物不適宜酶固定化時酶的活力有所損失.12多次使用可以裝塔連續(xù)反應(yīng)優(yōu)點：純化簡單提高產(chǎn)物質(zhì)量應(yīng)用范圍廣缺點：首次投入成本高大分子底物較困難固定化酶的優(yōu)缺點：13第二節(jié)固定化酶的性質(zhì)及其影響因素一、影響固定化酶性質(zhì)的因素二、固定化后酶性質(zhì)的變化三、評價固定化酶的指標14一、影響固定化酶性質(zhì)的因素1、酶本身的變化，主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。15一、影響固定化酶性質(zhì)的因素2、載體的影響（1）構(gòu)象效應(yīng)（2）空間屏蔽效應(yīng)16（3）微擾效應(yīng)（4）分配效應(yīng)：載體與底物帶相同電荷-底物少；反之則多。17（5）擴散限制效應(yīng)

外擴散限制內(nèi)擴散限制18二、固定化后酶性質(zhì)的變化1、固定化對酶活性的影響：酶活性下降，反應(yīng)速度下降原因：酶結(jié)構(gòu)的變化空間位阻19二、固定化酶的性質(zhì)固定化對酶穩(wěn)定性的影響（1）操作穩(wěn)定性提高。（2）貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。

(3)對熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。(4)對分解酶的穩(wěn)定性提高。（5）對變性劑的耐受力升高。202、固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：a.固定化后酶分子與載體多點連接。b.酶活力的釋放是緩慢的。c.抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。213、pH的變化pH對酶活性的影響：（1）改變酶的空間構(gòu)象（2）影響酶的催化基團的解離（3）影響酶的結(jié)合基團的解離（4）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。22pH對固定化酶的影響：1）載體帶負電荷，pH向堿性方向移動;載體帶正電荷，pH向酸性方向移動。

233、pH的變化

2）產(chǎn)物性質(zhì)對體系pH的影響催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高；反之則低244、最適溫度變化一般與游離酶差不多，但有些會有較明顯的變化。5、底物特異性變化

作用于低分子底物的酶特異性沒有明顯變化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶特異性往往會變化。256、米氏常數(shù)Km的變化，Km值隨載體性質(zhì)變化（1）載體與底物帶相同電荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的親和力。（2）載體與底物電荷相反，靜電作用，Km‘<Km26三．評價固定化酶的指標：1、酶活定義（IU)：在特定條件下，每一分鐘催化一個微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個酶活單位。1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min=6*106IU2.酶比活定義（游離）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力單位

27三、評價固定化酶的指標：3、4、

酶結(jié)合效率，又稱為酶結(jié)合率，是指酶與載體結(jié)合的百分率。

酶活力回收率是指固定化酶的總活力與用于固定化的總酶活力的百分率。285、相對酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對酶活力。6、固定化酶的操作半衰期：在連續(xù)測定條件下，固定化酶的活力下降為最初活力一般所經(jīng)歷的連續(xù)工作的時間。29四、固定化酶的活力測定方法介紹1、間歇測定：在攪拌或震蕩反應(yīng)中，在與溶液酶相同測定條件下進行，然后間隔一段時間取樣，過濾后按常規(guī)方法測定產(chǎn)物生成量或底物的消耗量。此法操作簡單。30四、固定化酶的活力測定方法介紹2、連續(xù)測定法利用連續(xù)分光光度法等測定方法可以對固定化酶反應(yīng)液進行連續(xù)測定，從而測定固定化酶的酶活力。

31總結(jié)：固定化酶的性質(zhì)及其影響因素提要影響固定化酶性質(zhì)的因素固定化酶的性質(zhì)評價固定化酶的指標酶本身的變化載體的影響固定化對酶活性的影響固定化對酶穩(wěn)定性的影響最適pH的變化最適溫度變化底物特異性與游離酶不同米氏常數(shù)Km的變化評價指標活力測定方法32第三節(jié)固定化酶的制備一、一般方法及特點二、酶的固定化方法33一、一般方法及特點

關(guān)鍵在于選擇適當?shù)墓潭ɑ椒ê捅匾妮d體以及穩(wěn)定性研究、改進。1．四大類方法：吸附法（包括電吸附法）結(jié)合法（無機多孔材料）交聯(lián)法（雙功能試劑）包埋法（微膠囊法）

342、選擇方法依據(jù)：

（1）酶的性質(zhì)（2）載體的性質(zhì)（3）制備方法的選擇353、固定化后酶的考察項目：（1）測定固定化酶的活力，以確定固定化過程的活力回收率。（2）考察固定化酶穩(wěn)定性。（3）考察固定化酶最適反應(yīng)條件。36二、酶的固定化方法（一）吸附法（二）結(jié)合法（三）交聯(lián)法（四）包埋法（entrappingmethod）37（一）吸附法應(yīng)用實例1：固定化乳糖酶-連續(xù)生產(chǎn)低乳糖奶乳糖不耐癥固定化乳糖酶奶子糖粳米粥38利用固定化乳糖酶可以連續(xù)生產(chǎn)低乳糖奶39應(yīng)用實例2：污水的生物凈化40

吸附法是利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定化的方法。

選擇載體的原則：（1）要有巨大的比表面積；（2）要有活潑的表面；（3）便于裝柱進行連續(xù)反應(yīng)。41活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石。

優(yōu)點：操作簡單、條件溫和、載體廉價易得、可反復(fù)使用。缺點：結(jié)合力不勞、容易脫落。42（二）結(jié)合法應(yīng)用實例：生活中的酶電極：血糖試紙43酶電極：特點：快速、方便、靈敏、精確范圍：糖類、抗生素、氨基酸、甾體化合物、有機酸、脂粉、醇類、胺類以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等要求：酶必須有較強的專一性，并且要有一定的純度。441、離子鍵結(jié)合法2、共價鍵結(jié)合法☆選擇適宜載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法稱為結(jié)合法。45（1）離子結(jié)合法：通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體：DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠

……++++++++++++----------------++++++++462、共價鍵結(jié)合法（1）概念：酶分子與載體之間以共價鍵作用而實現(xiàn)結(jié)合的固定化方法。（2）可以形成共價鍵的基團：游離氨基，游離羧基，巰基，咪唑基，酚基，羥基，甲硫基，吲哚基，二硫鍵（3）常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無機載體47共價鍵結(jié)合法制備固定化酶的“通式”首先載體上引進活潑基團關(guān)鍵然后活化該活潑基團最后此活潑基團再與酶分子上某一基團形成共價鍵48（4）載體活化的方法：A．重氮法B．疊氮法C．烷基化反應(yīng)法D．硅烷化法E．溴化氰法49A、重氮法反應(yīng)示意式如下：50A、重氮法目前在我們國內(nèi)用的較多的載體是對氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等該方法需要載體具有芳香族氨基51B、疊氮法例：用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶，步驟如下：（1）酯化（2）肼解（3）疊氮化

（4）偶聯(lián)52B、疊氮法對含有羧機基的載體，與肼基作用生成含有酰肼基團的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物，最后與酶偶聯(lián)。53C、烷基化反應(yīng)法含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進行活化，形成含有鹵素基團的活化載體。54D、硅烷化法（APTS氨化法）用于含有羥基載體的活化，可在二氧化硅表面引入氨基，活化的表面可以利用一些中間分子進一步和酶分子發(fā)生連接反應(yīng)。一般常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。多孔玻璃特點：①機械強度好，表面積大。②耐有機溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長等。55E、溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類物質(zhì)。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。56E、溴化氰法57應(yīng)用實例：白色污染的消除

（三）交聯(lián)法58交聯(lián)法是使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間交聯(lián)的固定化方法。此法與共價結(jié)合法一樣也是利用共價鍵固定酶，所不同的是它不使用載體。常選用的惰性蛋白主要有牛血清白蛋白、卵清蛋白、明膠、膠原以及血紅蛋白等。59（三）交聯(lián)法常用試劑常用試劑：戊二醛、異氰酸酯、雙重氮聯(lián)苯胺等。應(yīng)用最廣泛的是戊二醛，它兩個醛基都可以與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基形成席夫堿(shiff)，而使蛋白發(fā)生交聯(lián)。酶蛋白分子彼此交叉連接起來，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)60（三）交聯(lián)法的形式交聯(lián)法有2種形式

酶直接交聯(lián)法酶輔助蛋白交聯(lián)法611、酶直接交聯(lián)法在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強度、溫度和反應(yīng)時間之間的平衡。操作簡單，但固定化過程條件控制相對比較困難、制備的固定化酶活力回收率相對較低、形成的固定化酶機械強度不足。622、酶輔助蛋白交聯(lián)（共交聯(lián)法）為避免分子內(nèi)交聯(lián)和在交聯(lián)過程中因化學(xué)修飾而引起酶失活，可使用第二個"載體"蛋白質(zhì)（即輔助蛋白質(zhì)，如白蛋白、明膠、血紅蛋白等）來增加蛋白質(zhì)濃度，使酶與惰性蛋白質(zhì)共交聯(lián)。63注意與共價結(jié)合法的區(qū)別活化方法基本相同；共價結(jié)合法：載體首先活化，然后除去游離的多功能試劑后再加入酶與載體共價偶聯(lián)；共交聯(lián)法是將酶和載體以及交聯(lián)劑同時加入到同一反應(yīng)體系中實現(xiàn)共價偶聯(lián)。64應(yīng)用實例1：固定化青霉素?；福灰淖僷H值等條件，就可以生成不同的產(chǎn)物。（四）包埋法（entrappingmethod）

65應(yīng)用實例2：制造人工腎：利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的體外循環(huán)裝置，大大提高了療效。66（四）包埋法（entrappingmethod）

定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。67（四）包埋法1、凝膠包埋法

2、半透膜包埋法3、纖維包埋法681、凝膠包埋法（1）概念：將酶或含酶菌體包埋在凝膠細微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為凝膠包埋法，也稱為網(wǎng)格型包埋法。692、半透膜包埋法是將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。

酶，水，乙二胺癸二酰氯+氯仿70固定化L-天冬酰胺酶在臨床上的應(yīng)用：L-天冬酰胺酶（L-ASP）商品名為左旋門冬