水飛薊賓對KB口腔癌細胞的作用機制探究,口腔科學(xué)論文

水飛薊賓對KB口腔癌細胞的作用機制探究,口腔科學(xué)論文摘要：目的:討論水飛薊賓對人口腔上皮樣癌細胞KB細胞株增殖和侵襲的影響。方式方法:用不同濃度的水飛薊賓和JNK抑制劑sp600125作用于體外培養(yǎng)的KB細胞株,應(yīng)用CCK-8檢測細胞24h,48h和72h存活率；平板克隆構(gòu)成實驗檢測KB細胞的增殖情況，Transwell檢測KB細胞的侵襲能力，蛋白免疫印跡實驗分析p-JNK,VEGF和MMP-9蛋白的表示出水平。結(jié)果：CCK-8結(jié)果顯示水飛薊賓對KB細胞株的增殖具有明顯的抑制作用，且呈時間劑量依靠性；平板克隆實驗表示清楚，水飛薊賓顯著抑制KB細胞的集落構(gòu)成；侵襲試驗結(jié)果表示清楚，水飛薊賓能夠以劑量依靠的方式抑制KB細胞的侵襲作用；蛋白免疫印跡試驗顯示水飛薊賓處理后，JNK的磷酸化水平、VEGF和MMP-9的表示出水平顯著下調(diào)。JNK抑制劑sp600125作用于KB細胞后，VEGF和MMP-9蛋白的表示出水平明顯下調(diào)，且集落的構(gòu)成和侵襲均遭到了明顯的抑制。結(jié)論：水飛薊賓具有明顯的抑制KB細胞增殖和侵襲的作用；其作用機制可能是通過抑制JNK通路，進而下調(diào)VEGF和MMP-9的表示出。本文關(guān)鍵詞語：水飛薊賓;KB細胞株;增殖;侵襲;Abstract：Objective:ToinvestigatetheeffectofsilibininonproliferationandinvasioninhumanoralepithelioidcarcinomaKBcellline.Methods:TheKBcellswereculturedinvitrowithdifferentconcentrationsofsilibininandJNKinhibitorsp600125.CCK-8assaywasusedfordetectingthesurvivalrateofcellsat24h,48hand72h.PlatecolonyformationassaywasusedtodetecttheeffectofKBcellproliferation.TranswellchamberwasusedtodetecttheinvasionofKBcells.Theexpressionlevelsofp-JNK,VEGFandMMP-9wereanalyzedbywesternblotting.Results:CCK-8resultsshowedthatsilibininhadasignificantinhibitoryeffectontheproliferationofKBcelllinesinatime-dose-dependentmanner.PlatecloningexperimentsshowedthatsilibininsignificantlyinhibitedcolonyformationofKBcells.TheresultsoftheinvasiontestshowedthatsilibinincouldinhibittheinvasionofKBcellsinadose-dependentmanner.WesternblottingshowedthatthephosphorylationlevelofJNK,theexpressionlevelsofVEGFandMMP-9weresignificantlydown-regulatedaftertreatmentwithsilibinin.TheexpressionlevelsofVEGFandMMP-9proteinsweresignificantlydown-regulated,andtheformationandinvasionofcoloniesweresignificantlyinhibitedaftertreatingwiththeJNKinhibitorsp600125inKBcells.Conclusion:SilibininhasobviousinhibitoryeffectonKBcellproliferationandinvasion.Theanti-tumormechanismmayberelatedtodown-regulatetheexpressionofVEGFandMMP-9byinhibitingJNKpathway.Keyword：silibinin;KBcellline;proliferation;invasion;口腔癌是一種主要與吸煙、飲酒、慢性炎癥、病毒感染及遺傳有關(guān)的多因素惡性腫瘤[1],其特征為高度局部浸潤性和高頸淋逢迎轉(zhuǎn)移率。相關(guān)研究表示清楚口腔癌的病理病因與調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和細胞凋亡的基因突變密切相關(guān)[2]。當(dāng)前,口腔癌治療策略最常見的是化療、放療和手術(shù)以及這些方式方法的組合[3]。單一的治療手段容易發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,遠期療效不理想,而化學(xué)藥物治療可抑制腫瘤細胞活性,為較好的預(yù)后提供可能的時機[4]。但是化療藥物的全身毒性使其在癌癥治療中的有效性遭到限制,因而,通過從天然產(chǎn)物及其衍生物中尋找具有高效力和最小副作用的新型抗癌物質(zhì)進行預(yù)防和治療是癌癥治療的新興領(lǐng)域。大多數(shù)植物化學(xué)物質(zhì)是人類飲食的組成部分并被視為膳食補充劑。水飛薊賓是從水飛薊(silybummarianumL.Gaertn)的果實和種子中分離的類黃酮水飛薊素的主要活性成分,是有效的膳食植物化學(xué)物質(zhì)之一,其較強的抗腫瘤活性和分子作用機制是當(dāng)前研究的熱門。研究表示清楚水飛薊賓對肝癌[5]、宮頸癌[6]、膀胱癌[7]、結(jié)腸癌[8]、肺癌[9]、卵巢癌[10]均有抑制作用,主要表現(xiàn)為阻滯細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡、毀壞有絲分裂和抑制血管生成等作用[11]。在口腔癌方面,李云鵬等[12]考察了水飛薊賓對人舌癌細胞的抑制作用,并闡述其可能是阻滯G1期;Chen等[13]發(fā)現(xiàn)水飛薊賓通過抑制MAPK途徑抑制SCC-4舌癌細胞的侵襲;Gohulkumar等[14]將水飛薊賓包封在納米顆粒中并研究其在口腔癌(KB)細胞中的細胞毒性和細胞凋亡誘導(dǎo)的抗癌作用,結(jié)果表示清楚水飛薊賓納米顆粒可用作有效藥物輸送系統(tǒng)來治療癌癥。盡管水飛薊賓已顯示作為化學(xué)治療劑抑制口腔癌細胞的潛力,但其分子機制仍然未知。因而,本研究的目的是通過作用于KB口腔癌細胞,確定水飛薊賓能否具有作為化療藥物的潛力并說明水飛薊賓在KB細胞中的作用機制。1、材料和方式方法1.1、細胞株人口腔上皮癌KB細胞株,購于中科院上海細胞庫。1.2、主要試劑MEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司;DMSO、CCK-8和結(jié)晶紫染料購自碧云天生物技術(shù)研究所;Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠購于美國Corning公司;水飛薊賓和sp600125購自美國Sigma公司;兔抗人p-JNK抗體、兔抗人JNK抗體、兔抗人MMP-9抗體、兔抗人-actin抗體和山羊抗兔二抗購自美國CST公司,兔抗人VEGF抗體購自美國Abcam公司。1.3、方式方法細胞培養(yǎng)KB細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2濃度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2～3天傳代1次。1.3.1、CCK-8檢測細胞存活率消化收集對數(shù)生長期的細胞,以5103個/孔接種于96孔板中過夜培養(yǎng)。待細胞貼壁后,更換含不同濃度水飛薊賓(0,5,10,20,50mol/L)的培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h、48h、72h。終止培養(yǎng)前2h在每孔中參加10lCCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2h后,酶標儀讀OD450nm,對照組設(shè)置為100%,給藥組與對照組相比,計算細胞存活率。1.3.2、平板克隆構(gòu)成實驗將KB細胞以200個/孔接種于6孔板中,在含有不同濃度的水飛薊賓(0,5,10,20mol/L)或JNK抑制劑sp600125(10mol/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天,待集落構(gòu)成后,棄去培養(yǎng)液,用PBS清洗2遍,多聚甲醛固定15min后,用結(jié)晶紫染色15min,PBS清洗多余的結(jié)晶紫染料。1.3.3、Transwell侵襲實驗將KB細胞用0、5、10、20mol/L的水飛薊賓或10mol/L的sp600125預(yù)處理24小時后,PBS清洗3次,消化收集細胞并計數(shù);將預(yù)先鋪設(shè)好基質(zhì)膠的Transwell小室放入24孔板中,下室參加600l含5%FBS的培養(yǎng)基;將細胞以5104/孔種于上室,上下室均含有實驗分組濃度的藥物,置37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)12h。取出Transwell小室,用棉簽擦去微孔膜上層細胞;PBS沖洗2遍;使用多聚甲醛室固定15min,結(jié)晶紫染色15min,PBS沖洗去除多余染料;在倒置顯微鏡下對遷移至微孔膜下層的細胞進行觀察拍照。1.3.4、Westrenblot蛋白印跡實驗將不同濃度(0,5,10,20mol/L)的水飛薊賓作用KB細胞1h,檢測JNK的蛋白表示出。使用不同濃度(0,5,10,20mol/L)的水飛薊賓和10mol/Lsp600125作用KB細胞48h,檢測VEGF和MMP-9的表示出。藥物處理相應(yīng)的時間后,用RIPA裂解液裂解細胞,提取總蛋白,并用BCA測定總蛋白的濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,并使用濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%脫脂牛奶在37℃封閉1h,一抗4℃過夜孵育,TBST漂洗3次后,二抗室溫孵育1h,TBST漂洗6次后,用ECL發(fā)光液曝光顯影。用軟件掃描蛋白條帶并定量分析蛋白的表示出情況。1.4、統(tǒng)計學(xué)方式方法實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,結(jié)果以均數(shù)標準差(x?s)(x?s)來表示,并用單因素方差分析進行處理,組間進行t檢驗,P0.05以為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2、結(jié)果2.1、水飛薊賓對人口腔癌KB細胞增殖的影響不同濃度的水飛薊賓(0,5,10,20,50mol/L)作用于人口腔癌KB細胞后,使用CCK-8檢測細胞存活率,判定水飛薊賓對KB細胞增殖的影響。結(jié)果表示清楚:與對照組相比,水飛薊賓能顯著抑制KB細胞的增殖(P0.05),且隨著藥物濃度的升高,抑制作用逐步加強,表現(xiàn)出劑量依靠性。同時隨著藥物作用時間的增加(24,48,72h),抑制作用也愈加明顯,半數(shù)抑制濃度IC50分別為:55.36mol/L,22.18mol/L和9.64mol/L(圖1)。2.2、水飛薊賓對人口腔癌KB細胞克隆構(gòu)成和侵襲的影響根據(jù)CCK-8的結(jié)果,選取低于半數(shù)抑制濃度的5,10,20mol/L的水飛薊賓作用于KB細胞,通過平板克隆構(gòu)成實驗和Transwell實驗分別檢測水飛薊賓對KB細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示:培養(yǎng)10天后,隨著水飛薊賓濃度的升高,克隆構(gòu)成的數(shù)量明顯減少(P0.05),表示清楚了水飛薊賓對KB細胞增殖的抑制作用;同時水飛薊賓預(yù)處理24h的細胞,在小室中培養(yǎng)12h后,穿過基質(zhì)膠的KB細胞數(shù)量也明顯減少(P0.05),表示清楚KB細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力同樣遭到水飛薊賓的抑制(圖2)。圖1水飛薊賓對人口腔上皮癌KB細胞增殖的影響Fig.1CellviabilityofKBcellstreatmentwithsilibinin圖2水飛薊賓對KB細胞的集落構(gòu)成和侵襲的影響(結(jié)晶紫100)Fig.2InhibitionofKBcellscolonyformationandinvasionbytreatingwithsilibinin(violetcrystal100)2.3、水飛薊賓對p-JNK、VEGF和MMP-9表示出的影響使用不同濃度的水飛薊賓(5,10,20mol/L)作用于KB細胞,Westernblot檢測p-JNK、VEGF和MMP-9的表示出。從圖3中能夠看出不同濃度的水飛薊賓組中,JNK的磷酸化水平以及VEGF和MMP-9的表示出水平較空白對照組顯著降低(P0.05)。圖3水飛薊賓對p-JNK、VEGF和MMP-9蛋白表示出的影響Fig.3Expressionofp-JNK,VEGFandMMP-9inKBcellstreatedwith0,5,10,20mol/Lsilibinin2.4、JNK抑制劑sp600125對p-JNK、VEGF和MMP-9表示出的影響用10mol/L的JNK抑制劑sp600125作用于KB細胞,Westernblot檢測VEGF和MMP-9的表示出。結(jié)果表示清楚:sp600125顯著降低VEGF和MMP-9的表示出水平(P0.05)(圖4A)。2.5、JNK抑制劑sp600125對人口腔癌KB細胞克隆構(gòu)成和侵襲的影響用10mol/L的JNK抑制劑sp600125處理KB細胞,平板克隆構(gòu)成實驗的結(jié)果顯示:sp600125作用于細胞10天后,顯著抑制KB細胞克隆數(shù)量的構(gòu)成(P0.05),Transwell實驗的結(jié)果表示清楚:sp600125預(yù)處理細胞24h,在小室中培養(yǎng)12h后,侵襲穿過基質(zhì)膠的KB細胞數(shù)量,較對照組明顯減少(P0.05)(圖4B)。3、討論天然化合物一直在世界醫(yī)療保健和傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)系統(tǒng)中發(fā)揮著宏大的作用。水飛薊賓作為長期應(yīng)用的保肝藥被發(fā)如今抗腫瘤活性方面有良好的開發(fā)前景。研究表示清楚水飛薊賓可在癌變經(jīng)過的不同階段發(fā)揮作用:抑制增殖、調(diào)節(jié)細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制新生血管生成、抑制遷移等[11]。因而,作為一種潛在的抗癌藥物,水飛薊賓的作用機制值得深切進入研究。本研究以人口腔上皮樣癌細胞KB細胞株為研究對象,討論水飛薊賓對其增殖及侵襲的影響并分析其潛在的抗腫瘤作用機制。圖4JNK抑制劑sp600125對KB細胞中VEGF和MMP-9蛋白的表示出(A)以及KB細胞的集落構(gòu)成和侵襲(B)的影響(結(jié)晶紫100)Fig.4InhibitionofVEGFandMMP-9expressioninKBcells(A)andtheKBcellscolonyformationandinvasionbytreatingwith10mol/Lsp600125(B)(violetcrystal100)異常增殖是腫瘤細胞的基本特征,能否抑制腫瘤細胞增殖是抗腫瘤藥物的前提條件[15]。本試驗通過CCK-8和平板克隆試驗研究水飛薊賓對KB細胞增殖的抑制作用。CCK-8試驗結(jié)果顯示,水飛薊賓能顯著抑制KB細胞的增長,且隨著水飛薊賓濃度的增加和作用時間的延長,抑制作用逐步加強,呈時間和劑量依靠性。平板克隆試驗結(jié)果顯示,隨著水飛薊賓濃度的升高,克隆構(gòu)成的數(shù)量明顯減少。兩者共同表示清楚了水飛薊賓對KB細胞增殖具有抑制作用。侵襲與轉(zhuǎn)移是腫瘤惡化的標志,本研究通過Transwell侵襲實驗研究證實了水飛薊賓對KB細胞侵襲的抑制作用。VEGF是一種重要的促血管生成因子,作用于血管內(nèi)皮細胞,腫瘤組織新生血管的生成是腫瘤細胞增殖并發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[16]。除此之外,毀壞和降解細胞外基質(zhì),是腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移經(jīng)過中的關(guān)鍵步驟[17]?；|(zhì)金屬蛋白酶類MMPs是一種腫瘤細胞外表釋放的蛋白水解酶,能夠降解細胞外基質(zhì),毀壞基底膜,進而使腫瘤細胞侵入血管并向周圍組織浸潤擴散[18]。本研究通過Westernblot實驗證實水飛薊賓顯著抑制VEGF和MMP-9的表示出,并且顯著抑制絲裂原活化蛋白激酶JNK的磷酸化水平,克隆構(gòu)成及Transwell實驗表示清楚水飛薊賓抑制了細胞的增殖與轉(zhuǎn)移。因而揣測水飛薊賓是通過對JNK通路的抑制,進而對VEGF和MMP-9的蛋白表示出產(chǎn)生影響,最終抑制KB細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。隨后使用JNK抑制劑sp600125進行佐證,結(jié)果表示清楚sp600125抑制JNK的活化后,VEGF和MMP-9蛋白的表示出水平明顯下調(diào),KB細胞集落的構(gòu)成以及Transwell侵襲的細胞數(shù)量顯著降低。使用sp600125的結(jié)果提示,在KB細胞中,JNK通路在VEGF和MMP-9的表示出中發(fā)揮重要作用,最終影響了KB細胞的增殖與轉(zhuǎn)移。綜上所述,水飛薊賓可能通過抑制JNK的活化,進而抑制VEGF和MMP-9的蛋白表示出,最終抑制人口腔上皮癌細胞KB細胞株的增殖和轉(zhuǎn)移。以下為參考文獻[1]StJohnMA.Inflammatorymediatorsdrivemetastasisanddrugresistanceinheadandnecksquamouscellcarcinoma[J].TheLaryngoscope,2021(125):S1-S11.[2]KimJS,OhD,YimMJ,etal.BerberineinducesFasL-relatedapoptosisthroughp38activationinKBhumanoralcancercells[J].OncologyReports,2021,33(4):1775-1782.[3]HUANGZH,CHENK,ZHANGTZ.Researchprogressoftheeffectsofdifferenttreatmentsonsurvivalqualityofpatientswithoralcancer[J].HainanMedicalJournal,2021,29(6):834-837.[黃澤浩,陳坤,張鐵柱.不同治療方式對口腔癌患者生存質(zhì)量影響的研究進展[J].海南醫(yī)學(xué),2021,29(6):834-837.][4]EidA,LiS,GarzaR,etal.Chemotherapyfororalandmaxillofacialtumors:Anupdate[J].OralandMaxillofacialSurgeryClinics,2020,26(2):163-169.[5]PolachiN,BaiG,LiT,etal.Modulatoryeffectsofsilibinininvariouscellsignalingpathwaysagainstliverdisordersandcancer-Acomprehensivereview[J].EuropeanJournalofMedicinalChemistry,2021(123):577-595.[6]ZhangY,GeY,ChenY,etal.Cellularandmolecularmechanismsofsilibinininducescell-cyclearrestandapoptosisonHeLacells[J].CellBiochemistryandFunction,2020,30(3):243-248.[7]WuK,NingZ,ZengJ,etal.Silibinininhibits-catenin/ZEB1signalingandsuppressesbladdercancermetastasisviadual-blockingepithelial-mesenchymaltransitionandstemness[J].CellularSignalling,2020,25(12):2625-2633.[8]AkhtarR,AliM,MahmoodS,etal.Anti-proliferativeactionofsilibininonhumancolonadenomatouscancerHT-29cells[J].NutricionHospitalaria,2020,29(2):388-392.[9]MateenS,RainaK,AgarwalR.Chemopreventiveandanti-cancerefficacyofsilibininagainstgrowthandprogressionoflungcancer[J].NutritionandCancer,2020,65(sup1):3-11.[10]MomenyM,GhasemiR,ValentiG,etal.Effectsofsilibininongrowthandinvasivepropertiesofhumanovariancarcinomacellsthroughsuppressionofheregulin/HER3pathway[J].TumorBiology,2021,37(3):3913-3923.[11]ZHANGYX,YUM,RONGJM,etal.Thepleiotropicmechanismsofsilibininagainstcancers[J].GuangdongChemicalIndustry,2021,44(22):94-96.[張元新,于明,榮家閔,等.水飛薊賓抗腫瘤作用機制研究進展[J].廣東化工,2021,44(22):94-96.][12]LIYP,LISQ,CHENGXB,etal.InhibitioneffectsofsilibininonhumantonguecancercelllineTca[J].JournalofPracticalStomatology,2018,25(2):281-284.[李云鵬,李紹青,程曉兵,等.水飛薊賓對人舌癌細胞Tca的抑制作用[J].實用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2018,25(2):281-284.][13]ChenPN