第二單元原料預(yù)處理技術(shù)課件

第二單元原料預(yù)處理技術(shù)/第二單元原料預(yù)處理技術(shù)/學(xué)習(xí)目標(biāo)1.發(fā)酵液預(yù)處理的目的和主要方法及其原理。2.常用的細(xì)胞破碎方法及原理。3.生物分離常用的離心、過(guò)濾方法。/學(xué)習(xí)目標(biāo)1.發(fā)酵液預(yù)處理的目的和主要方法及其原理。/2第一節(jié)概述微生物發(fā)酵或動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液(或培養(yǎng)液)中除含有所需的生物活性物質(zhì)外，還存在大量的菌體、細(xì)胞、胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物及剩余的培養(yǎng)基成分等。/第一節(jié)概述微生物發(fā)酵或動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液(或培養(yǎng)3常規(guī)處理方法先將菌體或細(xì)胞、固態(tài)培養(yǎng)基等固體懸浮顆粒與可溶性組分分離(即固-液分離)，然后再進(jìn)行后續(xù)的分離純化操作單元。對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物來(lái)說(shuō)，應(yīng)先經(jīng)細(xì)胞破碎，使生物活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移到液相后，再經(jīng)固-液分離除去細(xì)胞碎片等固體雜質(zhì)。/常規(guī)處理方法先將菌體或細(xì)胞、固態(tài)培養(yǎng)基等固體懸浮顆粒與可溶性4常用的固-液分離方法主要是：過(guò)濾和離心。但是不同來(lái)源的培養(yǎng)液和發(fā)酵液其固-液分離速度差異很大，取決于該介質(zhì)的理化性狀，主要是細(xì)胞或菌體的大小和介質(zhì)的黏度。細(xì)胞絮凝技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展很快的一種行之有效的方法。/常用的固-液分離方法主要是：過(guò)濾和離心。/5發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，對(duì)后續(xù)分離影響最大的是高價(jià)無(wú)機(jī)離子(Ca2+,Mg2+,Fe3+)和雜蛋白等。在預(yù)處理時(shí)，應(yīng)盡量出去這些物質(zhì)。/發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，對(duì)后續(xù)分離影響最大的是高價(jià)無(wú)機(jī)離子(Ca26第二節(jié)預(yù)處理的目的和方法一、預(yù)處理的目的⑴改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進(jìn)從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離器的效率。⑵盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的某一相中(多數(shù)是液相)。⑶去除發(fā)酵液中部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作。/第二節(jié)預(yù)處理的目的和方法一、預(yù)處理的目的/7二、預(yù)處理方法1.加熱法此法的關(guān)鍵取決于產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性。是最簡(jiǎn)單廉價(jià)的預(yù)處理方法，加熱可降低懸浮液的強(qiáng)度，加速聚集作用，去除某些蛋白質(zhì)雜質(zhì)，破壞凝膠狀結(jié)構(gòu)，增加濾餅孔隙度，使固液分離變?nèi)菀住?二、預(yù)處理方法1.加熱法/82.調(diào)節(jié)懸浮液的pH值這個(gè)方法也很簡(jiǎn)便。全細(xì)胞的聚集作用取決于pH值的大小，恰當(dāng)?shù)膒H能夠促進(jìn)聚集作用，一般用草酸或無(wú)機(jī)酸或堿來(lái)調(diào)節(jié)。/2.調(diào)節(jié)懸浮液的pH值/93.凝聚和絮凝都是懸浮液預(yù)處理的重要方法。都是將化學(xué)藥劑預(yù)先投入懸浮液，改變細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，再進(jìn)行分離。/3.凝聚和絮凝/10凝聚和絮凝都能有效增加顆粒尺寸，增大顆粒的沉降或浮選速率，提高濾餅的滲透性或在深層過(guò)濾時(shí)產(chǎn)生較好的顆粒保留作用。深層過(guò)濾：顆粒尺寸比介質(zhì)的孔道直徑小得多，但孔道彎曲細(xì)長(zhǎng)，顆粒進(jìn)入之后很容易被截住，更由于流體流過(guò)時(shí)所引起的擠壓和沖撞作用，顆粒緊附在孔道的壁面上，這種過(guò)濾是在介質(zhì)內(nèi)部進(jìn)行的，介質(zhì)表面無(wú)濾餅形成。/凝聚和絮凝都能有效增加顆粒尺寸，增大顆粒的沉降或浮選速率，提11凝聚和絮凝凝聚：在投加的化學(xué)物質(zhì)(如：水解的凝聚劑，鋁、鐵的鹽類或石灰等)作用下，膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚集成1mm大小的塊狀凝聚體的過(guò)程。凝聚劑的作用：對(duì)粒子表面電荷的中和；消除雙電荷層而脫穩(wěn)；通過(guò)氫鍵或其他復(fù)雜的形式與粒子結(jié)合發(fā)生凝聚。/凝聚和絮凝凝聚：在投加的化學(xué)物質(zhì)(如：水解的凝聚劑，鋁、鐵的12凝聚和絮凝絮凝：使用絮凝劑(通常是天然或合成的大分子質(zhì)量聚電解質(zhì))將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm大小絮凝團(tuán)的過(guò)程。絮凝劑的作用：橋架作用。/凝聚和絮凝絮凝：使用絮凝劑(通常是天然或合成的大分子質(zhì)量聚電13絮凝過(guò)程

/絮凝過(guò)程

14絮凝劑相對(duì)凝聚劑而言更昂貴，其使用劑量必須正確使用并仔細(xì)優(yōu)化。最佳的絮凝劑使用劑量為：一般為大概一半的粒子表面被聚合物覆蓋時(shí)所使用的絮凝劑劑量。/絮凝劑相對(duì)凝聚劑而言更昂貴，其使用劑量必須正確使用并仔細(xì)優(yōu)化15凝聚劑和絮凝劑的類型凝聚劑：主要是無(wú)機(jī)類電解質(zhì)，大多為陽(yáng)離子型，分無(wú)機(jī)鹽類、金屬氫氧化物類和聚合無(wú)機(jī)鹽類等。絮凝劑：其官能團(tuán)分為陰離子、陽(yáng)離子和非離子三大類型。/凝聚劑和絮凝劑的類型凝聚劑：主要是無(wú)機(jī)類電解質(zhì)，大多為陽(yáng)離子164.去除雜蛋白質(zhì)的其他方法⑴等電沉淀法蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，能沉淀除去。很多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在酸性范圍內(nèi)(pH為4.0-5.5)。有些蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)仍有溶解度，可結(jié)合其他方法。/4.去除雜蛋白質(zhì)的其他方法⑴等電沉淀法/17⑵變性沉淀蛋白質(zhì)從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則結(jié)構(gòu)的過(guò)程稱變性，變性蛋白質(zhì)在水中的溶解度較小而產(chǎn)生沉淀。方法：加熱、大幅改變pH、加有機(jī)溶劑(丙酮、乙醇等)、加重金屬離子(Ag+,Cu2+,Pb2+等)、加有機(jī)酸(三氯乙酸、水楊酸、苦味酸、鞣酸、過(guò)氯酸等)及表面活性劑。/⑵變性沉淀/18⑶吸附吸附作用常能有效除去雜蛋白質(zhì)。在發(fā)酵液中加入一些反應(yīng)劑，它們相互反應(yīng)生成的沉淀物對(duì)蛋白質(zhì)具吸附作用而使其凝固。/⑶吸附/195.不溶性多糖的去除不溶性多糖較多時(shí)，發(fā)酵液黏度增大，固液分離困難，采用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖以提高過(guò)濾速度。如在蛋白酶發(fā)酵液中加入淀粉酶，能將培養(yǎng)基中多余的淀粉水解成單糖，降低發(fā)酵液黏度，提高濾速。/5.不溶性多糖的去除不溶性多糖較多時(shí)，發(fā)酵液黏度增大，固液分206.高價(jià)金屬離子的去除對(duì)成品質(zhì)量影響較大的無(wú)機(jī)雜質(zhì)主要有：Ca2+,Mg2+,Fe3+等高價(jià)金屬離子，預(yù)處理中應(yīng)將它們除去。/6.高價(jià)金屬離子的去除對(duì)成品質(zhì)量影響較大的無(wú)機(jī)雜質(zhì)主要有：C21

1、概念

細(xì)胞破碎是用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法來(lái)破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的方法。

細(xì)胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)

胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來(lái)的技術(shù)。

2、目的

破壞細(xì)胞外圍，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)。第三節(jié)細(xì)胞破碎技術(shù)

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1、概念

細(xì)胞破碎是用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法223.原理⑴細(xì)胞的結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁的破碎最關(guān)鍵。動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，易于破碎。植物和微生物細(xì)胞的細(xì)胞壁堅(jiān)固，破碎困難。/3.原理/23①細(xì)菌革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖層組成，細(xì)胞壁厚，為15-50nm。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁在肽聚糖外側(cè)還有脂蛋白和脂多糖及磷脂構(gòu)成的兩層外壁層，肽聚糖層1.5-2nm，外壁層8-10nm。因此革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁比革蘭氏陰性菌堅(jiān)固，較難破碎。/①細(xì)菌/24細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成圖3.1

細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)

/細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成圖3.1細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)/25②真菌和酵母細(xì)胞壁呈絲狀，比革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁厚，約60nm，更難破碎。③霉菌細(xì)胞壁較厚，為100-250nm。④哺乳類細(xì)胞、嗜鹽菌和支原體哺乳類細(xì)胞和嗜鹽菌缺乏堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，支原體沒(méi)有細(xì)胞壁，易破碎。/②真菌和酵母/26⑤藻類細(xì)胞壁較復(fù)雜，其主要成分是纖維狀的多糖類物質(zhì)。/⑤藻類/27細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成微生物革蘭式陽(yáng)性菌革蘭式陰性菌酵母壁厚（nm）20～8010～25100～300層單層多層多層主要組成肽聚糖(40~90%)肽聚糖(5~10%)葡聚糖(30~40%)多糖脂蛋白甘露聚糖（30％）胞壁酸脂多糖蛋白質(zhì)磷脂蛋白質(zhì)脂多糖蛋白質(zhì)脂類破碎難易程度難相對(duì)易最難各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成/細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成微生物革蘭式陽(yáng)性菌革蘭式陰性菌酵母壁厚（n28⑵細(xì)胞破碎和產(chǎn)物釋放原理細(xì)胞破碎主要采用各種機(jī)械破碎法和化學(xué)破碎法，或二者的結(jié)合。機(jī)械破碎中細(xì)胞所受的機(jī)械作用力主要有壓縮力和剪切力?；瘜W(xué)破碎又稱化學(xué)滲透，利用化學(xué)或生化試劑(酶)改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增大胞內(nèi)物質(zhì)溶解速率；或完全溶解細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體后，在滲透壓的作用下使細(xì)胞膜破裂而釋放胞內(nèi)物質(zhì)。/⑵細(xì)胞破碎和產(chǎn)物釋放原理細(xì)胞破碎主要采用各種機(jī)械破碎法和化學(xué)29破碎方法細(xì)胞破碎機(jī)理/破碎方法細(xì)胞破碎機(jī)理/30二、細(xì)胞破碎法破碎方式機(jī)械法非機(jī)械法液體剪切作用固體剪切作用干燥處理溶胞作用珠磨法壓榨高壓勻漿超聲破碎酶溶法化學(xué)法物理法細(xì)胞破碎方法分類/二、細(xì)胞破碎法破碎方式機(jī)械法非機(jī)械法液體剪固體剪干燥溶胞珠磨31細(xì)胞壁的破碎破碎方法的選擇：

破碎目的待破碎生物體的類型破碎目的：獲取產(chǎn)品，考慮破碎收率和能耗；研究胞內(nèi)產(chǎn)物在體內(nèi)的功能，宜采用軟處理。待破碎生物體的類型：不同生物體對(duì)破碎有不同的敏感度/細(xì)胞壁的破碎破碎方法的選擇：破碎目的/32細(xì)胞壁的破碎

細(xì)胞對(duì)破碎的敏感度細(xì)胞聲波攪拌減壓冷凍壓力動(dòng)物細(xì)胞7777革蘭式陰性芽孢桿菌和球菌6566革蘭式陽(yáng)性芽孢桿菌5（4）54酵母3.5342.5革蘭式陽(yáng)性球菌3.5（2）325孢子2（1）21菌絲16（1）5

生物體的大小，形態(tài)，齡期，品系，生長(zhǎng)條件，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，pH，溫度以及細(xì)胞的變化也影響對(duì)破碎的敏感度。/細(xì)胞壁的破碎細(xì)胞對(duì)破碎的敏感度細(xì)胞聲波攪拌減壓冷凍331.機(jī)械破碎方法HC23-高壓細(xì)胞破碎機(jī)⑴高壓勻漿法DY89-1型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)/1.機(jī)械破碎方法HC23-高壓細(xì)胞破碎機(jī)⑴高壓勻漿法DY834作用機(jī)理：細(xì)胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速(可達(dá)到450m／s)噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。高壓勻漿器的操作壓力通常為50～70MPa。

⑴高壓勻漿法/作用機(jī)理：細(xì)胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速(可351.機(jī)械破碎方法影響細(xì)胞破碎的因素：溫度壓力循環(huán)操作次數(shù)細(xì)胞濃度閥座形式⑴高壓勻漿法/1.機(jī)械破碎方法影響細(xì)胞破碎的因素：⑴高壓勻漿法/36影響破碎效率的因素溫度：破碎率隨溫度的增加而增加例如：操作溫度由5℃增加到30℃，破碎率約提高1.5倍。高溫對(duì)破碎有利，但應(yīng)考慮熱變性壓力每增加10MPa，溫度2℃。適用于酵母和細(xì)菌細(xì)胞的破碎。高壓勻漿法/影響破碎效率的因素溫度：高壓勻漿法/371.機(jī)械破碎方法珠磨機(jī)簡(jiǎn)圖⑵

珠磨法生產(chǎn)廠商:

瑞士WAB公司德國(guó)西門子機(jī)械公司形式：立式臥式（效率高）/1.機(jī)械破碎方法珠磨機(jī)簡(jiǎn)圖⑵珠磨法生產(chǎn)廠商:/38原理：在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運(yùn)動(dòng)，微球和微球之間以及微球和細(xì)胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細(xì)胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。產(chǎn)熱由夾套帶走。珠磨法/原理：在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運(yùn)動(dòng)，微球和微球之間以及微39珠磨機(jī)主體：立式和臥式圓筒型腔體一般，臥式比立式珠磨破碎效率高：因?yàn)榱⑹綑C(jī)中向上流動(dòng)的液體在某種程度上會(huì)使研磨珠流態(tài)化，從而降低其研磨效率。研磨珠：玻璃(密度為2.5g／cm3)或氧化鋯(密度為6.0g／cm3)微球(粒徑約0.1～10mm)，填充率為80％～85％。/珠磨機(jī)主體：立式和臥式圓筒型腔體/401.機(jī)械破碎方法動(dòng)力學(xué)方程：遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程珠磨法R：t時(shí)間內(nèi)釋放的蛋白質(zhì)數(shù)量（mg/g）Rm：能釋放的蛋白質(zhì)最大數(shù)量，即100％破碎k：破碎速率常數(shù)，與珠粒大小、填充率、細(xì)胞濃度等有關(guān)其中：S＝R/Rm，破碎率/1.機(jī)械破碎方法動(dòng)力學(xué)方程：遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程珠磨法R：t411.機(jī)械破碎方法影響破碎效率的因素：轉(zhuǎn)盤外緣速度細(xì)胞濃度珠粒大小及裝載量溫度流速珠磨法/1.機(jī)械破碎方法影響破碎效率的因素：珠磨法/421.機(jī)械破碎方法珠磨法破碎過(guò)程產(chǎn)生大量熱能，設(shè)計(jì)時(shí)需考慮換熱問(wèn)題。適用于絕大多數(shù)真菌菌絲和藻類等微生物細(xì)胞的破碎。影響破碎率的操作參數(shù)較多，操作過(guò)程優(yōu)化設(shè)計(jì)較復(fù)雜。珠磨法/1.機(jī)械破碎方法珠磨法/431.機(jī)械破碎方法原理：細(xì)胞是彈性體，比一般剛性固體粒子難于破碎。將彈性細(xì)胞冷凍使其成為剛性球體，降低破碎難度，撞擊破碎正是基于這樣的原理。操作：細(xì)胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)(凍結(jié)速度為每分鐘數(shù)千攝氏度)，形成粒徑小于50um的微粒子。高速載氣(如氮?dú)?，氣流約為300m/s)將凍結(jié)的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結(jié)的細(xì)胞發(fā)生破碎。⑶撞擊破碎法/1.機(jī)械破碎方法原理：⑶撞擊破碎法/441.機(jī)械破碎方法特點(diǎn)：細(xì)胞破碎僅發(fā)生在與撞擊板撞擊的一瞬間，細(xì)胞破碎均勻，可避免反復(fù)受力發(fā)生過(guò)度破碎的現(xiàn)象。細(xì)胞破碎程度可通過(guò)無(wú)級(jí)調(diào)節(jié)載氣壓力(流速)控制，避免細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，主要用于細(xì)胞器(如線粒體、葉綠體等)的回收。撞擊破碎適用于微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的破碎。⑶撞擊破碎法/1.機(jī)械破碎方法特點(diǎn)：⑶撞擊破碎法/451.機(jī)械破碎方法JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)⑷超聲波法/1.機(jī)械破碎方法JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)⑷超聲波法461.機(jī)械破碎方法作用機(jī)理：

在超聲波作用下，液體發(fā)生空化作用(cavitaton)，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。超聲波法/1.機(jī)械破碎方法作用機(jī)理：超聲波法/471.機(jī)械破碎方法超聲波的負(fù)面影響：1、溫度上升：懸浮液預(yù)冷，夾套冷卻短期冷卻與短期破碎交替。2、超聲處理會(huì)引起諸如游離基這樣的化學(xué)效應(yīng)，破壞目的產(chǎn)物，可加入游離基清除劑（組氨酸，谷胱甘肽等）予以消除。3.影響因素：聲強(qiáng)、聲頻、溫度、時(shí)間、離子強(qiáng)度、pH、細(xì)胞類型。超聲波法/1.機(jī)械破碎方法超聲波的負(fù)面影響：超聲波法/481.機(jī)械破碎方法機(jī)械法破碎細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：內(nèi)含物全部釋放時(shí)間短，效率高，成本低通用性強(qiáng)，適于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)缺點(diǎn)：需要高的能量產(chǎn)生高溫，高剪切力，引起產(chǎn)品變性失活非專一性，碎片分布寬，給分離造成困難/1.機(jī)械破碎方法機(jī)械法破碎細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)：/492.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)作用機(jī)理：用化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分處理方法：酸堿處理；化學(xué)試劑；表面活性劑；有機(jī)溶劑EDTA螯合劑；變性劑化學(xué)滲透法/2.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)作用機(jī)理：化學(xué)滲透法/502.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)⑴酸堿處理調(diào)節(jié)pH，改變蛋白質(zhì)的荷電性質(zhì)，提高產(chǎn)物的溶解度。⑵化學(xué)試劑處理用表面活性劑或有機(jī)溶劑(甲苯)處理細(xì)胞，增大細(xì)胞壁的通透性，降低胞內(nèi)產(chǎn)物的相互作用，使之容易釋放。/2.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)⑴酸堿處理/512.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)物釋放有一定的選擇性不需要特殊設(shè)備細(xì)胞外形保持完整，細(xì)胞碎片少，漿液粘度低，利于后續(xù)分離化學(xué)滲透法缺點(diǎn)：通用性差時(shí)間長(zhǎng)，效率低某些化學(xué)試劑有毒/2.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)滲透法缺點(diǎn)：/522.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)應(yīng)用：檢測(cè)胞內(nèi)酶活性釋放胞內(nèi)物質(zhì)研究化學(xué)滲透法/2.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)應(yīng)用：化學(xué)滲透法/532.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法

(非機(jī)械法)作用機(jī)理：酶溶法(Enzymaticlysis)利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大腦內(nèi)產(chǎn)物的遇透性。溶菌酶適用于革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的分解，應(yīng)用于革蘭氏陰性菌時(shí)，需輔以EDTA使之更有效地作用于細(xì)胞壁。真核細(xì)胞的細(xì)胞壁不同于原核細(xì)胞，需采用不同的酶。酵母細(xì)胞的酶溶需用Zymo1yase(幾種細(xì)菌酶的混合物)、-1,6—葡聚糖酶(或甘露糖酶）；破壞植物細(xì)胞壁需用纖維素酶。酶法胞溶/2.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法

(非機(jī)械法)作用機(jī)理：酶溶法(En542.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法

(非機(jī)械法)優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)品釋放選擇性高抽提速率和收率高產(chǎn)品破壞少pH、溫度外界條件要求低不殘留細(xì)胞碎片酶法胞溶缺點(diǎn)：費(fèi)用高通用性差存在產(chǎn)品抑制不適于工業(yè)生產(chǎn)/2.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法

(非機(jī)械法)優(yōu)點(diǎn)：酶法胞溶缺點(diǎn)：/552.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法

(非機(jī)械法)應(yīng)用：原生質(zhì)體融合釋放出克隆出的胞內(nèi)蛋白制取特殊的壁葡萄糖聚合物與機(jī)械法破碎細(xì)胞協(xié)同使用從細(xì)胞內(nèi)不同的位置選擇性的釋放蛋白酶法胞溶/2.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法

(非機(jī)械法)應(yīng)用：酶法胞溶/563.物理滲透法滲透壓沖擊法：

將細(xì)胞置于高滲透壓的介質(zhì)中，使之脫水收縮，達(dá)到平衡后，將介質(zhì)突然稀釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖液中，在滲透壓的作用下，外界的水向細(xì)胞內(nèi)滲透，使細(xì)胞變得腫脹，膨脹到一定程度，細(xì)胞破裂，它的內(nèi)含物隨即釋放到溶液中。物理法/3.物理滲透法滲透壓沖擊法：物理法/573.物理滲透法滲透壓沖擊法：

滲透壓沖擊(Osmoticshock)是在各種細(xì)胞破碎法中最為溫和的一種，適用于易于破碎的細(xì)咆，如動(dòng)物細(xì)胞和革蘭氏陰性菌。物理法/3.物理滲透法滲透壓沖擊法：物理法/583.物理滲透法凍融法：

將細(xì)胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，此凍結(jié)融化操作反復(fù)進(jìn)行多次，使細(xì)胞受到破壞。凍結(jié)的作用是破壞細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)，增加其親水性和通透性。另一方面，出于胞內(nèi)水結(jié)晶使胞內(nèi)外產(chǎn)生溶液濃度差，在滲透壓作用下引起細(xì)胞膨脹而破裂。物理法/3.物理滲透法凍融法：物理法/593.物理滲透法凍融法：操作：將細(xì)胞急劇凍結(jié)至-20～-15℃，使之凝固，然后在室溫緩慢融化，此凍結(jié)融化操作反復(fù)進(jìn)行多次，使細(xì)胞受到破壞。缺點(diǎn)：反復(fù)凍融使蛋白質(zhì)變性，影響活性蛋白質(zhì)的回收率。凍融法適用于比較脆弱的菌體。物理法/3.物理滲透法凍融法：物理法/603.物理滲透法干燥法：

將細(xì)胞用不同的方法干燥（真空、冷凍、噴霧和氣流等），細(xì)胞膜結(jié)合水喪失，滲透性發(fā)生變化而破裂缺點(diǎn)：條件變化劇烈，易引起生物物質(zhì)變性物理法/3.物理滲透法干燥法：物理法/61機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法的比較比較項(xiàng)目機(jī)械法非機(jī)械法比較項(xiàng)目機(jī)械法非機(jī)械法破碎機(jī)理切碎細(xì)胞溶解局部壁膜效率效率高效率低碎片大小碎片細(xì)小碎片較大設(shè)備需專用設(shè)備不需專用設(shè)備內(nèi)含物釋放全部部分通用性強(qiáng)差粘度高（核酸多）低（核酸少）經(jīng)濟(jì)成本低成本高時(shí)間時(shí)間短時(shí)間長(zhǎng)應(yīng)用范圍實(shí)驗(yàn)室、工業(yè)范圍實(shí)驗(yàn)室范圍/機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法的比較比較項(xiàng)目機(jī)械法非機(jī)械法比較項(xiàng)目62破碎技術(shù)的選擇原則：目的產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)中，需機(jī)械破碎法目的產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，可采用非機(jī)械破碎法目的產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合，可采用兩種方法結(jié)合/破碎技術(shù)的選擇原則：/63破碎技術(shù)的研究發(fā)展方向：多種破碎方法結(jié)合與上游過(guò)程結(jié)合1、培養(yǎng)過(guò)程控制2、寄主細(xì)胞選擇3、克隆噬菌體溶解基因4、耐高溫產(chǎn)品的基因表達(dá)與下游結(jié)合從后分離過(guò)程考察細(xì)胞破碎技術(shù)/破碎技術(shù)的研究發(fā)展方向：/64第四節(jié)離心沉降與過(guò)濾分離技術(shù)一、離心沉降㈠沉降基本原理重力沉降：適用于分離較大的顆粒。重力沉降過(guò)程中固體顆粒受到重力、浮力和摩擦阻力的作用。當(dāng)浮力、摩擦阻力和重力達(dá)到平衡時(shí)，球形固體顆粒勻速沉降。/第四節(jié)離心沉降與過(guò)濾分離技術(shù)一、離心沉降/65㈠沉降基本原理沉降速度：式中：dp—球形粒子直徑，m

ρs—粒子的密度，kg/m3

ρL—介質(zhì)的密度，kg/m3g—重力加速度，m/s2μL

—流體介質(zhì)的黏度，Pa·s/㈠沉降基本原理沉降速度：/66離心沉降離心沉降：

依靠慣性離心力的作用而實(shí)現(xiàn)的沉降過(guò)程。

適于分離兩相密度差較小，顆粒粒度較細(xì)的非均相物系。氣固物系：旋風(fēng)分離器；液固物系：旋液分離器或沉降離心機(jī)。/離心沉降離心沉降：67離心沉降離心沉降速度：式中：N—轉(zhuǎn)鼓轉(zhuǎn)速，r/minr—球形粒子半徑，mS—沉降系數(shù)

ω—轉(zhuǎn)鼓的旋轉(zhuǎn)角速度，rad/s/離心沉降離心沉降速度：/68離心沉降從該式可以看出：①當(dāng)ρs＞ρL，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當(dāng)ρs=ρL，則S=0，粒子到達(dá)某一位置后達(dá)到平衡。③當(dāng)ρs＜ρL，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。蛋白質(zhì)離心沉降時(shí)，蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量越大，沉降系數(shù)越大，離心沉降速度越大。/離心沉降從該式可以看出：/69㈡離心分離法1.差速離心分離法原理：利用不同粒子在離心力場(chǎng)中沉降的差別(大而重的顆粒沉降最快，最先到達(dá)底部)，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過(guò)不斷增加相對(duì)離心力，使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分級(jí)沉淀。/㈡離心分離法1.差速離心分離法/70操作：一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開(kāi)，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：操作最簡(jiǎn)便，使用最廣泛。缺點(diǎn)：分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種粒子不容易分開(kāi)，常用于粗制品提取。/操作：/712.區(qū)帶離心分離法根據(jù)操作條件不同，分為差速區(qū)帶離心和平衡區(qū)帶離心。3.差速區(qū)帶離心分離法在離心前將密度梯度介質(zhì)(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)裝入離心管內(nèi)，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部，同梯度液一起離心。/2.區(qū)帶離心分離法/72差速區(qū)帶離心分離法離心后在近旋轉(zhuǎn)軸(r1)處的介質(zhì)密度最小，離旋轉(zhuǎn)軸最遠(yuǎn)(r2)處介質(zhì)的密度最大，但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度，即ρs＞ρL。梯度液在離心過(guò)程中和離心完畢后，取樣時(shí)起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用，避免分層粒子的再混和。此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是應(yīng)用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。/差速區(qū)帶離心分離法離心后在近旋轉(zhuǎn)軸(r1)處的介質(zhì)密度最小，734.等密度離心分離法在離心前預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度，密度梯度液包含被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開(kāi)始后，梯度液形成底濃頂稀的密度梯度，原來(lái)分布均勻的粒子也發(fā)生重新分布。/4.等密度離心分離法/74在管頂處粒子密度大于介質(zhì)密度，粒子沉降；當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于粒子密度，粒子上??；粒子進(jìn)入它本身的密度位置，粒子不再移動(dòng)。只要轉(zhuǎn)速、溫度不變，延長(zhǎng)離心時(shí)間也不改變粒子的成帶位置。此法應(yīng)用于物質(zhì)的大小相近，密度差異較大時(shí)。/在管頂處粒子密度大于介質(zhì)密度，粒子沉降；當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于75

㈢

Centrifuges離心分離設(shè)備/

㈢Centrifuges離心分離設(shè)備/76//77

常用的離心機(jī)：a、Tubularbowl:管式離心機(jī)最簡(jiǎn)單，可提供較大離心力；管狀離心機(jī)可以冷卻，在蛋白質(zhì)生產(chǎn)中很有利；懸浮液由管底進(jìn)，澄清液由管口流出。//78沉降離心機(jī)類型

管式離心機(jī)特點(diǎn)是轉(zhuǎn)鼓(管)直徑小、長(zhǎng)度大、轉(zhuǎn)速高、分離效率很高，可以處理顆粒粒徑為0.01mm的懸浮液和難分離的乳濁液?？蛇B續(xù)操作，懸浮液或乳濁液由轉(zhuǎn)鼓下端加入，被轉(zhuǎn)鼓內(nèi)的縱向肋板帶動(dòng)迅速達(dá)到與轉(zhuǎn)鼓同角速度旋轉(zhuǎn)。在離心力作用下，顆粒或重液層甩向鼓壁由重液出口引出，輕液則從轉(zhuǎn)鼓中心部位溢出。離心分離因數(shù)可達(dá)65,000，工業(yè)上可用于油水分離，實(shí)驗(yàn)室中可用于分離微生物和蛋白質(zhì)。管式離心機(jī)示意圖/沉降離心機(jī)類型管式離心機(jī)特點(diǎn)是轉(zhuǎn)鼓(管)直徑小、長(zhǎng)度79Tubularbowl/Tubularbowl/80管壁上沉積物為濃漿*可連續(xù)加料至流出物固體損失使離心不能正常進(jìn)行*須定時(shí)拆卸、清洗，這種間斷性操作也是最大的缺點(diǎn)//81SRBA2圓筒式離心機(jī)懸浮液沿圓筒的旋轉(zhuǎn)軸連續(xù)加入，通過(guò)筒壁上的小孔流出中空柱狀料液的內(nèi)徑為一常數(shù)，不隨料液的加入而改變

濾餅在筒壁上沉積/SRBA2圓筒式離心機(jī)懸浮液沿圓筒的旋轉(zhuǎn)軸連續(xù)加入，通過(guò)筒82沉降離心機(jī)適用于各種懸浮液或乳濁液、尤其是粒度細(xì)小、密度差不大的體系的分離。離心分離因素達(dá)50,000以上的超高速離心機(jī)甚至可以使不同分子量的蛋白質(zhì)分子在具有密度梯度的溶液中分級(jí)。沉降離心機(jī)工作原理/沉降離心機(jī)適用于各種懸浮液或乳濁液、尤其是粒度細(xì)小、密度差83沉降離心機(jī)類型

碟式離心機(jī)(薄層分離沉降離心機(jī))轉(zhuǎn)鼓內(nèi)裝有一疊隨轉(zhuǎn)鼓旋轉(zhuǎn)的倒錐形碟片，碟片間隙為0.5～1.5mm，分離因素可達(dá)3000~10000。懸浮液由中心管引入轉(zhuǎn)鼓，分配在碟片之間形成薄層流動(dòng)。在離心力作用下，顆粒沉降到碟片內(nèi)側(cè)表面并向外滑動(dòng)。清液則沿碟片外側(cè)表面向內(nèi)流動(dòng)。碟片擴(kuò)展了沉降面，縮短了沉降距離，故具有較大的生產(chǎn)能力和較高的分離效率，適于處理粒徑0.1～100mm、固含量小于25%的懸浮液。噴嘴排渣碟式離心機(jī)/沉降離心機(jī)類型碟式離心機(jī)(薄層分離沉降離心機(jī))轉(zhuǎn)鼓內(nèi)裝84b、Disctypecentrifuge碟片式離心機(jī)/b、Disctypecentrifuge85*這種離心機(jī)在生物分離中非常常見(jiàn)，可連續(xù)操作但結(jié)構(gòu)復(fù)雜，價(jià)格較高。*料液由管頂進(jìn)，清液從加料口附近環(huán)行裂口流出和管式離心機(jī)最顯著的區(qū)別：固體即非間歇式的被移出，也不通過(guò)離心機(jī)管壁上的孔連續(xù)的去除填充固體的性質(zhì)決定離心機(jī)類型微粒在離心力場(chǎng)作用下,將沿碟片底部運(yùn)動(dòng)到碟片外邊緣,匯集到濾渣中，再清除掉。/*這種離心機(jī)在生物分離中非常常見(jiàn)，可連續(xù)操作但結(jié)構(gòu)復(fù)雜，價(jià)86二、過(guò)濾1.過(guò)濾基本原理利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮液中的固體粒子，進(jìn)行固-液分離的方法。是工業(yè)生產(chǎn)中用于分離細(xì)胞和不溶性物質(zhì)的主要方法。對(duì)于一定形狀的粗大、堅(jiān)硬晶體來(lái)說(shuō)，這一操作并不困難，但對(duì)于過(guò)濾的對(duì)象是生物體，發(fā)酵液中的微生物細(xì)胞均是易變形的柔軟體，一經(jīng)壓縮就會(huì)變形，且發(fā)酵液黏度很大，因此過(guò)濾困難。/二、過(guò)濾1.過(guò)濾基本原理/872.影響過(guò)濾的因素⑴混合物中懸浮微粒的性質(zhì)和大小懸浮微粒越大，粒子越堅(jiān)硬，大小越均勻，固-液分離越容易。發(fā)酵液中細(xì)菌體積較小，分離較困難。膠體粒子通常懸浮于流體中，須運(yùn)用凝聚和絮凝技術(shù)，增大懸粒子體積，利于固-液分離。/2.影響過(guò)濾的因素/88⑵混合液的黏度流體的流動(dòng)特性對(duì)固液分離的影響很大，流體的黏度越大，固液分離越困難。通常黏度與組成和濃度有關(guān)，組成越復(fù)雜，濃度越高，黏度越大。/⑵混合液的黏度/89⑶操作溫度、pH等的控制也會(huì)影響固液分離速率。溫度升高，流體黏度降低；調(diào)整pH可改變流體黏度，使固液分離效率提高。⑷助濾劑的使用惰性助濾劑是一種顆粒均勻、質(zhì)地堅(jiān)硬、不可壓縮的粒狀物質(zhì)，用于擴(kuò)大過(guò)濾表面的適用范圍，減輕過(guò)濾時(shí)的快速擠壓和介質(zhì)堵塞的現(xiàn)象。/⑶操作/90助濾劑的機(jī)理：

助濾劑具有吸附膠體的能力，助濾劑顆粒形成的濾餅具有格子型結(jié)構(gòu)，不可壓縮，濾孔不會(huì)全部堵塞，保持滲透性。既能使細(xì)小顆粒狀膠態(tài)物質(zhì)截留在格子骨架上，又能使清液有流暢的通道。/助濾劑的機(jī)理：/91助濾劑的使用方法：①在濾布上預(yù)先涂一層助濾劑，作為過(guò)濾介質(zhì)使用，待濾畢后與濾餅一起除去。②按一定比例均勻混入待濾的懸浮液中，一起進(jìn)入過(guò)濾機(jī)，形成較疏松的濾餅，降低其可壓縮性，讓濾液順暢流通。惰性助濾劑的材料：硅藻土、膨脹珍珠巖、石棉、纖維素、未活化的碳渣、重質(zhì)碳酸鈣或這些材料的混合物。/助濾劑的使用方法：/92選擇和使用助濾劑時(shí)應(yīng)考慮以下因素：①根據(jù)目標(biāo)物的性質(zhì)選擇助濾劑品種。若目標(biāo)物存在于液相，應(yīng)考慮目標(biāo)物是否會(huì)被助濾劑吸附，是否可通過(guò)改變pH來(lái)減少吸附；若目標(biāo)物存在于固相，一般使用淀粉、纖維素等不影響產(chǎn)品質(zhì)量的助濾劑。/選擇和使用助濾劑時(shí)應(yīng)考慮以下因素：/93②根據(jù)過(guò)濾介質(zhì)和過(guò)濾情況選擇助濾劑品種。當(dāng)使用粗目濾網(wǎng)時(shí)易泄漏，采用石棉粉、纖維素、淀粉等助濾劑可有效防止泄漏。當(dāng)使用細(xì)目濾布時(shí)，宜采用細(xì)硅藻土，若用粗粒硅藻土，料液中的細(xì)微顆粒仍將透過(guò)助濾層到達(dá)濾布表面，增大過(guò)濾阻力。/②根據(jù)過(guò)濾介質(zhì)和過(guò)濾情況選擇助濾劑品種。/94③粒度選擇。助濾劑的粒度及粒度分布對(duì)過(guò)濾速率和濾液澄清度影響很大。粒度一定時(shí)，過(guò)濾速率與澄清度成反比，過(guò)濾速率大，澄清度差；過(guò)濾速率小，澄清度好。助濾劑的粒度必須與懸浮液中固體粒子的尺寸相適應(yīng)，如顆粒較小的懸浮液應(yīng)采用較細(xì)的助濾。/③粒度選擇。/95④用量的確定。助濾劑的用量必須適宜。用量過(guò)少，助濾作用?。挥昧窟^(guò)多，不僅浪費(fèi)，還會(huì)因助濾劑成為主要的濾餅阻力而使過(guò)濾速率下降。/④用量的確定。/963.過(guò)濾方程用數(shù)學(xué)形式描述過(guò)濾操作，可從流體力學(xué)的基本觀點(diǎn)出發(fā)，即從生物化工原理中可知，過(guò)濾的基本方程是達(dá)西公式：式中，A—過(guò)濾斷面積，m2Rm—介質(zhì)阻力，m-1

Δp—壓力差，PaRc—濾餅阻力，m-1μL—流體介質(zhì)的黏度，Pa·s/3.過(guò)濾方程用數(shù)學(xué)形式描述過(guò)濾操作，可從流體力學(xué)的基本觀點(diǎn)出97過(guò)濾的阻力來(lái)自于過(guò)濾介質(zhì)和濾餅。通常，Rm是常量，Rc隨著過(guò)濾時(shí)間的推移，逐漸增大。濾餅阻力與濾餅干基質(zhì)量m的關(guān)系為式中，Rc—濾餅阻力，m-1m—濾餅干重，kg

α—濾餅的平均比阻，m/kgA—過(guò)濾斷面積，m2/過(guò)濾的阻力來(lái)自于過(guò)濾介質(zhì)和濾餅。通常，Rm是常量，Rc隨著過(guò)98不可壓縮濾餅，α是常數(shù)；可壓縮濾餅的α是壓力差的函數(shù)：α=k·Δpm生物過(guò)程中，可壓縮濾餅最常見(jiàn)?？蓧嚎s濾餅的比阻隨壓力差提高而增大，因此，過(guò)濾操作中，壓力差是最重要的操作參數(shù)，對(duì)可壓縮濾餅，一定要緩慢增大操作壓力。/不可壓縮濾餅，α是常數(shù)；可壓縮濾餅的α是壓力差的函數(shù)：α99過(guò)濾時(shí)，按照外加壓力和流速的變化，可將過(guò)濾操作分為：①恒壓過(guò)濾—用壓縮空氣或真空作為推動(dòng)力；②恒速過(guò)濾—用定容泵來(lái)輸送料液；③變速—變壓過(guò)濾—用離心泵來(lái)實(shí)現(xiàn)。由于濾餅是影響過(guò)濾速度的主要因素，因此在過(guò)濾操作前，要對(duì)濾液進(jìn)行絮凝等預(yù)處理，降低濾餅的阻力。/過(guò)濾時(shí)，按照外加壓力和流速的變化，可將過(guò)濾操作分為：/1004.過(guò)濾設(shè)備生物分離常用的過(guò)濾設(shè)備主要有：加壓葉濾機(jī)、板框過(guò)濾機(jī)、回轉(zhuǎn)真空過(guò)濾機(jī)等。板框過(guò)濾機(jī)使用最為普遍。/4.過(guò)濾設(shè)備生物分離常用的過(guò)濾設(shè)備主要有：加壓葉濾機(jī)、板框過(guò)101(1)板框壓濾機(jī)板框壓濾機(jī)最為常用，由濾板和濾框組成，兩者間襯以濾布(過(guò)濾介質(zhì))。濾板起到支撐濾布和分布懸浮液的作用，濾框則起到存放濾餅的作用。這里過(guò)濾機(jī)可以得到含水量較低的濾餅，但當(dāng)產(chǎn)生有毒氣體或生物危險(xiǎn)物存在的場(chǎng)合，不宜使用。其他三種過(guò)濾機(jī)則都是封閉式的，可用于存在有毒煙霧或生物危險(xiǎn)物的場(chǎng)合。/(1)板框壓濾機(jī)/102(2)水平板式過(guò)濾機(jī)適用于小規(guī)模分離操作，濾片的清洗和過(guò)濾介質(zhì)的安裝必須放在機(jī)外進(jìn)行。(3)垂直葉濾機(jī)具有較大的比過(guò)濾面積。(4)管狀過(guò)濾機(jī)管狀垂直過(guò)濾機(jī)內(nèi)過(guò)濾罐系懸掛在管板上，濾餅在管子外表面形成，濾液流動(dòng)通過(guò)沉積在管上的濾餅進(jìn)入頂蓋并排出，管子可用反沖法清洗。/(2)水平板式過(guò)濾機(jī)/103(5)回轉(zhuǎn)真空過(guò)濾機(jī)教材p24/(5)回轉(zhuǎn)真空過(guò)濾機(jī)/104三、包含體的分離和蛋白質(zhì)復(fù)性包含體：是很多利用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基因表達(dá)產(chǎn)物，在細(xì)胞內(nèi)凝聚成沒(méi)有生物活性的不溶于水的固體顆粒。包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，它的一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒(méi)有生物活性。/三、包含體的分離和蛋白質(zhì)復(fù)性包含體：是很多利用大腸桿菌為宿主1051.包含體的形成與分離包含體的形成有以下幾種可能性：⑴少量蛋白質(zhì)產(chǎn)生時(shí)是可溶的，其后積聚的量過(guò)多，在細(xì)胞內(nèi)超過(guò)其溶解度而沉淀，并隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，不溶部分增加，但細(xì)胞裂解，并用適當(dāng)溶劑稀釋后，可轉(zhuǎn)為溶解狀態(tài)。⑵蛋白質(zhì)合成太快，肽鏈來(lái)不及形成正常的折疊構(gòu)象，導(dǎo)致分子間疏水基相互作用聚合而不溶，此時(shí)即使稀釋也不能溶解，生物活性受到影響。/1.包含體的形成與分離包含體的形成有以下幾種可能性：/106⑶高表達(dá)的蛋白質(zhì)沒(méi)有形成分子內(nèi)正常的二硫鍵連接，這可能是由于肽鍵來(lái)不及形成正常的折疊構(gòu)象而導(dǎo)致錯(cuò)誤的二硫鍵連接，或是高表達(dá)時(shí)細(xì)胞內(nèi)氧化還原等條件不同而生成不同的二硫鍵連接。⑷蛋白質(zhì)的溶解需要與其他成分結(jié)合或經(jīng)其他成分誘導(dǎo)形成適當(dāng)?shù)暮涂扇苄缘臉?gòu)象，當(dāng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)量過(guò)多，所需其他成分相對(duì)不足，蛋白質(zhì)就不能溶解。/⑶高表達(dá)的蛋白質(zhì)沒(méi)有形成分子內(nèi)正常的二硫鍵連接，這可能是由于107⑸包含體的形成亦與蛋白質(zhì)自身穩(wěn)定性有關(guān)。因此，工程菌株產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)的回收應(yīng)包括以下步驟：①包含體的分離；②用變性劑溶解包含體中的蛋白質(zhì)；③變性蛋白質(zhì)的復(fù)性和重新氧化(包括除去過(guò)剩的變性劑和還原劑)；④以一般純化技術(shù)，獲取成品蛋白質(zhì)。/⑸包含體的形成亦與蛋白質(zhì)自身穩(wěn)定性有關(guān)。/1082.包含體的溶解包含體常用變性尿素或鹽酸胍，以及去污劑SDS(十二烷基磺酸鈉)來(lái)溶解，它們可分別破壞蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)及肽鏈之間的疏水作用，從而使蛋白質(zhì)肽鏈相互分離。溶解包含體的變性劑主要用6-8mol/L的鹽酸胍或脲。/2.包含體的溶解包含體常用變性尿素或鹽酸胍，以及去污劑SDS1093.蛋白質(zhì)復(fù)性包含體大多是蛋白質(zhì)在過(guò)量表達(dá)過(guò)程中不正確折疊形成的，而正確構(gòu)象的形成需要進(jìn)行變性和復(fù)性，它是一個(gè)具有雙重作用的過(guò)程：結(jié)構(gòu)上使伸展的肽鍵成為特定的三維結(jié)構(gòu)；功能上使無(wú)活性的分子成為具有特定功能的分子。/3.蛋白質(zhì)復(fù)性包含體大多是蛋白質(zhì)在過(guò)量表達(dá)過(guò)程中不正確折疊形110第二單元原料預(yù)處理技術(shù)/第二單元原料預(yù)處理技術(shù)/學(xué)習(xí)目標(biāo)1.發(fā)酵液預(yù)處理的目的和主要方法及其原理。2.常用的細(xì)胞破碎方法及原理。3.生物分離常用的離心、過(guò)濾方法。/學(xué)習(xí)目標(biāo)1.發(fā)酵液預(yù)處理的目的和主要方法及其原理。/112第一節(jié)概述微生物發(fā)酵或動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液(或培養(yǎng)液)中除含有所需的生物活性物質(zhì)外，還存在大量的菌體、細(xì)胞、胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物及剩余的培養(yǎng)基成分等。/第一節(jié)概述微生物發(fā)酵或動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液(或培養(yǎng)113常規(guī)處理方法先將菌體或細(xì)胞、固態(tài)培養(yǎng)基等固體懸浮顆粒與可溶性組分分離(即固-液分離)，然后再進(jìn)行后續(xù)的分離純化操作單元。對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物來(lái)說(shuō)，應(yīng)先經(jīng)細(xì)胞破碎，使生物活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移到液相后，再經(jīng)固-液分離除去細(xì)胞碎片等固體雜質(zhì)。/常規(guī)處理方法先將菌體或細(xì)胞、固態(tài)培養(yǎng)基等固體懸浮顆粒與可溶性114常用的固-液分離方法主要是：過(guò)濾和離心。但是不同來(lái)源的培養(yǎng)液和發(fā)酵液其固-液分離速度差異很大，取決于該介質(zhì)的理化性狀，主要是細(xì)胞或菌體的大小和介質(zhì)的黏度。細(xì)胞絮凝技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展很快的一種行之有效的方法。/常用的固-液分離方法主要是：過(guò)濾和離心。/115發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，對(duì)后續(xù)分離影響最大的是高價(jià)無(wú)機(jī)離子(Ca2+,Mg2+,Fe3+)和雜蛋白等。在預(yù)處理時(shí)，應(yīng)盡量出去這些物質(zhì)。/發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，對(duì)后續(xù)分離影響最大的是高價(jià)無(wú)機(jī)離子(Ca2116第二節(jié)預(yù)處理的目的和方法一、預(yù)處理的目的⑴改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進(jìn)從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離器的效率。⑵盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的某一相中(多數(shù)是液相)。⑶去除發(fā)酵液中部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作。/第二節(jié)預(yù)處理的目的和方法一、預(yù)處理的目的/117二、預(yù)處理方法1.加熱法此法的關(guān)鍵取決于產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性。是最簡(jiǎn)單廉價(jià)的預(yù)處理方法，加熱可降低懸浮液的強(qiáng)度，加速聚集作用，去除某些蛋白質(zhì)雜質(zhì)，破壞凝膠狀結(jié)構(gòu)，增加濾餅孔隙度，使固液分離變?nèi)菀住?二、預(yù)處理方法1.加熱法/1182.調(diào)節(jié)懸浮液的pH值這個(gè)方法也很簡(jiǎn)便。全細(xì)胞的聚集作用取決于pH值的大小，恰當(dāng)?shù)膒H能夠促進(jìn)聚集作用，一般用草酸或無(wú)機(jī)酸或堿來(lái)調(diào)節(jié)。/2.調(diào)節(jié)懸浮液的pH值/1193.凝聚和絮凝都是懸浮液預(yù)處理的重要方法。都是將化學(xué)藥劑預(yù)先投入懸浮液，改變細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，再進(jìn)行分離。/3.凝聚和絮凝/120凝聚和絮凝都能有效增加顆粒尺寸，增大顆粒的沉降或浮選速率，提高濾餅的滲透性或在深層過(guò)濾時(shí)產(chǎn)生較好的顆粒保留作用。深層過(guò)濾：顆粒尺寸比介質(zhì)的孔道直徑小得多，但孔道彎曲細(xì)長(zhǎng)，顆粒進(jìn)入之后很容易被截住，更由于流體流過(guò)時(shí)所引起的擠壓和沖撞作用，顆粒緊附在孔道的壁面上，這種過(guò)濾是在介質(zhì)內(nèi)部進(jìn)行的，介質(zhì)表面無(wú)濾餅形成。/凝聚和絮凝都能有效增加顆粒尺寸，增大顆粒的沉降或浮選速率，提121凝聚和絮凝凝聚：在投加的化學(xué)物質(zhì)(如：水解的凝聚劑，鋁、鐵的鹽類或石灰等)作用下，膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚集成1mm大小的塊狀凝聚體的過(guò)程。凝聚劑的作用：對(duì)粒子表面電荷的中和；消除雙電荷層而脫穩(wěn)；通過(guò)氫鍵或其他復(fù)雜的形式與粒子結(jié)合發(fā)生凝聚。/凝聚和絮凝凝聚：在投加的化學(xué)物質(zhì)(如：水解的凝聚劑，鋁、鐵的122凝聚和絮凝絮凝：使用絮凝劑(通常是天然或合成的大分子質(zhì)量聚電解質(zhì))將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm大小絮凝團(tuán)的過(guò)程。絮凝劑的作用：橋架作用。/凝聚和絮凝絮凝：使用絮凝劑(通常是天然或合成的大分子質(zhì)量聚電123絮凝過(guò)程

/絮凝過(guò)程

124絮凝劑相對(duì)凝聚劑而言更昂貴，其使用劑量必須正確使用并仔細(xì)優(yōu)化。最佳的絮凝劑使用劑量為：一般為大概一半的粒子表面被聚合物覆蓋時(shí)所使用的絮凝劑劑量。/絮凝劑相對(duì)凝聚劑而言更昂貴，其使用劑量必須正確使用并仔細(xì)優(yōu)化125凝聚劑和絮凝劑的類型凝聚劑：主要是無(wú)機(jī)類電解質(zhì)，大多為陽(yáng)離子型，分無(wú)機(jī)鹽類、金屬氫氧化物類和聚合無(wú)機(jī)鹽類等。絮凝劑：其官能團(tuán)分為陰離子、陽(yáng)離子和非離子三大類型。/凝聚劑和絮凝劑的類型凝聚劑：主要是無(wú)機(jī)類電解質(zhì)，大多為陽(yáng)離子1264.去除雜蛋白質(zhì)的其他方法⑴等電沉淀法蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，能沉淀除去。很多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在酸性范圍內(nèi)(pH為4.0-5.5)。有些蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)仍有溶解度，可結(jié)合其他方法。/4.去除雜蛋白質(zhì)的其他方法⑴等電沉淀法/127⑵變性沉淀蛋白質(zhì)從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則結(jié)構(gòu)的過(guò)程稱變性，變性蛋白質(zhì)在水中的溶解度較小而產(chǎn)生沉淀。方法：加熱、大幅改變pH、加有機(jī)溶劑(丙酮、乙醇等)、加重金屬離子(Ag+,Cu2+,Pb2+等)、加有機(jī)酸(三氯乙酸、水楊酸、苦味酸、鞣酸、過(guò)氯酸等)及表面活性劑。/⑵變性沉淀/128⑶吸附吸附作用常能有效除去雜蛋白質(zhì)。在發(fā)酵液中加入一些反應(yīng)劑，它們相互反應(yīng)生成的沉淀物對(duì)蛋白質(zhì)具吸附作用而使其凝固。/⑶吸附/1295.不溶性多糖的去除不溶性多糖較多時(shí)，發(fā)酵液黏度增大，固液分離困難，采用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖以提高過(guò)濾速度。如在蛋白酶發(fā)酵液中加入淀粉酶，能將培養(yǎng)基中多余的淀粉水解成單糖，降低發(fā)酵液黏度，提高濾速。/5.不溶性多糖的去除不溶性多糖較多時(shí)，發(fā)酵液黏度增大，固液分1306.高價(jià)金屬離子的去除對(duì)成品質(zhì)量影響較大的無(wú)機(jī)雜質(zhì)主要有：Ca2+,Mg2+,Fe3+等高價(jià)金屬離子，預(yù)處理中應(yīng)將它們除去。/6.高價(jià)金屬離子的去除對(duì)成品質(zhì)量影響較大的無(wú)機(jī)雜質(zhì)主要有：C131

1、概念

細(xì)胞破碎是用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法來(lái)破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的方法。

細(xì)胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)

胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來(lái)的技術(shù)。

2、目的

破壞細(xì)胞外圍，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)。第三節(jié)細(xì)胞破碎技術(shù)

/

1、概念

細(xì)胞破碎是用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法1323.原理⑴細(xì)胞的結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁的破碎最關(guān)鍵。動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，易于破碎。植物和微生物細(xì)胞的細(xì)胞壁堅(jiān)固，破碎困難。/3.原理/133①細(xì)菌革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖層組成，細(xì)胞壁厚，為15-50nm。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁在肽聚糖外側(cè)還有脂蛋白和脂多糖及磷脂構(gòu)成的兩層外壁層，肽聚糖層1.5-2nm，外壁層8-10nm。因此革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁比革蘭氏陰性菌堅(jiān)固，較難破碎。/①細(xì)菌/134細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成圖3.1

細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)

/細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成圖3.1細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)/135②真菌和酵母細(xì)胞壁呈絲狀，比革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁厚，約60nm，更難破碎。③霉菌細(xì)胞壁較厚，為100-250nm。④哺乳類細(xì)胞、嗜鹽菌和支原體哺乳類細(xì)胞和嗜鹽菌缺乏堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，支原體沒(méi)有細(xì)胞壁，易破碎。/②真菌和酵母/136⑤藻類細(xì)胞壁較復(fù)雜，其主要成分是纖維狀的多糖類物質(zhì)。/⑤藻類/137細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成微生物革蘭式陽(yáng)性菌革蘭式陰性菌酵母壁厚（nm）20～8010～25100～300層單層多層多層主要組成肽聚糖(40~90%)肽聚糖(5~10%)葡聚糖(30~40%)多糖脂蛋白甘露聚糖（30％）胞壁酸脂多糖蛋白質(zhì)磷脂蛋白質(zhì)脂多糖蛋白質(zhì)脂類破碎難易程度難相對(duì)易最難各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成/細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成微生物革蘭式陽(yáng)性菌革蘭式陰性菌酵母壁厚（n138⑵細(xì)胞破碎和產(chǎn)物釋放原理細(xì)胞破碎主要采用各種機(jī)械破碎法和化學(xué)破碎法，或二者的結(jié)合。機(jī)械破碎中細(xì)胞所受的機(jī)械作用力主要有壓縮力和剪切力?；瘜W(xué)破碎又稱化學(xué)滲透，利用化學(xué)或生化試劑(酶)改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增大胞內(nèi)物質(zhì)溶解速率；或完全溶解細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體后，在滲透壓的作用下使細(xì)胞膜破裂而釋放胞內(nèi)物質(zhì)。/⑵細(xì)胞破碎和產(chǎn)物釋放原理細(xì)胞破碎主要采用各種機(jī)械破碎法和化學(xué)139破碎方法細(xì)胞破碎機(jī)理/破碎方法細(xì)胞破碎機(jī)理/140二、細(xì)胞破碎法破碎方式機(jī)械法非機(jī)械法液體剪切作用固體剪切作用干燥處理溶胞作用珠磨法壓榨高壓勻漿超聲破碎酶溶法化學(xué)法物理法細(xì)胞破碎方法分類/二、細(xì)胞破碎法破碎方式機(jī)械法非機(jī)械法液體剪固體剪干燥溶胞珠磨141細(xì)胞壁的破碎破碎方法的選擇：

破碎目的待破碎生物體的類型破碎目的：獲取產(chǎn)品，考慮破碎收率和能耗；研究胞內(nèi)產(chǎn)物在體內(nèi)的功能，宜采用軟處理。待破碎生物體的類型：不同生物體對(duì)破碎有不同的敏感度/細(xì)胞壁的破碎破碎方法的選擇：破碎目的/142細(xì)胞壁的破碎

細(xì)胞對(duì)破碎的敏感度細(xì)胞聲波攪拌減壓冷凍壓力動(dòng)物細(xì)胞7777革蘭式陰性芽孢桿菌和球菌6566革蘭式陽(yáng)性芽孢桿菌5（4）54酵母3.5342.5革蘭式陽(yáng)性球菌3.5（2）325孢子2（1）21菌絲16（1）5

生物體的大小，形態(tài)，齡期，品系，生長(zhǎng)條件，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，pH，溫度以及細(xì)胞的變化也影響對(duì)破碎的敏感度。/細(xì)胞壁的破碎細(xì)胞對(duì)破碎的敏感度細(xì)胞聲波攪拌減壓冷凍1431.機(jī)械破碎方法HC23-高壓細(xì)胞破碎機(jī)⑴高壓勻漿法DY89-1型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)/1.機(jī)械破碎方法HC23-高壓細(xì)胞破碎機(jī)⑴高壓勻漿法DY8144作用機(jī)理：細(xì)胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速(可達(dá)到450m／s)噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。高壓勻漿器的操作壓力通常為50～70MPa。

⑴高壓勻漿法/作用機(jī)理：細(xì)胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速(可1451.機(jī)械破碎方法影響細(xì)胞破碎的因素：溫度壓力循環(huán)操作次數(shù)細(xì)胞濃度閥座形式⑴高壓勻漿法/1.機(jī)械破碎方法影響細(xì)胞破碎的因素：⑴高壓勻漿法/146影響破碎效率的因素溫度：破碎率隨溫度的增加而增加例如：操作溫度由5℃增加到30℃，破碎率約提高1.5倍。高溫對(duì)破碎有利，但應(yīng)考慮熱變性壓力每增加10MPa，溫度2℃。適用于酵母和細(xì)菌細(xì)胞的破碎。高壓勻漿法/影響破碎效率的因素溫度：高壓勻漿法/1471.機(jī)械破碎方法珠磨機(jī)簡(jiǎn)圖⑵

珠磨法生產(chǎn)廠商:

瑞士WAB公司德國(guó)西門子機(jī)械公司形式：立式臥式（效率高）/1.機(jī)械破碎方法珠磨機(jī)簡(jiǎn)圖⑵珠磨法生產(chǎn)廠商:/148原理：在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運(yùn)動(dòng)，微球和微球之間以及微球和細(xì)胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細(xì)胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。產(chǎn)熱由夾套帶走。珠磨法/原理：在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運(yùn)動(dòng)，微球和微球之間以及微149珠磨機(jī)主體：立式和臥式圓筒型腔體一般，臥式比立式珠磨破碎效率高：因?yàn)榱⑹綑C(jī)中向上流動(dòng)的液體在某種程度上會(huì)使研磨珠流態(tài)化，從而降低其研磨效率。研磨珠：玻璃(密度為2.5g／cm3)或氧化鋯(密度為6.0g／cm3)微球(粒徑約0.1～10mm)，填充率為80％～85％。/珠磨機(jī)主體：立式和臥式圓筒型腔體/1501.機(jī)械破碎方法動(dòng)力學(xué)方程：遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程珠磨法R：t時(shí)間內(nèi)釋放的蛋白質(zhì)數(shù)量（mg/g）Rm：能釋放的蛋白質(zhì)最大數(shù)量，即100％破碎k：破碎速率常數(shù)，與珠粒大小、填充率、細(xì)胞濃度等有關(guān)其中：S＝R/Rm，破碎率/1.機(jī)械破碎方法動(dòng)力學(xué)方程：遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程珠磨法R：t1511.機(jī)械破碎方法影響破碎效率的因素：轉(zhuǎn)盤外緣速度細(xì)胞濃度珠粒大小及裝載量溫度流速珠磨法/1.機(jī)械破碎方法影響破碎效率的因素：珠磨法/1521.機(jī)械破碎方法珠磨法破碎過(guò)程產(chǎn)生大量熱能，設(shè)計(jì)時(shí)需考慮換熱問(wèn)題。適用于絕大多數(shù)真菌菌絲和藻類等微生物細(xì)胞的破碎。影響破碎率的操作參數(shù)較多，操作過(guò)程優(yōu)化設(shè)計(jì)較復(fù)雜。珠磨法/1.機(jī)械破碎方法珠磨法/1531.機(jī)械破碎方法原理：細(xì)胞是彈性體，比一般剛性固體粒子難于破碎。將彈性細(xì)胞冷凍使其成為剛性球體，降低破碎難度，撞擊破碎正是基于這樣的原理。操作：細(xì)胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)(凍結(jié)速度為每分鐘數(shù)千攝氏度)，形成粒徑小于50um的微粒子。高速載氣(如氮?dú)?，氣流約為300m/s)將凍結(jié)的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結(jié)的細(xì)胞發(fā)生破碎。⑶撞擊破碎法/1.機(jī)械破碎方法原理：⑶撞擊破碎法/1541.機(jī)械破碎方法特點(diǎn)：細(xì)胞破碎僅發(fā)生在與撞擊板撞擊的一瞬間，細(xì)胞破碎均勻，可避免反復(fù)受力發(fā)生過(guò)度破碎的現(xiàn)象。細(xì)胞破碎程度可通過(guò)無(wú)級(jí)調(diào)節(jié)載氣壓力(流速)控制，避免細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，主要用于細(xì)胞器(如線粒體、葉綠體等)的回收。撞擊破碎適用于微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的破碎。⑶撞擊破碎法/1.機(jī)械破碎方法特點(diǎn)：⑶撞擊破碎法/1551.機(jī)械破碎方法JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)⑷超聲波法/1.機(jī)械破碎方法JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)⑷超聲波法1561.機(jī)械破碎方法作用機(jī)理：

在超聲波作用下，液體發(fā)生空化作用(cavitaton)，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。超聲波法/1.機(jī)械破碎方法作用機(jī)理：超聲波法/1571.機(jī)械破碎方法超聲波的負(fù)面影響：1、溫度上升：懸浮液預(yù)冷，夾套冷卻短期冷卻與短期破碎交替。2、超聲處理會(huì)引起諸如游離基這樣的化學(xué)效應(yīng)，破壞目的產(chǎn)物，可加入游離基清除劑（組氨酸，谷胱甘肽等）予以消除。3.影響因素：聲強(qiáng)、聲頻、溫度、時(shí)間、離子強(qiáng)度、pH、細(xì)胞類型。超聲波法/1.機(jī)械破碎方法超聲波的負(fù)面影響：超聲波法/1581.機(jī)械破碎方法機(jī)械法破碎細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：內(nèi)含物全部釋放時(shí)間短，效率高，成本低通用性強(qiáng)，適于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)缺點(diǎn)：需要高的能量產(chǎn)生高溫，高剪切力，引起產(chǎn)品變性失活非專一性，碎片分布寬，給分離造成困難/1.機(jī)械破碎方法機(jī)械法破碎細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)：/1592.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)作用機(jī)理：用化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分處理方法：酸堿處理；化學(xué)試劑；表面活性劑；有機(jī)溶劑EDTA螯合劑；變性劑化學(xué)滲透法/2.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)作用機(jī)理：化學(xué)滲透法/1602.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)⑴酸堿處理調(diào)節(jié)pH，改變蛋白質(zhì)的荷電性質(zhì)，提高產(chǎn)物的溶解度。⑵化學(xué)試劑處理用表面活性劑或有機(jī)溶劑(甲苯)處理細(xì)胞，增大細(xì)胞壁的通透性，降低胞內(nèi)產(chǎn)物的相互作用，使之容易釋放。/2.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)⑴酸堿處理/1612.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)物釋放有一定的選擇性不需要特殊設(shè)備細(xì)胞外形保持完整，細(xì)胞碎片少，漿液粘度低，利于后續(xù)分離化學(xué)滲透法缺點(diǎn)：通用性差時(shí)間長(zhǎng)，效率低某些化學(xué)試劑有毒/2.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)滲透法缺點(diǎn)：/1622.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)應(yīng)用：檢測(cè)胞內(nèi)酶活性釋放胞內(nèi)物質(zhì)研究化學(xué)滲透法/2.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法(非機(jī)械法)應(yīng)用：化學(xué)滲透法/1632.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法

(非機(jī)械法)作用機(jī)理：酶溶法(Enzymaticlysis)利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大腦內(nèi)產(chǎn)物的遇透性。溶菌酶適用于革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的分解，應(yīng)用于革蘭氏陰性菌時(shí)，需輔以EDTA使之更有效地作用于細(xì)胞壁。真核細(xì)胞的細(xì)胞壁不同于原核細(xì)胞，需采用不同的酶。酵母細(xì)胞的酶溶需用Zymo1yase(幾種細(xì)菌酶的混合物)、-1,6—葡聚糖酶(或甘露糖酶）；破壞植物細(xì)胞壁需用纖維素酶。酶法胞溶/2.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法

(非機(jī)械法)作用機(jī)理：酶溶法(En1642.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法

(非機(jī)械法)優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)品釋放選擇性高抽提速率和收率高產(chǎn)品破壞少pH、溫度外界條件要求低不殘留細(xì)胞碎片酶法胞溶缺點(diǎn)：費(fèi)用高通用性差存在產(chǎn)品抑制不適于工業(yè)生產(chǎn)/2.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法

(非機(jī)械法)優(yōu)點(diǎn)：酶法胞溶缺點(diǎn)：/1652.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法

(非機(jī)械法)應(yīng)用：原生質(zhì)體融合釋放出克隆出的胞內(nèi)蛋白制取特殊的壁葡萄糖聚合物與機(jī)械法破碎細(xì)胞協(xié)同使用從細(xì)胞內(nèi)不同的位置選擇性的釋放蛋白酶法胞溶/2.化學(xué)和生物化學(xué)滲透法

(非機(jī)械法)應(yīng)用：酶法胞溶/1663.物理滲透法滲透壓沖擊法：

將細(xì)胞置于高滲透壓的介質(zhì)中，使之脫水收縮，達(dá)到平衡后，將介質(zhì)突然稀釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖液中，在滲透壓的作用下，外界的水向細(xì)胞內(nèi)滲透，使細(xì)胞變得腫脹，膨脹到一定程度，細(xì)胞破裂，它的內(nèi)含物隨即釋放到溶液中。物理法/3.物理滲透法滲透壓沖擊法：物理法/1673.物理滲透法滲透壓沖擊法：

滲透壓沖擊(Osmoticshock)是在各種細(xì)胞破碎法中最為溫和的一種，適用于易于破碎的細(xì)咆，如動(dòng)物細(xì)胞和革蘭氏陰性菌。物理法/3.物理滲透法滲透壓沖擊法：物理法/1683.物理滲透法凍融法：

將細(xì)胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，此凍結(jié)融化操作反復(fù)進(jìn)行多次，使細(xì)胞受到破壞。凍結(jié)的作用是破壞細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)，增加其親水性和通透性。另一方面，出于胞內(nèi)水結(jié)晶使胞內(nèi)外產(chǎn)生溶液濃度差，在滲透壓作用下引起細(xì)胞膨脹而破裂。物理法/3.物理滲透法凍融法：物理法/1693.物理滲透法凍融法：操作：將細(xì)胞急劇凍結(jié)至-20～-15℃，使之凝固，然后在室溫緩慢融化，此凍結(jié)融化操作反復(fù)進(jìn)行多次，使細(xì)胞受到破壞。缺點(diǎn)：反復(fù)凍融使蛋白質(zhì)變性，影響活性蛋白質(zhì)的回收率。凍融法適用于比較脆弱的菌體。物理法/3.物理滲透法凍融法：物理法/1703.物理滲透法干燥法：

將細(xì)胞用不同的方法干燥（真空、冷凍、噴霧和氣流等），細(xì)胞膜結(jié)合水喪失，滲透性發(fā)生變化而破裂缺點(diǎn)：條件變化劇烈，易引起生物物質(zhì)變性物理法/3.物理滲透法干燥法：物理法/171機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法的比較比較項(xiàng)目機(jī)械法非機(jī)械法比較項(xiàng)目機(jī)械法非機(jī)械法破碎機(jī)理切碎細(xì)胞溶解局部壁膜效率效率高效率低碎片大小碎片細(xì)小碎片較大設(shè)備需專用設(shè)備不需專用設(shè)備內(nèi)含物釋放全部部分通用性強(qiáng)差粘度高（核酸多）低（核酸少）經(jīng)濟(jì)成本低成本高時(shí)間時(shí)間短時(shí)間長(zhǎng)應(yīng)用范圍實(shí)驗(yàn)室、工業(yè)范圍實(shí)驗(yàn)室范圍/機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法的比較比較項(xiàng)目機(jī)械法非機(jī)械法比較項(xiàng)目172破碎技術(shù)的選擇原則：目的產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)中，需機(jī)械破碎法目的產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，可采用非機(jī)械破碎法目的產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合，可采用兩種方法結(jié)合/破碎技術(shù)的選擇原則：/173破碎技術(shù)的研究發(fā)展方向：多種破碎方法結(jié)合與上游過(guò)程結(jié)合1、培養(yǎng)過(guò)程控制2、寄主細(xì)胞選擇3、克隆噬菌體溶解基因4、耐高溫產(chǎn)品的基因表達(dá)與下游結(jié)合從后分離過(guò)程考察細(xì)胞破碎技術(shù)/破碎技術(shù)的研究發(fā)展方向：/174第四節(jié)離心沉降與過(guò)濾分離技術(shù)一、離心沉降㈠沉降基本原理重力沉降：適用于分離較大的顆粒。重力沉降過(guò)程中固體顆粒受到重力、浮力和摩擦阻力的作用。當(dāng)浮力、摩擦阻力和重力達(dá)到平衡時(shí)，球形固體顆粒勻速沉降。/第四節(jié)離心沉降與過(guò)濾分離技術(shù)一、離心沉降/175㈠沉降基本原理沉降速度：式中：dp—球形粒子直徑，m

ρs—粒子的密度，kg/m3

ρL—介質(zhì)的密度，kg/m3g—重力加速度，m/s2μL

—流體介質(zhì)的黏度，Pa·s/㈠沉降基本原理沉降速度：/176離心沉降離心沉降：

依靠慣性離心力的作用而實(shí)現(xiàn)的沉降過(guò)程。

適于分離兩相密度差較小，顆粒粒度較細(xì)的非均相物系。氣固物系：旋風(fēng)分離器；液固物系：旋液分離器或沉降離心機(jī)。/離心沉降離心沉降：177離心沉降離心沉降速度：式中：N—轉(zhuǎn)鼓轉(zhuǎn)速，r/minr—球形粒子半徑，mS—沉降系數(shù)

ω—轉(zhuǎn)鼓的旋轉(zhuǎn)角速度，rad/s/離心沉降離心沉降速度：/178離心沉降從該式可以看出：①當(dāng)ρs＞ρL，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當(dāng)ρs=ρL，則S=0，粒子到達(dá)某一位置后達(dá)到平衡。③當(dāng)ρs＜ρL，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。蛋白質(zhì)離心沉降時(shí)，蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量越大，沉降系數(shù)越大，離心沉降速度越大。/離心沉降從該式可以看出：/179㈡離心分離法1.差速離心分離法原理：利用不同粒子在離心力場(chǎng)中沉降的差別(大而重的顆粒沉降最快，最先到達(dá)底部)，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過(guò)不斷增加相對(duì)離心力，使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分級(jí)沉淀。/㈡離心分離法1.差速離心分離法/180操作：一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開(kāi)，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：操作最簡(jiǎn)便，使用最廣泛。缺點(diǎn)：分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種粒子不容易分開(kāi)，常用于粗制品提取。/操作：/1812.區(qū)帶離心分離法根據(jù)操作條件不同，分為差速區(qū)帶離心和平衡區(qū)帶離心。3.差速區(qū)帶離心分離法在離心前將密度梯度介質(zhì)(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)裝入離心管內(nèi)，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部，同梯度液一起離心。/2.區(qū)帶離心分離法/182差速區(qū)帶離心分離法離心后在近旋轉(zhuǎn)軸(r1)處的介質(zhì)密度最小，離旋轉(zhuǎn)軸最遠(yuǎn)(r2)處介質(zhì)的密度最大，但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度，即ρs＞ρL。梯度液在離心過(guò)程中和離心完畢后，取樣時(shí)起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用，避免分層粒子的再混和。此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是應(yīng)用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。/差速區(qū)帶離心分離法離心后在近旋轉(zhuǎn)軸(r1)處的介質(zhì)密度最小，1834.等密度離心分離法在離心前預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度，密度梯度液包含被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開(kāi)始后，梯度液形成底濃頂稀的密度梯度，原來(lái)分布均勻的粒子也發(fā)生重新分布。/4.等密度離心分離法/184在管頂處粒子密度大于介質(zhì)密度，粒子沉降；當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于粒子密度，粒子上??；粒子進(jìn)入它本身的密度位置，粒子不再移動(dòng)。只要轉(zhuǎn)速、溫度不變，延長(zhǎng)離心時(shí)間也不改變粒子的成帶位置。此法應(yīng)用于物質(zhì)的大小相近，密度差異較大時(shí)。/在管頂處粒子密度大于介質(zhì)密度，粒子沉降；當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于185

㈢

Centrifuges離心分離設(shè)備/

㈢Centrifuges離心分離設(shè)備/186//187

常用的離心機(jī)：a、Tubularbowl:管式離心機(jī)最簡(jiǎn)單，可提供較大離心力；管狀離心機(jī)可以冷卻，在蛋白質(zhì)生產(chǎn)中很有利；懸浮液由管底進(jìn)，澄清液由管口流出。//188沉降離心機(jī)類型

管式離心機(jī)特點(diǎn)是轉(zhuǎn)鼓(管)直徑小、長(zhǎng)度大、轉(zhuǎn)速高、分離效率很高，可以處理顆粒粒徑為0.01mm的懸浮液和難分離的乳濁液。可連續(xù)操作，懸浮液或乳濁液由轉(zhuǎn)鼓下端加入，被轉(zhuǎn)鼓內(nèi)的縱向肋板帶動(dòng)迅速達(dá)到與轉(zhuǎn)鼓同角速度旋轉(zhuǎn)。在離心力作用下，顆?；蛑匾簩铀ο蚬谋谟芍匾撼隹谝?，輕液則從轉(zhuǎn)鼓中心部位溢出。離心分離因數(shù)可達(dá)65,000，工業(yè)上可用于油水分離，實(shí)驗(yàn)室中可用于分離微生物和蛋白質(zhì)。管式離心機(jī)示意圖/沉降離心機(jī)類型管式離心機(jī)特點(diǎn)是轉(zhuǎn)鼓(管)直徑小、長(zhǎng)度189Tubularbowl/Tubularbowl/190管壁上沉積物為濃漿*可連續(xù)加料至流出物固體損失使離心不能正常進(jìn)行*須定時(shí)拆卸、清洗，這種間斷性操作也是最大的缺點(diǎn)//191SRBA2圓筒式離心機(jī)懸浮液沿圓筒的旋轉(zhuǎn)軸連續(xù)加入，通過(guò)筒壁上的小孔流出中空柱狀料液的內(nèi)徑為一常數(shù)，不隨料液的加入而改變

濾餅在筒壁上沉積/SRBA2圓筒式離心機(jī)懸浮液沿圓筒的旋轉(zhuǎn)軸連續(xù)加入，通過(guò)筒192沉降離心機(jī)適用于各種懸浮液或乳濁液、尤其是粒度細(xì)小、密度差不大的體系的分離。離心分離因素達(dá)50,000以上的超高速離心機(jī)甚至可以使不同分子量的蛋白質(zhì)分子在具有密度梯度的溶液中分級(jí)。沉降離心機(jī)工作原理/沉降離心機(jī)適用于各種懸浮液或乳濁液、尤其是粒度細(xì)小、密度差193沉降離心機(jī)類型

碟式離心機(jī)(薄層分離沉降離心機(jī))轉(zhuǎn)鼓內(nèi)裝有一疊隨轉(zhuǎn)鼓旋轉(zhuǎn)的倒錐形碟片，碟片間隙為0.5～1.5m