國內(nèi)外乳藥濃度測(cè)定的方法探析,藥理學(xué)論文

國內(nèi)外乳藥濃度測(cè)定的方法探析,藥理學(xué)論文摘要：母乳喂養(yǎng)對(duì)嬰兒來講是一種非常健康及有營養(yǎng)的獲取能量的方式，對(duì)母親和嬰兒都有受益之處?；加心承┘膊〉牟溉槟赣H在進(jìn)行藥物治療時(shí)，需要考慮藥物能否會(huì)進(jìn)入乳汁而對(duì)嬰兒產(chǎn)生一些不良反響或?qū)δ赣H產(chǎn)生影響。由于很多藥物的哺乳期用藥安全性并不特別明確，因而在臨床治療中不推薦哺乳婦女使用。測(cè)定乳汁中的藥物濃度能夠明確合理的給藥時(shí)間和給藥劑量，提高用藥安全性，對(duì)臨床用藥具有非常重要的意義。但乳汁成分復(fù)雜，含有大量脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，使乳藥濃度測(cè)定有一定困難。本文綜述了國內(nèi)外乳藥濃度測(cè)定方式方法，為哺乳期合理用藥提供參考。本文關(guān)鍵詞語：乳汁;藥物濃度;測(cè)定方式方法;Abstract：Breastfeedingisaquitehealthywayforbabiestogetenergyandnutrients,whichisbeneficialtomothersandinfants.Whenbreastfeedingmotherswhosufferfromcertaindiseasesneedtousedrugs,itisnecessarytoconsiderwhetherdrugswillbeexcretedintothemilktocauseadverseeffectsoninfantsoraffectlactation.Becausethesafetyofmanydrugsduringlactationisnotveryclear,manydrugsarenotrecommendedfornursingwomeninclinicaltreatment.Determinationofdrugconcentrationinbreastmilkcanprovidereasonableadministrationtimeanddose,whichisofgreatsignificanceforclinicalmedication.However,breastmilkisacomplicatematrixduetoalotoflipidsandproteinsandotherinterferingsubstances,whichposesachallengefordeterminationofdrugconcentrationinbreastmilk.Thedomesticandabroadmethodsfordeterminationofmilkconcentrationofdrugsarereviewedinthisarticle,aimingtoprovideareferencerationaldruguseinlactation.Keyword：humanmilk;drugconcentration;determinationmethod;母乳喂養(yǎng)對(duì)新生兒來講是一種極佳的哺育方式，乳汁中的多種天然營養(yǎng)物質(zhì)能夠知足嬰兒茁壯成長的需要。母乳中含有的大量免疫物質(zhì)還能夠加強(qiáng)新生兒的抵抗力和免疫力，有效預(yù)防一些嬰兒疾病[1]。母乳喂養(yǎng)還能夠降低母親患乳腺癌的幾率，加強(qiáng)母親與孩子之間的溝通，對(duì)嬰兒和母親都有受益之處。哺乳期用藥是很常見的，有調(diào)查發(fā)現(xiàn)高達(dá)96%的哺乳婦女在哺乳時(shí)會(huì)服用一種或多種藥物[2]。因幾乎所有的藥物都能夠在乳汁中出現(xiàn)，且嬰兒的酶系統(tǒng)還未發(fā)育完全，藥物代謝和排泄能力差，吃了含有一定藥物濃度的母乳后很有可能發(fā)生一系列不良反響。因此，用藥期間哺乳被以為是不安全的[3]。對(duì)于需要服藥控制疾病的母親來講，能否繼續(xù)哺乳成了一個(gè)難題。當(dāng)前很多藥物缺乏哺乳安全性數(shù)據(jù)，對(duì)于藥物在哺乳期使用的危險(xiǎn)性還不甚清楚，對(duì)哺乳期藥物的安全性分類也沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，部分藥品講明書中對(duì)哺乳期婦女用藥的講法多不明確，這對(duì)臨床醫(yī)生指導(dǎo)哺乳期婦女的安全用藥也造成了困擾。研究分析乳汁中的藥物濃度能夠?yàn)樗幬镌谌橹械姆植继峁┲苯拥淖C據(jù)，為判定乳汁中的藥物能否會(huì)對(duì)新生兒健康造成影響提供參考；還能夠根據(jù)藥物在乳汁中的代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)一步明確合理的給藥時(shí)間和給藥劑量，盡可能地提高用藥的安全性，因此具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[4]。當(dāng)前，關(guān)于尿液、血漿、唾液等體液中藥物濃度測(cè)定的報(bào)道較多，關(guān)于藥物乳汁濃度測(cè)定的研究較少。本文綜述了近年來乳汁中藥物濃度監(jiān)測(cè)的研究進(jìn)展，以期為乳藥濃度監(jiān)測(cè)和哺乳期婦女合理用藥提供參考。1、藥物進(jìn)入乳汁的機(jī)制及影響因素1.1、機(jī)制乳腺由小葉-導(dǎo)管-腺泡構(gòu)成，乳汁從腺泡中分泌。腺泡上排列著一層上皮細(xì)胞，在初乳期〔產(chǎn)后3~4天〕，乳腺上皮細(xì)胞較小，細(xì)胞間的間隙使得免疫球蛋白、蛋白質(zhì)、藥物等大分子物質(zhì)易從血液進(jìn)入乳汁[5]。隨著初乳向成熟乳過渡，乳腺泡中的乳腺上皮細(xì)胞構(gòu)成一層半透明的脂質(zhì)膜將乳汁與血漿分隔開，此時(shí)上皮細(xì)胞間空隙較大，大分子藥物易從血液進(jìn)入乳汁[6]。產(chǎn)后一周后,乳腺上皮細(xì)胞間的孔隙關(guān)閉，只要分子量小于200的藥物才能通過孔隙進(jìn)入乳汁，大分子藥物必須通過被動(dòng)擴(kuò)散才能透過這層膜[7,8]。1.2、影響因素了解影響藥物在母乳中的分布、代謝和去除因素，對(duì)于指導(dǎo)必須服用藥物治療慢性疾病的哺乳期婦女非常重要。當(dāng)前已經(jīng)知道的影響藥物進(jìn)入乳汁的因素有：〔1〕酸堿性：乳汁相對(duì)于血漿偏弱酸性，弱酸性藥物在血漿中比弱堿性藥物較易解離，難以通過血乳屏障。藥物酸性越小，pKa就越大，越易通過血乳屏障[5]。〔2〕蛋白結(jié)合率：血漿和乳汁中都有能夠與藥物結(jié)合的蛋白。血漿中與藥物結(jié)合的主要是白蛋白；而乳汁中主要是酪蛋白、乳鐵蛋白，免疫球蛋白等蛋白，但乳汁中的蛋白與藥物的結(jié)合能力較差。因而，血漿蛋白結(jié)合率越高的藥物越易留存在血漿中，進(jìn)入乳汁的量就越少[9]?！?〕分子量：低分子量的脂溶性藥物可通過被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入乳汁。分子量小于200的水溶性藥物可直接通過細(xì)胞膜上的膜孔進(jìn)入乳汁，而分子量大的藥物則不能通過簡單擴(kuò)散的方式進(jìn)入乳汁[6]?！?〕脂溶性：脂溶性高的非離子型藥物易通過富含脂質(zhì)的細(xì)胞而溶于母乳脂肪中。乳汁脂肪在初乳期、過渡乳期和成熟乳期的含量不同，在一天之內(nèi)脂肪含量也是變化的，因而高脂溶性藥物在乳汁中的藥物濃度也是變化的[5]。另外，乳藥濃度還與半衰期、給藥時(shí)間、給藥途徑、乳汁成分含量等有關(guān)。華而不實(shí)，乳汁成分是一個(gè)特別重要的因素。由于母乳中的蛋白質(zhì)、脂肪等成分會(huì)影響藥物進(jìn)入乳汁，而飲食、作息、哺乳時(shí)間及次數(shù)、哺乳方式等都會(huì)影響乳汁成分的含量[10,11]。因而，不同個(gè)體之間乳汁成分存在較大差異，這給乳汁中藥物濃度測(cè)定帶來了很多不確定性及挑戰(zhàn)。2、乳藥濃度檢測(cè)取樣及乳汁樣品前處理母乳是一種成分復(fù)雜的基質(zhì)，含有大量脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。但由于脂質(zhì)和蛋白質(zhì)在哺乳期內(nèi)是變化的，會(huì)影響藥物進(jìn)入乳汁的量；脂質(zhì)還會(huì)損壞用于分析的色譜柱。因而，在測(cè)定乳藥濃度時(shí)必須除去這些成分或者采用對(duì)這些物質(zhì)不敏感的測(cè)定方式方法。2.1、取樣乳汁能夠通過人工擠壓或用吸乳泵收集。擠壓的頻率、泵的真空壓力等會(huì)影響乳汁分泌的量，且不同的取樣方式可以能會(huì)導(dǎo)致乳汁成分含量變化，這些因素都會(huì)影響乳汁中藥物的含量[12]。人工擠壓的方式可能會(huì)對(duì)母親造成傷害，影響產(chǎn)奶量，且易引起細(xì)菌感染[13]；利用普通吸乳泵收集乳汁可能不是最準(zhǔn)確的方式方法[14]，但利用電動(dòng)吸乳泵取樣能夠提供一定程度的采樣重現(xiàn)性。因而，采集乳汁樣本宜選擇使用電動(dòng)吸乳泵。在獲得患者及家屬的同意后，分別在給藥后0.5、2、4、6、8、12、24h后用吸乳泵采集。通常在初乳期〔產(chǎn)后1~7天〕、過渡乳期〔產(chǎn)后8~14天〕、成熟乳期〔產(chǎn)后14天以上〕采集患者乳房內(nèi)全部乳汁，取2~5mL患者乳汁樣品于無菌聚丙烯管中[15,16]。取樣前注意用蒸餾水和去離子水清洗一下乳頭，在取樣經(jīng)過中盡量避免污染。2.2、乳汁樣品前處理乳汁中成分復(fù)雜且個(gè)體之間差異較大，給乳汁中藥物濃度測(cè)定帶來了極大的挑戰(zhàn)[17]。在進(jìn)樣分析時(shí)，乳汁中的多種雜質(zhì)可能會(huì)干擾主藥色譜峰的分析，脂肪和蛋白質(zhì)還易堵塞色譜柱。因而，在進(jìn)樣分析之前應(yīng)盡可能地去除乳汁中的雜質(zhì)，有效的乳汁樣品前處理方式方法也有助于提高檢測(cè)方式方法的靈敏度和選擇性。2.2.1、蛋白沉淀法(proteinprecipitation，PPT)將一定量蛋白沉淀劑參加生物樣品中除去蛋白質(zhì)，使與蛋白結(jié)合的藥物游離到有機(jī)試劑中，混勻離心，取上清液進(jìn)行分析。常用的蛋白沉淀劑有乙腈、甲醇、乙醇等，而pH值是影響PPT法對(duì)樣品提取率和回收率的重要因素。El-Gindy等[18]分別在酸堿性條件下用乙腈作為蛋白沉淀劑處理含阿替洛爾和氯喹酮的乳汁樣品，結(jié)果表示清楚乙腈和氫氧化鈉的組合不能將樣品中的蛋白質(zhì)沉淀完全沉淀出來，兩種藥物的回收率均低于70%；而參加磷酸或鹽酸的蛋白沉淀效果好，兩種藥物回收率均為95%左右。PPT法快速簡便、成本低，但不能完全除去乳汁樣品中的干擾物質(zhì)，可能導(dǎo)致強(qiáng)烈的基質(zhì)效應(yīng)，且微量的分析物可能隨蛋白質(zhì)共沉淀而損失。通常用PPT初步除去蛋白質(zhì)，再用其他方式方法萃取濃縮樣品。Wollein等[19]用乙腈除去含西地那非及其代謝物的乳汁樣品中的蛋白質(zhì)后離心，上清液用磷酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH為6后轉(zhuǎn)入SPE柱進(jìn)行萃取，西地那非和N-去甲基西地那非定量限分別為0.77ngmL-1和0.83ngmL-1。2.2.2、液液萃取法〔liquid-liquidextraction，LLE〕LLE是利用分析樣品在水和有機(jī)相中分配系數(shù)不同而被分離，到達(dá)消除干擾物質(zhì)、純化被測(cè)物質(zhì)的目的。在已報(bào)道的乳藥濃度測(cè)定的文獻(xiàn)中用到的萃取溶劑有乙醚[20]、二氯甲烷[18]、混合溶劑[21]等。使用LLE法時(shí)需考慮有機(jī)溶劑的選擇、體積比以及體系的pH等，適宜的有機(jī)溶劑和pH可使回收率增加，質(zhì)譜響應(yīng)加強(qiáng)。Grimm等[21]比擬了固相萃取法〔SPE〕和提取溶劑分別為正己烷-2-丙醇〔99：1，v/v〕〔A法〕、1-氯丁烷-乙腈〔4：1，v/v〕〔B法〕的兩種LLE法處理含丁丙諾啡〔BUP〕和去甲基丁丙諾啡〔norBUP〕的乳汁樣品的回收率。發(fā)現(xiàn)B法回收率最高而A法回收率最低，用1-氯丁烷-乙腈提取藥物，BUP和norBUP保存時(shí)間為4.3min和2.5min,定量下限分別為0.18ngmL-1和0.20ngmL-1。用LLE提取藥物后，提取液不能直接用于分析，待測(cè)組分可能因分布在較大體積溶劑中而達(dá)不到檢測(cè)靈敏度要求，因而可用氮?dú)獯蹈商崛∫涸賹悠啡芙庥诹鲃?dòng)相中再進(jìn)樣分析。Nakanishi等[20]用乙醚提取右旋美托咪唑后離心，上層用有機(jī)相吹干后復(fù)溶，渦旋離心、過濾后進(jìn)樣，回收率為82.4%~87.9%。LLE選擇性高，能夠有效減少基質(zhì)效應(yīng)；但有操作繁瑣、耗時(shí)長、樣品消耗量大、不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象等缺點(diǎn)，且萃取經(jīng)過中使用的一些化學(xué)物質(zhì)可能會(huì)對(duì)儀器造成損壞。2.2.3、固相萃取法〔solidphaseextraction，SPE〕SPE是利用不同物質(zhì)在固液兩相中互相作用的差異實(shí)現(xiàn)分離，其詳細(xì)操作是先使被分析物吸附到固定相上,然后使用不同洗脫能力的溶液(流動(dòng)相)分步洗脫,實(shí)現(xiàn)樣品的分離、純化與富集。SPE快速簡便、引入的干擾物質(zhì)少且能夠避免乳化現(xiàn)象，萃取柱有C18[22]、C8、強(qiáng)陽離子交換柱[23,24]、混合型陰離子交換柱[25]和HLB柱[26]。華而不實(shí)，HLB柱載樣量較C18大，回收率高，且柱干涸不影響回收；pH適應(yīng)性更廣，合適性質(zhì)各異的多種物質(zhì)的提取。Martnez-Huelamo等[27]比擬了C18、ENV+、HLB、MAX、SDB-RPS五種SPE體系對(duì)-內(nèi)酰胺類抗生素的回收率和提取效率，發(fā)現(xiàn)C18和HLB柱對(duì)所有目的青霉素都有較高的回收率和提取效率；但HLB柱比C18柱回收率更高層次，其采用1mL甲醇、1mL水和1mL0.1mmolL-1磷酸緩沖溶液〔pH10〕活化HLB柱，隨后用2mL甲醇洗脫樣品。脂溶性高的藥物易蓄積在脂肪中或與血漿蛋白結(jié)合，因而在萃取前使藥物游離出來能夠提高回收率。Manohar等[24]提取乳汁中的達(dá)匹韋林，用乙腈和正己烷毀壞脂肪球后離心，上清液轉(zhuǎn)入MCX柱萃取，達(dá)匹韋林定量下限達(dá)10pgmL-1，平均回收率70.3%。樣品溶液的pH值在固相萃取經(jīng)過中起著至關(guān)重要的作用，為了減少基質(zhì)效應(yīng)，提高吸附效率，必須控制好樣品溶液的pH值。對(duì)于一些弱酸性和弱堿性藥物，通過調(diào)節(jié)緩沖液pH改變分析物離子化程度，能夠獲得理想的萃取效果。Hou等[26]將2g含5種頭孢菌素和去乙酰頭孢菌素的牛乳樣品直接注入HLB柱，結(jié)果有5種頭孢菌素回收率低于25%；而用pH8.5~9.0的PBS稀釋牛奶樣品后，所有待測(cè)物的回收率均達(dá)94%以上。SPE的局限性是固相萃取小柱成本高，對(duì)很多樣品的固相萃取空白值較高，且靈敏度比LLE差。當(dāng)前也有實(shí)驗(yàn)使用納米顆粒作為SPE的吸附劑，其能夠提供比微米級(jí)顆粒更好的萃取能力和效率。Shimoyama等[28]建立了乳汁中卡馬西平濃度測(cè)定的HPLC法，采用C18固相萃取柱萃取卡馬西平，洗脫液為5mL60%甲醇，方式方法檢測(cè)限為5?gmL-1。Ghoraba等[29]也采用HPLC法測(cè)定卡馬西平乳藥濃度，使用鋅修飾的納米硫顆粒作為固相萃取吸附劑來分離、純化乳汁和血漿樣品中的卡馬西平，洗脫液為250?L甲醇，方式方法檢測(cè)限僅為0.16ngmL-1，與傳統(tǒng)SPE法相比有機(jī)溶劑使用量少、靈敏度高、線性好。2.2.4、其他方式方法隨著藥物分析技術(shù)的不斷提高，生物樣品預(yù)處理技術(shù)得到迅速發(fā)展，一些新興的生物樣品預(yù)處理技術(shù)被應(yīng)用于乳汁樣品?！?〕新型液液萃取技術(shù)液液萃取新技術(shù)有均相液液萃取〔HLLE〕、液液微萃取〔LLME〕、ExtrelurNT液液萃取。華而不實(shí)，LLME由于比LLE快速簡便、富集倍數(shù)大、萃取效率高、有機(jī)溶劑用量少，在生物樣品前處理中逐步得到運(yùn)用。LLME以綠色環(huán)保、穩(wěn)定性高的離子液體作為萃取溶劑，能夠克制傳統(tǒng)萃取溶劑易揮發(fā)的特點(diǎn)。Padr等[30]利用1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C8MIM][PF6])離子液體液液微萃取〔IL-DLLME〕HPLC-UV法測(cè)定乳汁中芐硝唑和硝呋莫司的濃度，并使用中心組合設(shè)計(jì)方式方法〔CCD〕找到實(shí)驗(yàn)最佳工作條件，平均回收率分別為7.5%、89.7%，當(dāng)S/N=10.0時(shí)，芐硝唑和硝呋莫司定量下限為0.30?gmL-1和0.20?gmL-1?！?〕固相萃取新技術(shù)固相萃取新技術(shù)包括限進(jìn)填料固相萃取、固相微萃取〔SPME〕和在線固相萃取。限進(jìn)填料〔restricted-accessmaterial,RAM〕是一種新型在線樣品預(yù)處理填料，其在色譜填料外外表進(jìn)行親水性修飾進(jìn)而能夠阻止生物樣品中的大分子物質(zhì)與固定相接觸發(fā)生不可逆的變性和吸附。RAM可作分析柱或預(yù)處理柱實(shí)現(xiàn)生物樣品的自動(dòng)化分析，蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)能夠直接被預(yù)處理流動(dòng)相洗脫，而小分子待測(cè)組分被富集在限進(jìn)柱上。RAM與液相色譜在線聯(lián)用可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物體液的直接進(jìn)樣而無需復(fù)雜的樣品前處理步驟。Lopes等[31]建立了RAM-BSA柱同時(shí)作為預(yù)處理柱和分析柱測(cè)定卡馬西平〔CMZ〕和活性代謝產(chǎn)物10,11-環(huán)氧卡馬西平(CMZE)乳藥濃度的LC-IT-MS/MS法，提供了一種靈敏度高、無基質(zhì)效應(yīng)且?guī)缀醪恍枰獦悠分苽涞姆治龇绞椒椒?，CMZ和CMZE檢測(cè)限分別為25ngmL-1和50ngmL-1?！?〕干乳點(diǎn)〔driedbreast-milkspot,DBMS〕采樣技術(shù)干乳點(diǎn)采樣技術(shù)是將乳汁樣品滴到采樣卡的圓圈內(nèi)后室溫下過夜晾干，將樣品收集在卡紙上[32]。與PPT和LLE等傳統(tǒng)前處理方式方法相比，DBMS法有樣品容量小、易于收集、生物安全性高、可常溫儲(chǔ)存、運(yùn)輸成本低、加強(qiáng)某些分析物的穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，但測(cè)定結(jié)果可能受點(diǎn)樣條件影響且不適用于不穩(wěn)定的藥物。一些抗病毒藥的乳汁濃度測(cè)定采用此法，如拉米未定[33]、奈維拉平[34]、依法韋侖[35]等。Olagunju等[35]將含依法韋侖的乳汁制成干乳點(diǎn)后用打孔機(jī)取下放入試管中，用甲醇提取后上清液蒸干，復(fù)溶于流動(dòng)相中進(jìn)樣分析，分析時(shí)間為5min，依法韋侖保存時(shí)間為2.27min，平均回收率106.4%。3、乳藥物濃度測(cè)定方式方法體內(nèi)藥物濃度監(jiān)測(cè)方式方法有很多，在已開展的乳藥濃度監(jiān)測(cè)中常用的方式方法為免疫分析法及色譜法。3.1、免疫分析法免疫分析法是基于抗原與抗體特異性反響進(jìn)行檢測(cè)的分析手段，主要有熒光免疫分析法〔FIA〕、酶免疫分析法〔EIA〕、放射免疫分析法〔RIA〕等。此類方式方法具有特異性強(qiáng)、成本低、操作簡單快速、無需復(fù)雜的設(shè)備等特點(diǎn)，不僅可用于測(cè)定蛋白質(zhì)、酶等大分子物質(zhì)，而且還廣泛用于測(cè)定小分子藥物，在體內(nèi)藥物分析中已成為一種必不可少的監(jiān)測(cè)技術(shù)。Raysyan等[36]建立了基于乳膠微粒的測(cè)流免疫法來測(cè)定乳汁中多種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，分析樣品與固定在測(cè)試線上的測(cè)試抗原競爭結(jié)合乳膠抗體探針，可用肉眼或掃描儀判定顏色變化。該法能在10min內(nèi)完成，對(duì)6種大環(huán)內(nèi)酯的檢測(cè)范圍為2.5~180ngmL-1，明顯低于給藥后乳汁中這些抗生素的預(yù)期濃度，因而此法適用于監(jiān)測(cè)抗生素在母乳中的分布，為安全母乳喂養(yǎng)提供根據(jù)。Zong等[37]建立了測(cè)定乳粉中諾氟沙星〔NOR〕的紙基熒光免疫法，以量子點(diǎn)標(biāo)記的諾氟沙星單克隆抗體〔QDs-Ab〕為探針辨別相應(yīng)的NOR，未與待測(cè)NOR結(jié)合的QDs-Ab被紙基上固定的NOR-BSA偶聯(lián)物捕獲而產(chǎn)生熒光，而與NOR結(jié)合的QDs-Ab則可從紙基上洗去，方式方法檢測(cè)限為10pgmL-1。此法成本低、選擇性高、靈敏度高，且紙質(zhì)分析裝置具有綠色環(huán)保、分析速度快、樣本量小、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)。免疫分析法固然具有較高的靈敏度和選擇性且無需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，但測(cè)定步驟多且不能對(duì)多種藥物同時(shí)檢測(cè)。藥物抗體還可能與構(gòu)造相近的代謝產(chǎn)物、內(nèi)源性物質(zhì)發(fā)生穿插反響而引起誤差，因而免疫分析法應(yīng)盡量提高反響專屬性，盡可能避免或減少誤差。3.2、色譜法色譜法包括薄層色譜、氣相色譜〔GC〕、高效液相色譜〔HPLC〕等。GC受進(jìn)樣條件限制，在乳藥濃度測(cè)定中應(yīng)用較少；而HPLC和GC相比，固定相種類更多、流動(dòng)相選擇范圍更廣且不受樣品揮發(fā)性和穩(wěn)定性的限制，在體內(nèi)藥物分析中應(yīng)用更廣泛。液相色譜法分為液相色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)兩部分，化合物經(jīng)色譜柱分離后，再進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行鑒定。HPLC分離效率高，但靈敏度較低，鑒定能力缺乏，定量下限多為微克級(jí)；且HPLC法選擇性差，對(duì)于未知成分的樣品難以定性。在體內(nèi)藥物分析中，血漿、尿液、乳汁等生物樣品中被測(cè)藥物往往濃度較低，干擾雜質(zhì)較多，利用HPLC分析往往檢測(cè)靈敏度和專屬性達(dá)不到要求。質(zhì)譜儀具有很好的定性能力及高選擇性、高靈敏度，且能夠獲得豐富的化合物構(gòu)造信息。液質(zhì)聯(lián)用法將質(zhì)譜儀〔MS〕作為HPLC的檢測(cè)器，能夠?qū)⑸V的高分離能力和MS的強(qiáng)定性功能結(jié)合起來，在很大程度上擴(kuò)展了HPLC的應(yīng)用范圍，因而被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)藥物分析，在已有的乳藥濃度研究中大多采用液質(zhì)聯(lián)用法。3.2.1、分離系統(tǒng)〔1〕反相色譜法反相色譜法中采用的色譜柱有C18[38]、C8、氰基柱[18]等，華而不實(shí)，C18柱是乳藥濃度測(cè)定最常用的色譜柱，流動(dòng)相常選擇乙腈-水、甲醇-水等。若待測(cè)物本身具有酸堿性，向流動(dòng)相中參加酸堿調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)分析物保存時(shí)間，優(yōu)化色譜峰形。華而不實(shí)，甲酸、乙酸、醋酸銨是使用最多的酸堿調(diào)節(jié)劑。色譜洗脫方式分為梯度洗脫和等度洗脫。梯度洗脫條件簡單、對(duì)儀器要求不高，但分析時(shí)間較長；當(dāng)藥物與干擾物質(zhì)極性相差大時(shí)，采用梯度洗脫能夠在較短時(shí)間內(nèi)將分析物分離，但梯度洗脫比等度洗脫更為復(fù)雜、困難。因而，在能到達(dá)較好分離度的情況下優(yōu)先使用等度洗脫。Salazar等[39]利用LC-MS法測(cè)定乳汁中五種抗抑郁藥時(shí)，為選擇最佳實(shí)驗(yàn)條件對(duì)不同的pH值、流速、烘箱溫度、緩沖液的量濃度和流動(dòng)相組成進(jìn)行了測(cè)定，在最優(yōu)條件下分析物能夠在等度洗脫中被分離測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示清楚最佳流動(dòng)相為乙腈-乙酸銨緩沖液(pH6.0;20mmol/L)(75:25,v/v)，此時(shí)色譜具有較好的峰形、光譜響應(yīng)和靈敏度；采用C8柱時(shí)的最佳流速為0.7mLmin-1，該流速下所有化合物的色譜分離效果更好。反相色譜法與質(zhì)譜聯(lián)用后，所需樣本量小、選擇性和靈敏度更高層次、特異性更強(qiáng)，定量下限可達(dá)ngmL-1甚至pgmL-1。PhyoLwin[40]等建立了測(cè)定乳汁和血漿中阿替洛爾濃度的LC-MS/MS法，采用C18柱，梯度洗脫，保存時(shí)間為2min，沒有基質(zhì)效應(yīng)的干擾，血漿和乳汁中的定量限均為0.5ngmL-1；而El-Gindy[18]等采用氰基柱，乙腈-水〔35:65，v/v，pH4.0〕流動(dòng)相體系，梯度洗脫，建立了測(cè)定乳汁中阿替洛爾和氯噻酮的HPLC-UV法，阿替洛爾和氯噻酮定量下限為0.3?gmL-1和0.25?gmL-1。〔2〕二維色譜法分離成分復(fù)雜的乳汁中的樣品需要分離能力更強(qiáng)的方式方法，而二維色譜能使樣品組分在兩個(gè)不同的分離條件下進(jìn)行分離，顯著提高了分離能力，在生物樣品分離中顯示出了極大的優(yōu)勢(shì)。Lopes等[41]以RAM-BSAC8為預(yù)處理柱，C18柱為分析柱，測(cè)定初乳和成熟乳中氟西汀和去氟西汀的濃度。此法大幅度減少基質(zhì)效應(yīng)、靈敏度高、樣品前處理簡單，分析時(shí)間僅需12min，溶劑用量少，氟西汀和去氟西汀的定量下限分別為3ngmL-1、4ngmL-1。〔3〕超高效液相色譜UHPLC與傳統(tǒng)的HPLC相比的分析速度、靈敏度及分離度更高層次，分析時(shí)間縮短，溶劑用量減少。利用UPLC能夠很好解決成分復(fù)雜、分離困難等問題，因而能夠用于分析成分復(fù)雜的乳汁。當(dāng)前，利用UPLC-MS/MS法測(cè)定乳藥濃度的藥物有抗生素類[26,42]、抗病毒藥[43,44]、抗凝藥[51]等。Manohar等[24]建立了UPLC-MS/MS法定量測(cè)定人乳中達(dá)匹韋林，流動(dòng)相為含1%甲酸的水〔A〕和含1%甲酸的乙腈〔B〕，梯度洗脫，分析時(shí)間僅3min，定量下限達(dá)10pgmL-1?！?〕手性色譜法一些藥物及其代謝產(chǎn)物為手性化合物，但左旋體和右旋體分子量相等但藥理活性不同，利用反相色譜柱無法將其分離。在手性色譜中，手性異構(gòu)分子與固定相或流動(dòng)相作用轉(zhuǎn)化為非對(duì)映體而被分開。西酞普蘭〔CIT〕及其代謝產(chǎn)物DCIT和DDCIT都是手性化合物，右旋西酞普蘭和少量的DCIT起主要藥理作用。Weisskopf等[23]建立了測(cè)定CIT和DCIT對(duì)映體的手性色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，成功分離CIT和DCIT對(duì)映體并定量。此法選擇電噴霧電離源和MRM形式，流動(dòng)相為醋酸銨〔20mmolL-1,pH9.0〕-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，CIT對(duì)映體定量下限為0.1ngmL-1，DCIT對(duì)映體定量下限為0.3ngmL-1。3.2.2、檢測(cè)系統(tǒng)HPLC常用的檢測(cè)器有紫外、熒光、電化學(xué)、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等。在已報(bào)道的HPLC法測(cè)定乳汁中藥物濃度的文獻(xiàn)中，采用的檢測(cè)器一般為紫外檢測(cè)器[28]和熒光檢測(cè)器[45,46]。在以MS及串聯(lián)質(zhì)譜〔MS/MS〕作為檢測(cè)器的液質(zhì)聯(lián)用法〔LC-MS/MS〕中，MS/MS分析的有子離子掃描、母離子掃描、中性丟失、有單離子監(jiān)測(cè)〔SIM〕、選擇反響監(jiān)測(cè)(SRM)、多反響監(jiān)測(cè)(MRM)等掃描形式。華而不實(shí)，SIM是針對(duì)一級(jí)質(zhì)譜而言的，即只掃一個(gè)離子；而SRM是針對(duì)二級(jí)或多級(jí)質(zhì)譜的某兩級(jí)之間的掃描形式，即選擇一個(gè)特征母離子做MS/MS，在其碎片中選擇一個(gè)特征子離子作為監(jiān)測(cè)離子。MRM是指同時(shí)測(cè)定多種化合物時(shí)，多個(gè)SRM同時(shí)進(jìn)行，因而特點(diǎn)與SRM類似。相較于SIM，SRM和MRM靈敏度和信噪比更高層次，排基質(zhì)干擾能力更強(qiáng)，分析基質(zhì)復(fù)雜的樣品時(shí)具有更高層次的分辨率。在利用液質(zhì)聯(lián)用法監(jiān)測(cè)乳藥濃度的文獻(xiàn)中，所采用的質(zhì)譜儀有單重四極桿質(zhì)譜儀〔QMS〕及串聯(lián)質(zhì)譜〔MS/MS〕，MS/MS又包括三重四極桿質(zhì)譜儀〔QQQ〕、三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀〔QTRAP〕、四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜〔QTOF〕等。1.QMSQMS構(gòu)造簡單，分辨率低，掃描形式可選擇全掃描或SIM。QMS的全掃描形式只能獲得化合物的分子量；相對(duì)于全掃描，SIM形式靈敏度較高、定量能力較強(qiáng)，在樣品基質(zhì)不太復(fù)雜時(shí)掃描效果較好。但QMS由于無串聯(lián)能力、特異性較差、定性能力缺乏，已逐步被更高層次分辨率的質(zhì)譜或者串聯(lián)質(zhì)譜取代。2.MS/MSMS/MS是將兩級(jí)或兩級(jí)以上的質(zhì)量分析器串聯(lián)起來使用，被測(cè)物在離子源被離子化后，經(jīng)第一級(jí)質(zhì)譜選擇感興趣的離子傳送至碰撞室，產(chǎn)生的一系列碎片離子由第二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)一步分離分析，最后到達(dá)檢測(cè)器檢測(cè)，產(chǎn)生相應(yīng)的質(zhì)譜圖。MS/MS能夠提供更豐富的構(gòu)造信息，十分合適用于組成成分復(fù)雜且干擾物質(zhì)多的樣品中低含量組分的分析測(cè)定。在乳汁藥物濃度測(cè)定中多將串聯(lián)質(zhì)譜法與色譜法聯(lián)用以從成分復(fù)雜的乳汁基質(zhì)中盡可能獲得更多的分子離子和碎片離子的信息。〔1〕QQQQQQ是由兩個(gè)單重四極桿通過中間的碰撞室串聯(lián)起來，具有SRM、MRM、母離子掃描、中性丟失、子離子掃描等功能。與單重四極桿相比，QQQ選擇性和靈敏度更高層次，在執(zhí)行中性丟失掃描和母離子掃描形式時(shí)具有最好的靈敏性和準(zhǔn)確性，是乳藥濃度測(cè)定中最常使用的質(zhì)譜儀[47,48,49,50,51,52]。在已開展的乳藥濃度測(cè)定中，QQQ多采用SRM或MRM形式[26,53,54]。Ma[55]等采用液相-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀分析牛乳中12種糖皮質(zhì)激素殘留，在MRM正離子形式下，選擇[M+H]+作為所有糖皮質(zhì)激素的母離子，監(jiān)測(cè)失去H2O和HF的碎片離子，糖皮質(zhì)激素定量限在0.01～0.5?gkg-1范圍內(nèi)。QQQ在定量分析方面具有很好的靈敏度和重現(xiàn)性，但其定性能力仍不夠好，不是獲取質(zhì)譜圖或精到準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)最好的儀器。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在QQQ的基礎(chǔ)上又制造出了靈敏度更高層次、定性分析能力更好的QTRAP和QTOF質(zhì)譜儀。〔2〕QTRAPQTRAP將三重四極桿中最后一級(jí)四極桿〔Q3〕改為線性離子阱，使得Q3同時(shí)具有線性離子阱定性功能和傳統(tǒng)四極桿定量功能。與傳統(tǒng)三重四極桿相比，QTRAP靈敏度更高層次且可得到更豐富的信息量，因而在乳汁藥物濃度測(cè)定中也得到了應(yīng)用[56,57,58,59]。QTRAP所具有的IDA技術(shù)還能夠進(jìn)行代謝物鑒定，預(yù)估代謝途徑。Wollein等[19]采用LC-MS/MS法檢測(cè)母乳中西地那非及其代謝產(chǎn)物，在MRM形式下，利用QTRAP離子阱掃描形式辨別到N-去甲基西地那非旁邊還有兩個(gè)代謝產(chǎn)物并據(jù)此分析了西地那非代謝途徑?！?〕QTOFQTOF是四極桿與飛行時(shí)間質(zhì)量分析器的串聯(lián)，以QMS為質(zhì)量過濾器，飛行時(shí)間質(zhì)譜儀為質(zhì)量分析器。Lwin等[60]利用LC-MS/MS法分析乳汁中培哚普利及其代謝產(chǎn)物培哚普利拉濃度時(shí)，用QQQ檢測(cè)培哚普利，QTOF檢測(cè)培哚普利拉，定量下限均為0.5ng/mL。QTOF靈敏度高、分析速度快、能夠提供高分辨率二級(jí)圖譜，定性能力優(yōu)于QQQ，但在定量分析方面的靈敏度不如QQQ。因而，液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定乳藥濃度中使用最多的質(zhì)譜儀還是QQQ。4、總結(jié)與瞻望測(cè)定乳汁中的藥物濃度對(duì)評(píng)估藥物在哺乳期使用的安全性特別重要。當(dāng)前已進(jìn)行乳藥濃度監(jiān)測(cè)的藥物還不多，乳汁中的復(fù)雜成分對(duì)藥物濃度的測(cè)定帶來了一定的困難，樣品前處理還是乳藥濃度測(cè)定的瓶頸。有效的樣品預(yù)處理方式方法能減少基質(zhì)效應(yīng)、提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，因而開發(fā)和完善前處理方式方法對(duì)乳藥濃度測(cè)定特別重要。建立準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定的臨床樣本監(jiān)測(cè)方式方法是臨床常規(guī)開展乳藥濃度監(jiān)測(cè)、保障哺乳期婦女合理安全用藥的關(guān)鍵。但現(xiàn)有的乳藥濃度測(cè)定檢測(cè)方式方法各有其優(yōu)勢(shì)，因而需要結(jié)合藥物理化性質(zhì)以及在乳汁中的存在形式靈敏選用乳藥濃度監(jiān)測(cè)方式方法?？傊樗帩舛缺O(jiān)測(cè)在開發(fā)更新更理想的藥物乳汁濃度測(cè)定技術(shù)、建立更科學(xué)合理乳藥濃度檢測(cè)方式方法等方面仍有很多工作要做。以下為參考文獻(xiàn)[1]AdemolloN,FerraraF,DeliseM,etal.Nonylphenolandoctylphenolinhumanbreastmilk[J].EnvironInt,2008,34(7):984-987.[2]VerstegenRHJ,ItoS.Drugsinlactation[J].JObstetGynaecolRes,2022,45(3):522-531.[3]SpencerB.MedicationsandBreastfeedingforMothersWithChronicIllness[J].JObstetGynecolNeonatalNurs,2021,44(4),543-552.[4]ItoS,LeeA.Drugexcretionintobreastmilk--overview[J].AdvDrugDelivRev,2003,55(5):617-627.[5]AndersonPO.DrugsinLactation[J].PharmRes,2021,35(3):45.[6]NewtonER,HaleTW.DrugsinBreastMilk[J].ClinObstetGynecol,2021,58(4):868-884.[7]AndersonPO,SauberanJB.Modelingdrugpassageintohumanmilk[J].ClinPharmacolTher,2021,100(1):42-52.[8]BaileyB,ItoS.Breast-feedingandmaternaldruguse[J].PediatrClinNorthAm,1997,44(1):41-54.[9]BreitzkaRL,SandritterTL,HatzopoulosFK.Principlesofdrugtransferintobreastmilkanddrugdispositioninthenursinginfant[J].JHumLact,1997,13:155-158.[10]Bzikowska-JuraA,SobierajP,Szostak-W?gierekD,etal.ImpactofInfantandMaternalFactorsonEnergyandMacronutrientCompositionofHumanMilk[J].Nutrients,2020,12(9):2591.[11]WelchRM,FindlayJW.Excretionofdrugsinhumanbreastmilk[J].DrugMetabRev,1981,12(2):261-277.[12]BeckerGE,SmithHA,CooneyF.Methodsofmilkexpressionforlactatingwomen[J].CochraneDatabaseSystRev,2021,9(9):CD006170.[13]BeggEJ,DuffullSB,HackettLP,etal.Studyingdrugsinhumanmilk:timetounifytheapproach[J].JHumLact,2002,18(4):323-332.[14]AndersonPO,MomperJD.Clinicallactationstudiesandtheroleofpharmacokineticmodelingandsimulationinpredictingdrugexposuresinbreastfedinfants[J].JPharmacokinetPhar,2020,47(4):295-304.[15]QinY,ShiW,ZhuangJ,etal.Variationsinmelatoninlevelsinpretermandtermhumanbreastmilkduringthefirstmonthafterdelivery[J].SciRep,2022,9(1):17984.[16]Plaza-ZamoraJ,Sabater-MolinaM,Rodrguez-PalmeroM,etal.Polyaminesinhumanbreastmilkforpretermandterminfants[J].JHumNutrDiet,2020,110(3):524-528.[17]LopesBR,BarreiroJC,CassQB.Bioanalyticalchallenge:Areviewofenvironmentalandpharmaceuticalscontaminantsinhumanmilk[J].JPharmBiomedAnal,2021,130:318-325.[18]El-GindyA,SallamS,Abdel-SalamRA.HPLCmethodforthesimultaneousdeterminationofatenololandchlorthalidoneinhumanbreastmilk[J].JSepSci,2008,31(4):677-682.[19]WolleinU,SchechB,HardtJ,etal.Determinationandquantitationofsildenafilanditsmajormetaboliteinthebreastmilkofalactatingwoman[J].JPharmBiomedAnal,2021,120:100-105[20]NakanishiR,YoshimuraM,SunoM,etal.Detectionofdexmedetomidineinhumanbreastmilkusingliquidchromatography-tandemmassspectrometry:ApplicationtoastudyofdrugsafetyinbreastfeedingafterCesareansection[J].JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci,2021,1040:208-213.[21]GrimmD,PaulyE,P?schlJ,etal.Buprenorphineandnorbuprenorphineconcentrationsinhumanbreastmilksamplesdeterminedbyliquidchromatography-tandemmassspectrometry[J].TherDrugMonit,2005,27(4):526-530.[22]RezkNL,WhiteN,BridgesAS,etal.Studiesonantiretroviraldrugconcentrationsinbreastmilk:validationofaliquidchromatography-tandemmassspectrometricmethodforthedeterminationof7anti-humanimmunodeficiencyvirusmedications[J].TherDrugMonit,2008,30(5):611-619.[23]WeisskopfEP,AudA,NguyenKA,etal.Stereoselectivedeterminationofcitalopramanddesmethylcitalopraminhumanplasmaandbreastmilkbyliquidchromatographytandemmassspectrometry[J].JPharmBiomedAnal,2021,131:233-245.[24]ManoharM,MarzinkeMA.Validationandimplementationofanultrasensitiveliquidchromatographic-tandemmassspectrometric(LC-MS/MS)assayfordapivirinequantitationinbreastmilk[J].ClinBiochem,2020,82:66-72.[25]DevreeseM,MaesA,DeBaereS,etal.ComparativemethodvalidationforclosanteldeterminationincattleandsheepmilkaccordingtoEuropeanUnionVolume8andVeterinaryInternationalConferenceonHarmonizationguidelines[J].JChromatogrA,2020,1353:106-113.[26]HouXL,WuYL,LvY,etal.Developmentandvalidationofanultrahighperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometrymethodfordeterminationof10cephalosporinsanddesacetylcefapirininmilk[J].JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci,2020,931:6-11.[27]Martnez-HuelamoM,Jimnez-GmezE,HermoMP,etal.DeterminationofpenicillinsinmilkusingLC-UV,LC-MSandLC-MS/MS[J].JSepSci,2018,32(14):2385-2393.[28]ShimoyamaR,OhkuboT,SugawaraK.Monitoringofcarbamazepineandcarbamazepine10,11-epoxideinbreastmilkandplasmabyhigh-performanceliquidchromatography[J].AnnClinBiochem,2000,37(Pt2):210-215.[29]GhorabaZ,AibaghiB,SoleymanpourA.Applicationofcation-modifiedsulfurnanoparticlesasanefficientsorbentforseparationandpreconcentrationofcarbamazepineinbiologicalandpharmaceuticalsamplespriortoitsdeterminationbyhigh-performanceliquidchromatography[J].JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci,2021,1063:245-252[30]PadrJM,PellegrinoVidalRB,EchevarriaRN,etal.Developmentofanionic-liquid-baseddispersiveliquid-liquidmicroextractionmethodforthedeterminationofantichagasicdrugsinhumanbreastmilk:Opt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