甜草化學成分的研究

甜草化學成分的研究劉文基李厚金*(中山大學化學與化工學院，廣州，510275)摘要甜草是我國南方的一種民間草藥。本文對采集于江西贛南的甜草化學成分進行了系統(tǒng)研究。用95%的乙醇浸泡提取，用柱層析，薄層層析，以及重結(jié)晶的方法分離提純甜草中的化學成分。低極性成分的組成和含量通過GCMS分析確定，中等極性組分主要運用柱色譜法進行了分離、純化,得到4個純化合物，脂肪酸，谷甾醇和2個三萜類化合物，化合物結(jié)構(gòu)通過紫外光譜法，紅外光譜法，質(zhì)譜法，核磁共振等實驗綜合解析確定。同時對得到的三萜化合物進行了藥理測試。關(guān)鍵詞：甜草，化學成分，三萜AbstractOldenlandiacantonensisHowisoneoffolkmedicineinsouthofchina.TheOldenlandiacantonensisHowwasextractedwith95%alcohol.Thecrudeextractswassubjectedtoseparationandpurificationbythinlayerchromatography(TLC)andcolumnchromatography(CC).TheconstitutionandcontentoflowpolaritycomponentareanalyzedbyGCMS.Thecomponentsofmiddlepolarityareseparatedandpurifiedbycolumnchromatography(CC).TheirstructureswereelucidatedbyUV,IR,NMR,MS.Asaresult,fourcompoundswereobtained,fattyacid,plantsterolalcoholandtwoTriterpenoidcompounds.AlsowemakesomemedicinetestingtoTriterpenoidcompounds.Keywords:OldenlandiacantonensisHow,Chemicalconstitute,Triterpenoid甜草是茜草科植物，在《江西草藥》有藥用記載，其性平，味甘，有治療黃疸型肝炎、糖尿病、外傷出血、清熱解毒的功效，其葉子榨汁，可用于蜜蜂、黃蜂等蜂類的蟄傷。目前尚未見到關(guān)于甜草OldenlandiacantonensisHow化學成分的研究報告，本實驗對甜草化學成分的分離，提純，鑒定，低極性成分用GCMS分析確定，中等極性成分中分離到4個純化合物，脂肪酸，谷甾醇和2個新的三萜類化合物。通過對三萜化合物藥理測試，2個三萜化合物活性顯著,對人肝癌細胞株Bel-7402的IC50值分別為6.5mg/ml，7.0mg/ml，對人胃腺癌細胞株Mcg-803的IC50值分別為8.0mg/ml，7.0mg/ml，化合物具有明顯的制備抗腫瘤藥物的前景。1實驗部分1.1儀器與試劑儀器：HP6890/5973GC/MS聯(lián)用儀，紅外光譜儀（KBr壓片），300MHz、500MHz核磁共振儀。試劑：95%乙醇，甲醇，乙酸乙酯，石油醚，氯仿，H-硅膠，1.2采集與提取原料甜草，2004年7月份采集于江西省地區(qū)的向陽山坡，取地上全草，曬干剪碎，用95%乙醇多次浸泡，合并浸泡液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，濃縮物再用甲醇溶解，溶解液拌硅膠。1.3分離提純將硅膠拌樣吹干至呈粉末狀態(tài)，進行柱層析初步分離。先用石油醚濕法裝柱，然后用PE和EA配比溶液梯度沖洗柱子。對初次柱層析得到的溶液,低極性成分用GC-MS分析，中等極性成分進行柱層析分離操作。用重結(jié)晶方法對化合物進一步提純，最后從中等極性成分中分離得到四個化合物成分（A，B，C，D）。2結(jié)果討論2.1低極性成分的GC-MS分析液體油狀物用氯仿溶解，進行GC-MS分析。色譜條件：HP25MS30m×0.25mm×0.25μm彈性石英毛細管柱。程序升溫：初始柱溫50℃，5℃/min升至250℃，運行時間50min。進樣口溫度230℃，He氣為載氣，流速0.5mL/min，分流比20∶1，進樣量1μL。質(zhì)譜條件：離子源為EI源，離子源溫度230℃，質(zhì)量范圍40～500amu。表1甜草OldenlandiacantonensisHow的低極性成分及相對含量序號化合物含量(%)序號化合物含量(%)13,3,6-三甲基-2,5-庚二酮0.10313,7-二甲基-7-羥基-二甲縮醛0.7326,10,14-三甲基-2-十五烷酮1.25321-二十八烷醇0.9239-十八烯酸-1-甲基酯0.21332-二十七烷酮0.904Z-8-十六烯0.7534二十六烷酸甲基酯0.8051-十六酸乙基酯1.6435十四烷酸十四烷基酯0.9961,1-二甲氧基十二烷0.1736十一烷二甲縮醛0.8178,11-十八二烯酸甲基酯1.4337二十六烷0.6789(Z)-十八烯酸甲基酯2.14382-甲基丙基酸-十二烷基酯0.909十八烷酸甲基酯0.783928-Nor-17α-(H)-hopane0.54101-十七碳烯0.13401-烯-3-酮-10-二甲氧基甲基-17-乙酰氧基-雄甾烷0.48119,12-十八二烯酸乙基酯0.44413,5,22-三烯-豆甾烷0.5712油酸乙基酯0.51422-二十九烷酮1.2613十八烷酸乙基酯0.4243二十七酸甲基酯0.72145(Z)-十九碳烯0.2244VitaminE1.08153,7,11,15-四甲基-2-烯-1-十六醇0.3545十四酸十六烷基酯2.1616二十烷酸甲基酯0.4946十一烷基二甲縮醛0.9317正二十三烷0.774711-甲基-二十九烷0.79182,4-二-(1-甲基-1-苯基)乙基-苯酚0.7448桉葉油醇0.7619二十二烷酸甲基酯1.1549丁基酸環(huán)己醇酯1.5120二-n-辛基-鄰苯二甲酸酯1.04501,1-二甲氧基-9-(Z)-十八烷烯1.51212-十二烷基菲0.4751軟木三萜酮0.6622二十三烷酸甲基酯1.16523,5-二烯-3,17-二（三甲基硅氧基）-雄甾烷1.6323二十五碳烷1.2553十六烷基環(huán)氧丙烷0.89241-二十六碳烯1.32547-酮基-3-乙酰氧基-膽甾烷1.3425二十四烷酸甲基酯1.32551-氨基-4-甲基-哌嗪1.21263-甲酰氧基-11-羥基-17-酮基-雄甾烷0.40565,9(11)-二烯-3β-乙酰氧基-膽甾烷1.392711,13-二甲基-12-十四烯-1-醇-乙酸酯0.845722,23-二氫豆甾醇1.73281,1-二甲基-十四烷基-叔硫醇1.13583-酮基香樹脂0.95291-(2-十二烷烯)-丁二酸酐0.39595-雄甾烷烯-3β,17β-二乙酰氧基1.7430二十二烷酸甲基酯0.71609-十八烯酸-二十烷醇酯2.072.2中等極性成分分析分離到的第一種化合物A：為淺白奶油色油狀固體，微加熱即融化,1H-NMR（CDCl3,TMS,ppm）：7.223，3.634，2.340，2.316，2.291，2.272，2.246，1.277，1.232，1.144，1.123，0.877，0.855，0.832，0.810。7.223為氘帶氯仿的溶劑峰；3.634為連氧氫所顯示的峰（可能是化合物中含有羥基）。2.340，2.316，2.291，2.272，2.246，前后之間ppm值的差分別為0.024，0.025，0.019，0.026，通過分析，可能是T，D峰的重疊，可確定此化合物中碳氫連著羰基。1.277，1.232，1.144，1.123，峰的高度較高，可確定這些峰是烷基長鏈所顯示的峰，其中通過高度可確定有7個亞甲基相連。0.877，0.855，0.832，0.810，前后之間的ppm值平均相差為0.22，J=300*0.22=6.6，為四重峰，可確定化合物A中含甲基。A紅外光譜，IR/cm－1（KBr）：3448，2920，2851，2366，2342，1740，1652，1545，1463，1438，1378，1172。其中3448為羥基伸縮振動峰，2920和2851為碳氫伸縮振動吸收峰，2366和2342為空氣中二氧化碳吸收峰，1740為羰基吸收峰，1378-1463為甲基伸縮振動峰。確定此化合物為十二碳脂肪酸。圖1化合物A的1H-NMR圖化合物B，白色粉末固體,1H-NMR（CD3COCD3，TMS，ppm）：5.226，2.793，2.057，2.049，1.293，1.171，1.128，0.988，0.969，0.952，0.943，0.918，0.898，0.884，0.865，0.839，0.810，0.783。5.226為連雙鍵氫的吸收峰；2.793，為單峰，可初步確定此峰型為水（羥基）的吸收峰；2.057，2.049，其為背景溶劑氘帶丙酮的吸收峰；1.293，1.171，1.128為烷基長鏈的吸收峰；0.988-0.783號峰為甲基吸收峰。IR/cm－1（KBr）：3421，2927，1690，1651，1574，1456，1407，1273，1185。其中3421為羥基伸縮振動吸收峰，2927為碳氫伸縮振動吸收峰，1690和1651為雙鍵伸縮振動吸收峰，1456和1407為甲基吸收峰。確定此化合物為谷甾醇。圖2化合物B的1H-NMR圖化合物C，白色固體，可結(jié)晶成透明針狀晶體。1H-NMR（CD3COCD3，TMS，ppm）：7.981，5.222，5.208，5.197，2.794，2.250，2.213，2.045，1.957，1.943，1.933，1.922，1.902，1.891，1.168，1.125，0.982，0.964，0.949，0.937，0.914，0.894，0.870，0.835，0.777。7.981，為單峰，可初步確定此峰型為活潑氫的吸收峰，可能是羥基或羧基；5.222、5.208、5.197，確定為雙鍵氫的吸收峰；2.794，確定為水的吸收峰；2.045，為丙酮溶劑的吸收峰；ppm值在1-2之間，可確定為亞甲基和次甲基烷基長鏈的吸收峰；ppm值為0.7-1之間，確定為多個甲基吸收峰。紅外光譜分析，IR/cm－1（KBr）：3428，2927，2856，2337，1736，1689，1632，1574，1458，1404，1385，1274，1254，1170，1107，1042，997。其中3428為羥基的紅外吸收峰；2927和2856為碳氫吸收峰；2337為空氣中二氧化碳吸收峰；1736羰基吸收峰；1458，1404，1385為甲基吸收峰?；衔顲其結(jié)構(gòu)還在測定中。圖3化合物C的1H-NMR圖化合物D，白色固體，其核磁共振譜NMR數(shù)據(jù)如表2所示。表2化合物的NMR數(shù)據(jù)(DMSO-d6,TMS,500MHz)位置編號DEPT13CNMR1HNMR1CH238.21.542CH223.71.50,1.913CH76.83.004C38.3——5CH54.70.666CH226.91.467CH232.61.578C46.7——9CH46.91.4510C41.6——11CH222.71.8612CH124.55.1313C138.1——14C41.5——15CH227.51.8016CH217.91.46,1.3017CH232.61.25,1.4318CH52.32.1119CH315.90.6820CH328.10.9021CH315.10.8722CH316.90.7623CH323.21.0424CH38.30.9425C178.1——26CH230.01.4227CH38.40.9528CH316.80.8229CH320.90.923-OH——4.1525-COOH——11.8C29H48O3,FABMS：m/z445[M+1]+，表明相對分子量為444。元素分析結(jié)果C,78.33;H,10.90;N,0.000。紅外光譜數(shù)據(jù)（KBr）：3420,2970,2928,2871,1693,1575,1455,1407,1313,1279,1249,1142,1091,1032,996,758,661,568。經(jīng)過文獻查閱，此化合物為新化合物。圖4化合物D的13C-NMR圖圖5化合物D的1H-NMR圖圖6化合物D的結(jié)構(gòu)示意圖化合物C，D藥理測試結(jié)果：表3對拓撲異構(gòu)酶（hTOPI）的IC50測定結(jié)果產(chǎn)物編號結(jié)構(gòu)產(chǎn)物來源IC50（μg/mL）C三萜甜草18D三萜類甜草15表4對肝癌細胞株Bel-7402的IC50值測定結(jié)果產(chǎn)物編號結(jié)構(gòu)產(chǎn)物來源IC50（μg/mL）C三萜甜草6.5D三萜類甜草7.0表5對人胃腺癌細胞株Mcg-803的IC50值測定結(jié)果產(chǎn)物編號結(jié)構(gòu)產(chǎn)物來源IC50（μg/mL）C三萜甜草8.0D三萜類甜草7.03結(jié)論對甜草化學成分提取方法中，用有機溶劑浸泡提取的方法非常有效，此法能提取出甜草中大部分有效藥用成分。對提取出的化合物用柱層析、薄層層析、重結(jié)晶方法進行有效的分離提純。在中草藥化學成分的鑒定中，利用光譜法中的紅外、紫外、核磁共振以及質(zhì)譜法鑒定化合物結(jié)構(gòu)，這些方法也將長期作為鑒定化合物的有效方法。通過對甜草中化合物的提取、分離、提純與鑒定，得到三個不同化合物，分別是甾醇類，脂肪酸類，三萜類化合物。甜草中的三萜類化合物，其抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗高血壓、抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶和多聚酶活性效果非常好，具有有意義細胞毒性，其IC50值為對人肝癌細胞株Bel-7402的IC50值分別為6.5g/ml，7.0g/ml，對人胃腺癌細胞株Mcg-803的IC50值分別為8.0g/ml，7.0g/ml，在拓撲異構(gòu)酶活性實驗中，它們的IC50分別為18和15μg/mL。對此類化合物的進一步發(fā)現(xiàn)和研究將推進中藥學的發(fā)展，并制造出新的藥物更好的治療腫瘤等疾病。致謝本實驗是創(chuàng)新基金資助項目（批準號32），感謝化學與化學工程學院創(chuàng)新化學實驗與研究基金項目。本實驗是在李厚金副教授的親自指導下完成的。在實驗中碰到不少困難，李老師都耐心仔細給予知道，引導我從實驗中發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題。致誠摯的感謝！同時也得到實驗室?guī)熜謳熃愕南ば闹笇В诖讼蛩麄儽硎旧钌畹母兄x！最后感謝我的朋友，同學對我的支持和幫助！參考文獻Bao-NingSou,Young-HwaKang,RosaElenaPinos,BernardD.Santarsiero.Isolationandabsolultestereochemistryofcoussaricacid,anewbioactiveTriterpenoidfromthestemsofCoussareabrevicaulis.Phytochemistry64(2003)293-302OmP.SharmaU,AnitaSingh,SaritaSharma.Levelsoflantadenes,bioactivepentacyclictriterpenoids,inyoungandmatureleavesofLantanacamaravar.aculeate.Fitoterapia712000487-491[3]T.R.Govindachariu,G.Suresh,G.N.KrishnaKumari,T.Rajamannar,P.D.Partho.Nymania-3:abioactiveTriterpenoidfromDysoxylummalabaricum.Fitoterapia70199983-86.[4]YuShao,BingNanZHOU.TownewTriterpenoidsaponinsasterbatanosideBandCfromAsterbatangensis.ChineseChemicalLettersVol.5.No.10.pp835-8391994[5]LuZeng,Zhe-mingGu,Ching-jerChang,KarlV.Wood,bandJerryL.Mclaughlin.Mefiavolkenin,aNewBioactiveTriterpenoidfromMeliavolkensii(Mefiaceae).Bioorganic&MedicinalChemistry,Vol.3,No.4,pp.383-390,1995[6]FRANCISCOA.MACfAS,*ANA