神經(jīng)系統(tǒng)中Tau蛋白的常規(guī)分析方法綜述,SCI醫(yī)學論文

神經(jīng)系統(tǒng)中Tau蛋白的常規(guī)分析方法綜述,SCI醫(yī)學論文摘要：Tau蛋白〔簡稱Tau〕，是一種介入神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的微管相關(guān)蛋白。其可經(jīng)歷構(gòu)象改變、異常mRNA剪接等,從微管解離，經(jīng)系列翻譯后修飾(Post-translationalmodification,PTM)，本身構(gòu)成病理性聚集，進而造成神經(jīng)退行性病變，最終構(gòu)成Tau病。研究Tau的病理經(jīng)過，分析評估其PTM及定量檢測其濃度變化，對Tau病的早期診斷、跟蹤、預防和治療具有重要意義。本文對當前國內(nèi)外Tau的常規(guī)分析方式方法進行了概述和比擬，重點闡述光學、電化學生物傳感方式方法的最新研究進展與相關(guān)應用，對將來發(fā)展方向進行了瞻望，為Tau蛋白的深切進入研究與應用提供參考。本文關(guān)鍵詞語：Tau蛋白;Tau病;生物傳感器;翻譯后修飾;評述;Abstract：Tauprotein,simplyreferredtoasTau,isatypeofmicrotubule-associatedproteininvolvedinthedevelopmentofthenervoussystem.Afterexperiencingconformationalchanges,abnormalmRNAsplicing,etc.Taudissociatesfrommicrotubulesandundergoesaseriesofpost-translationalmodification(PTM)toformpathologicalaggregation,whichinducesneurodegenerativediseasesandtauopathieseventually.NumerousclinicalstudiessuggestthatstudyingthepathologicalprocessofTauprotein,analyzingandevaluatingitsPTMandquantitativedetectionofconcentrationchangesareofgreatsignificancefortheearlydiagnosis,tracking,preventionandtreatmentoftauopathies.Inthispaper,theconventionalmethodsofTauproteinathomeandabroadweresummarizedandcompared.Specifically,therelatedapplicationsandlatestresearchprogressofopticalandelectrochemicalbiosensorsweremainlydescribed.Furthermore,thesummaryofitsfuturedirectionsandthepotentialapplicationswereproposed,whichprovidedreferenceforthefurtherresearchandapplication.Keyword：Tauprotein;Tauopathies;Biosensor;Post-translationalmodification;Review;1、引言Tau蛋白〔簡稱Tau〕，是一種介入神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的微管相關(guān)蛋白，其富集于神經(jīng)元軸突周圍，與微管蛋白結(jié)合構(gòu)成微管，可穩(wěn)定微管并促進軸突運輸[1]。Tau經(jīng)歷構(gòu)象改變、異常mRNA剪接等，從微管解離，經(jīng)系列翻譯后修飾(Post-translationalmodification,PTM)，本身構(gòu)成病理性聚集，進而造成神經(jīng)退行性病變，最終構(gòu)成Tau病[2,3]。在進行性核上性麻木、皮質(zhì)基底節(jié)變性、額顳癡呆等原發(fā)性Tau病，C型Niemann-Pick病、阿爾茲海默病(Alzheimerdisease,AD)等繼發(fā)性Tau病中均可檢測到Tau的異常修飾、含量變化及病理沉積[4,5]。華而不實，由Tau異常聚集構(gòu)成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(Neurofibrillarytangle,NFT)是AD的病理標志之一[6]。研究Tau的病理經(jīng)過，分析評估其PTM及定量檢測其濃度變化，對Tau病的早期診斷、跟蹤、預防和治療具有重要意義。當前，已有少量關(guān)于Tau的神經(jīng)成像技術(shù)的評述與報道。如Villemagne[7]等研究了示蹤劑的選擇，Hall等[8]研究了Tau與認知障礙的相關(guān)性，Hammes等[9]研究了Tau在神經(jīng)退行性疾病中的病理性聚集。但并沒有全面反映近年來針對Tau的病理經(jīng)過、分析檢測方式方法的最新研究進展?；赥au構(gòu)造的特殊性、PTM與聚集經(jīng)過的復雜性等，對Tau的分析方式方法的靈敏度、高效性提出了更高層次的要求。本文對Tau的常規(guī)分析方式方法進行了概述和比擬，重點闡述光學、電化學生物傳感方式方法的最新研究進展與應用，對其將來發(fā)展方向進行了瞻望。2、Tau的構(gòu)造與形態(tài)2.1、構(gòu)造Tau由位于17染色體長臂的基因編碼，含16個外顯子，長352~441個氨基酸，分子量為45~65kDa。Tau可分為N末端投射功能區(qū)(N端)、脯氨酸富集區(qū)、微管結(jié)合區(qū)(Microtubule-bindingdomain,MBD)和C末端功能區(qū)(C端)。華而不實，N端長度不確定，可插入由外顯子2(E2)、3(E3)控制的額外片段。脯氨酸富集區(qū)含大量磷酸化位點，而C端提供了部分磷酸化位點[10,11]。重復序列(R1-R4)位于MBD，其微管結(jié)合力最強并促進微管自聚集[12,13]，同時亦是雙螺旋細絲(Pairedhelicalfilament,PHF)的核心構(gòu)造。人類Tau因mRNA剪輯方式不同，表示出出6種同工異構(gòu)體，即Tau352、381、383、410、412和441，其差異在于C端能否存在3或4個重復序列，N端能否存在有1或2個插入物[12]。外顯子10(E10)編碼R2片段，能保存E10且具有四個重復序列的Tau統(tǒng)稱為4RTau；不保存E10且只要3個重復序列的Tau統(tǒng)稱為3RTau[14]。成年人腦內(nèi)3RTau、4RTau表示出量相當，而成年老鼠只表示出4RTau[15]。2.2、形態(tài)Tau單體構(gòu)造類似回形針，如此圖1A。其可經(jīng)歷構(gòu)象改變、異常mRNA剪接等，脫離微管致微管解聚并從惰性單體轉(zhuǎn)變?yōu)榭删奂姆N子形式〔病理性Tau〕。病理性Tau經(jīng)C端-MBD，N端-C端互相作用，折疊構(gòu)成Tau的低聚物[16]，如此圖1B。病理性Tau以朊病毒樣形式沿突觸在神經(jīng)元間傳播，構(gòu)成的低聚物經(jīng)系列PTM后進一步在神經(jīng)元中聚集構(gòu)成PHF[17]，如此圖1C。圖1(A)Tau單體[16];(B)Tau低聚物[16];(C)病理性Tau的傳播經(jīng)過[17]3、Tau的PTMTau的PTM種類包括磷酸化(Phosphorylation)、糖基化(Glycation)、硝化(Nitration)、泛素化(Ubiquitination)、乙酰化(Acetylation)、甲基化(Methylation)和脯氨酰異構(gòu)化(Prolyl-isomerization)等[18]。PTM可影響Tau的活性、構(gòu)造及與其它蛋白質(zhì)的互相作用。華而不實，磷酸化作為關(guān)鍵致病步驟遭到廣泛關(guān)注[19]。3.1、磷酸化磷酸化是在蛋白激酶(Proteinkinases,PK)作用下將ATP的磷酸基團轉(zhuǎn)移到Tau氨基酸殘基上，構(gòu)成磷酸化Tau(P-Tau)的經(jīng)過。PK包括脯氨酸定向PK、非脯氨酸定向PK和酪氨酸蛋白PK[20,21]。去磷酸化是經(jīng)蛋白磷酸酶(Proteinphosphatase,PP)去除P-Tau氨基酸殘基上的磷酸基團的經(jīng)過，PP主要包括PP1、PP2A、PP2B、PP2C、PP3和PP5[22]。華而不實，PP2A的去磷酸化效應最強，在AD患者腦中的表示出和活性均降低[23]。岡田酸(OA)可使PP1、PP2A失活引起氧化應激損傷，進而誘導P-Tau[24]。Tau含85個磷酸化位點，華而不實包括45個絲氨酸(Ser)、35個蘇氨酸(Thr)和5個酪氨酸(Tyr)殘基。部分磷酸化位點可以發(fā)生去磷酸化，但其發(fā)生反響所需PK、PP的種類與數(shù)量不同[25,26]。健康神經(jīng)元中，磷酸化與去磷酸化保持動態(tài)平衡。當PP、PK調(diào)控失衡，磷酸化水平提高至正常的2～3倍，即引起過度磷酸化[27]，可使Tau失去生物活性而不可溶、抗降解且易聚集，喪失穩(wěn)定微管的正常功能并干擾和分解細胞骨架，最終影響軸突運輸機制并促成突觸功能障礙和神經(jīng)變性[28,29]。除此之外，-淀粉樣蛋白(Amyloid-protein，A)、異常糖基化的誘導可以促成過度磷酸化[30,31]。3.2、其它PTM糖基化經(jīng)非酶促反響在氨基酸上修飾糖基，可使Tau降解受阻而發(fā)生聚集[32]。硝化經(jīng)硝基(-NO2)共價修飾Tyr殘基[33]，抑制Tau結(jié)合與穩(wěn)定微管的能力，使其更易聚集[34]。人體外硝化位點包括Tyr18、Tyr29、Tyr197和Tyr394，但Tyr29和Tyr197硝化更易引起Tau聚集[35]。泛素化是在系列酶的作用下將泛素修飾在C端MBD的賴氨酸(Lys)殘基上，其隨著PHF的增加而增加[36]。在AD患者PHF、腦脊液(Cerebrospinalfluid,CSF)中，泛素化Tau含量較高[37]。乙酰化是經(jīng)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶在Lys殘基修飾乙?；?，其可調(diào)節(jié)細胞功能和能量代謝并誘導P-Tau[38]。甲基化是通過在Lys和精氨酸殘基上引入甲基，可影響Tau與微管結(jié)合及Tau同工異構(gòu)體間的互相作用[39]。甲基化位點多分布于MBD，可促進磷酸化并與乙?；?、泛素化等存在競爭作用[40]。脯氨酰異構(gòu)化于Thr231重排二硫鍵，使Tau從順式構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榉词綐?gòu)象[41]。反式構(gòu)象的Tau不與微管結(jié)合，經(jīng)聚集構(gòu)成PHF[42]；肽基-脯氨酰順/反異構(gòu)酶可使其轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖綐?gòu)象，恢復與微管結(jié)合力并促進PP2A去磷酸化[43]。當前，磷酸化作為調(diào)控AD的關(guān)鍵步驟而遭到廣泛關(guān)注。正常情況下，磷酸化和去磷酸化分別負、正調(diào)控Tau與微管的親和力，且二者保持動態(tài)平衡[44]。病理情況下，Tau因過度磷酸化構(gòu)成P-Tau，其與微管結(jié)合力減小而脫離微管，致微管解聚、神經(jīng)元發(fā)生變性和死亡，最終誘導AD[45]；同時，易自我聚集的P-Tau在某些PTM影響下，經(jīng)歷形態(tài)改變、發(fā)生聚集并最終構(gòu)成NFT[20]，上述兩種途徑同時發(fā)生則進一步加快了AD的病理進程〔圖2〕。圖2Tau引起AD的病理進程4、Tau的常規(guī)分析方式方法Tau的常規(guī)分析方式方法主要包括神經(jīng)成像、免疫檢測和質(zhì)譜(Massspectrometry,MS)技術(shù)。華而不實，神經(jīng)成像技術(shù)可用于研究Tau的病理成像，免疫檢測方式方法用于血漿或CSF中Tau或P-Tau的分析，質(zhì)譜技術(shù)則主要用于研究Tau的PTM。4.1、神經(jīng)成像神經(jīng)成像泛指能夠直接或間接對腦部的功能、構(gòu)造和藥理學特性進行成像的技術(shù)，可捕捉腦部Tau的形態(tài)改變，利于臨床研究和診斷，包括正電子發(fā)射斷層掃描(Positronemissioncomputedtomography,PET)、單光子發(fā)射計算機化斷層顯像(Single-photonemissioncomputedtomography,SPECT)和磁共振成像(Magneticresonanceimaging,MRI)等。PET經(jīng)放射性示蹤劑標記抗體，對細胞外表抗原進行掃描顯像，為無創(chuàng)方式方法[46]。Tau與示蹤劑標記的抗體特異性結(jié)合后，經(jīng)PET顯示分布情況，示蹤劑保存的形貌與預期病理階段對應，且Tau的沉積形式與代謝減退之間存在密切關(guān)系[47]。當前，18F-AV-T807和18F-AV-1451是Tau常用的示蹤劑[48,49]，但因示蹤劑的半衰期較短(18F:110min)，使PET檢測Tau的應用受限[50]。SPECT是以單光子放射性核素標記藥物作為顯像劑，通過掃描病人體內(nèi)放射性標記藥物發(fā)射的射線的成像技術(shù)。苯基二芐基苯并噻唑〔PDB〕是常用藥物，小鼠的生物分布實驗表示清楚，PDB衍生物在大腦中呈持續(xù)放射性水平，當前尚不合適用于人體NFT成像[51]。MRI經(jīng)體外高頻磁場對靜磁場中的人體施加某特定頻率的射頻脈沖，激發(fā)人體內(nèi)水和脂肪的氫質(zhì)子而引起磁共振現(xiàn)象，并通過獲得的電磁信號重建人體信息。多參數(shù)MRI、高分辨率構(gòu)造MRI等對評估Tau病理改變意義重大[52,53]。4.2、免疫檢測方式方法免疫檢測基于抗原-抗體的特異性結(jié)合，包括酶聯(lián)免疫法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot,WB)、基于納米粒子的免疫聚合酶鏈式反響(Nanoparticles-immunopolymerasechainreaction,Nano-iPCR)和免疫磁減量(Immunomagneticreduction,IMR)等。ELISA是當前應用最廣泛的方式方法之一。Arai等[54]采用ELISA證明AD患者的CSF-Tau(〔95.6105.3〕pg/mL)顯著高于正常人((32.743.2)pg/mL)，靈敏度為93.8％，特異性為75％，提示可經(jīng)CSF-Tau預測AD。Kohnken等[55]利用夾心ELISA測定AD患者CSF-P-Tau的截斷值為10.1ng/ml，靈敏度為85％，特異性為97％，總體準確度為91％。與CSF-Tau相比，CSF-P-Tau因與AD進程高度相關(guān)更受關(guān)注。WB又稱免疫印跡，是將蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳分離后，通過抗原-抗體的特異性結(jié)合完成檢測。其操作簡單，可直接對抗體進行熒光標記，廣泛用于定量檢測Tau和P-Tau[56]。R?thlisberger等[57]采用WB獲得AD患者唾液中P-Tau和總Tau的比值(P-Tau/T-Tau)，與正常人相比(0.96)，75%的AD患者P-Tau/T-Tau可升高至1.00，該法靈敏度為73％，特異性為50％。唾液與血漿、CSF相比，因無創(chuàng)、易得等優(yōu)點廣受關(guān)注。但因敏感性和特異性缺乏，尚無法直接用于臨床測試。Nano-iPCR是經(jīng)納米粒子放大信號，結(jié)合免疫PCR檢測的技術(shù)。Stegurov[58]等采用Nano-iPCR定量檢測Tau，經(jīng)PCR板孔內(nèi)的抗體捕獲Tau構(gòu)成抗原-抗體復合物后，結(jié)合金納米粒子〔AuNPs〕標記的二抗，構(gòu)成雙抗夾心復合物，經(jīng)免疫PCR檢測。Tau的檢出限(Limitofdetection,LOD)為5pg/mL，線性范圍為10-10000pg/mL，回收率為89%~113%，明顯優(yōu)于ELISA的分析性能(LOD，140pg/mL；線性范圍，75-600pg/mL)。IMR是通過測量靶蛋白與磁性納米顆粒(MagneticNanoparticles,MNPs)結(jié)合導致檢測體系中分散的MNPs混合頻率降低的百分比來測定靶分子。Chiu等[59]應用標記MNPs的抗體捕獲Tau，隨著Tau含量增高，分散的MNPs構(gòu)成團簇，使檢測體系中分散的MNPs混合頻率降低，基于IMR信號值的變化定量檢測Tau。結(jié)果顯示，早期AD組血漿的Tau為〔53.911.7〕pg/mL，明顯高于健康老年組(〔15.66.9〕pg/mL)和輕度認知障礙組(〔33.25.4〕pg/mL)，提示經(jīng)測量血漿Tau可預測AD。4.3、質(zhì)譜技術(shù)MS技術(shù)具有靈敏度高、樣品用量少、可同時進行分離和鑒定等優(yōu)勢，多用于研究Tau的PTM。Min等[60]采用MS技術(shù)研究了Tau的乙酰化，證實其直接導致P-Tau積累并調(diào)節(jié)PP和PK活性；干擾乙酰化，可直接影響磷酸化進程。Thomas等[61]分析了Tau的甲基化和泛素化，證實甲基化Lys分布于N端和MBD，在Lys254位點與泛素化競爭底物，與乙?；?、磷酸化等PTM共同調(diào)節(jié)Tau的功能。研究表示清楚，小鼠和人的Tau序列具有高度類似性，如小鼠Tau430的序列與人類Tau441相比，有89％一樣、92％類似[15]。Morris等[62]經(jīng)研究野生型小鼠和人淀粉樣前體蛋白小鼠內(nèi)源性Tau430的PTM，證實兩種類型小鼠的Tau430具有類似的PTM，同一Lys位點存在乙酰化、泛素化和甲基化的競爭；發(fā)生磷酸化的位點多在MBD附近，且因MBD存在高密度的帶正電荷Lys殘基，更易發(fā)生乙?；图谆．斍?，MS被廣泛應用于研究Tau的PTM，但其維護成本高、操作復雜。當前，Tau的常規(guī)分析方式方法在安全性、靈敏度及檢測成本等方面仍存在一定的缺乏，開發(fā)愈加高效、經(jīng)濟、快速、準確的分析方式方法對Tau病的預防、干涉和治療具有重要意義。5、生物傳感方式方法當前，應用于Tau分析檢測研究的生物傳感方式方法主要包括光學和電化學生物傳感方式方法。5.1、光學生物傳感方式方法基于輸出的特征光學信號，檢測Tau的光學生物傳感方式方法包括外表等離子共振(Surfaceplasmonresonance,SPR)、局部外表等離子共振(Localizedsurfaceplasmonresonance,LSPR)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)和外表加強拉曼散射(Surface-enhancedramanscattering,SERS)等。SPR是金屬介質(zhì)外表的自由電子吸收入射光的能量后發(fā)生共振的現(xiàn)象。在目的分子結(jié)合金屬介質(zhì)外表吸附的生物分子后，引起折射率發(fā)生改變，進而造成共振光譜的移動，可據(jù)此實現(xiàn)對目的分子的定量檢測[63]。Lisi等[64]基于SPR平臺，采用抗體捕獲Tau，設(shè)計了直接檢測(A)、無標記三明治夾心(B)及標記三明治夾心(C)三種形式定量檢測Tau，如此圖3所示。檢測Tau的線性范圍分別為7~250、2~25和125~1000nmol/L，LOD分別為15、2和0.125nmol/L。圖3基于外表等離子體共振技術(shù)檢測Tau的三種形式：(A)直接檢測；(B)無標記三明治夾心法；(C)標記三明治夾心法適配體是經(jīng)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化〔SELEX〕技術(shù)挑選得到的人工合成的單鏈核酸序列，可直接與靶分子(金屬離子、蛋白質(zhì)、細胞和微生物等)結(jié)合，與抗體相比，其批次間差異小、穩(wěn)定性和特異性更佳[65]。Kim等基于SPR平臺聯(lián)用抗體-適配體檢測Tau381[66]及同時檢測Tau381與-1抗胰蛋白酶〔Antitrypsin,AAT〕[67]。如此圖4A和4B所示，在SPR傳感片外表固定適配體，捕獲靶標物并結(jié)合抗體，構(gòu)成類三明治復合物。該法檢測Tau381的LOD為10fmol/L，線性范圍為2~80pmol/L，并用于同時檢測人血漿樣品AAT和Tau，顯示了臨床應用的潛能。圖4基于抗體和適配體聯(lián)用的SPR平臺檢測Tau[66](A)和同時檢測AAT、Tau[67](B)的示意圖LSPR是電介質(zhì)包圍的金屬納米構(gòu)造中的自由電子在局部外表發(fā)生共振產(chǎn)生的光學現(xiàn)象，受金屬納米顆粒的種類、形狀以及大小的變化影響[68]。Vestergaard等[69]基于多點定位的LSPR芯片檢測Tau，LSPR芯片經(jīng)活化、固定Tau抗體并進一步捕獲Tau后，引起LSPR芯片外表厚度的增加，通過測定吸光度的變化實現(xiàn)測定。該法可檢測低至10pg/mL的CSF-Tau，低于臨床區(qū)分AD患者與正常人的CSF-Tau的臨界值(195pg/mL)。Kim等[70]基于LSPR平臺，利用不同類型的AuNPs偶聯(lián)抗體，同時完成多靶標的準確分離和鑒定。球形AuNPs(直徑50nm)、長寬比分別為1.6、3.6的短棒、長棒狀AuNPs偶聯(lián)抗體后，分別用于捕獲Tau、A1-40和A1-42，然后采用光譜儀檢測。結(jié)果顯示，Tau、A1-40和A1-42的LOD分別為23.6、34.9、26fmol/L，可在10~108fmol/L的濃度范圍對AD生物標志物進行同時快速檢測。因血漿中存在多種AD生物標志物(Tau、A1-40、A1-42)干擾Tau的檢測，Kim等[71]聯(lián)用長寬比為3.67的長棒桿AuNPs和鹽酸胍，提高靶向Tau的能力。鹽酸胍可毀壞Tau與其它蛋白質(zhì)分子間氫鍵、減弱疏水作用而減少其折疊和聚集，進而提高對Tau的捕獲量，該方式方法檢測Tau的LOD為1.56pmol/L，線性范圍103~108fmol/L。測定人血漿中Tau的含量的相對標準偏差(Relativestandarddeviation,RSD)為1.98%~3.60%，回收率為94.43%~102.27%。SERS與納米金屬材料聯(lián)用可加強拉曼信號并提高信噪比[72]。Zengin等[73]利用MNPs復合物固定的抗體捕獲Tau，與AuNPs標記的二抗結(jié)合、構(gòu)成三明治復合物后定量檢測Tau，如此圖5A所示。該法無需純化即可快速檢測Tau，LOD低至25fmol/L，線性范圍25fmol/L~500nmol/L。FRET是基于兩個分別作為能量供體與能量受體的熒光基團距離處于1.0~10.0nm之間時，供體的能量向受體轉(zhuǎn)移而引起的現(xiàn)象[74]。Kjaergaard等[75]利用FRET研究了Tau的聚集，如此圖5B所示，分別用FRET供體和受體標記等量Tau。Tau發(fā)生聚集時，供體和受體標記的Tau距離縮小，發(fā)生FRET，產(chǎn)生熒光響應信號。該方式方法測定Tau低聚物的LOD為4.25nmol/L，線性范圍37~104nmol/L。圖5(A)基于SERS平臺聯(lián)用MNPs和AuNPs檢測Tau的示意圖[73];(B)基于FRET平臺檢測Tau[75]因光學傳感具有靈敏度高、成本低、穩(wěn)定性好和抗電磁干擾能力強等優(yōu)點，針對Tau的光學傳感研究具有宏大發(fā)展?jié)撃堋?.2、電化學生物傳感方式方法電化學生物傳感方式方法[76]具有響應速度快、成本低、靈敏度高和易于微型化等特點，遭到廣泛關(guān)注。當前Tau的電化學生物傳感研究包括病理學監(jiān)測和定量檢測，常用的電化學檢測技術(shù)包括循環(huán)伏安法(Cyclicvoltammetry,CV)、電化學阻抗譜(Electrochemicalimpedancespectroscopy,EIS)、方波伏安法(Squarewavevoltammetry,SWV)和差分脈沖伏安法(Differentialpulsevoltammetry,DPV)等。5.2.1、Tau的病理學監(jiān)測〔1〕針對P-Tau的研究當前僅有少數(shù)對P-Tau的電化學研究報道，尚無直接檢測P-Tau的報道。如Martic等[77]研究了5--二茂鐵基三磷酸腺苷(Fc-ATP)與糖原合成激酶3-(GSK-3)、PKA、肉瘤相關(guān)激酶〔Src〕對P-Tau的催化作用，測定了其最大反響速度(Vmax)和在1/2Vmax的底物濃度(KM)。在金電極外表固定Tau，在Fc-ATP與PK的作用下發(fā)生磷酸化。Fc-ATP中負電荷的-磷酸基從ATP轉(zhuǎn)移到Ser、Thr或Tyr殘基引起電流密度改變，可用于檢測Fc-ATP濃度，線性范圍為5-200mol/L，LOD為2mol/L。濃度依靠性實驗結(jié)果顯示，GSK-3、Src和PKA的KM值分別為〔110.5〕、〔70.5〕和〔130.5〕mol/L，Vmax為〔〔0.010-0.025〕0.005〕A/(cm2min)。因不同PK作用的磷酸化位點存在差異，Rains等[78]進一步監(jiān)測了Fc-ATP與多種PK(Gsk-3、Src、Abl、Fyn和TTBK等)對P-Tau的催化作用，結(jié)果顯示,多種PK聯(lián)用后對P-Tau的催化作用大于單一PK，且PK的種類和磷酸化順序?qū)au膜的電化學特性影響不同。Jahnke等[79]基于人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)和微電極測量平臺研究了P-Tau。在環(huán)狀培養(yǎng)容器固定細胞后，施加溝通電壓并記錄Rct，結(jié)果顯示，SH-SY5Y經(jīng)OA處理后，在10h內(nèi)Rct降至28%19％，提示OA具有誘導P-Tau的作用；在OA處理前，將SH-SY5Y與Tau激酶抑制劑SRN預孵育1小時后，在前8h內(nèi)Rct無顯著變化，10h后降低至24%7％，表示清楚SRN對OA誘導P-Tau的阻礙作用。(2)Tau-蛋白質(zhì)互相作用為了監(jiān)測Tau之間的互相作用,分析其早期錯誤折疊，Esteves等[80]采用EIS監(jiān)測固定于Au電極上的Tau在Tau溶液中孵育前后的電化學阻抗信號變化。Tau-Tau互相作用時，帶正電的Tau與檢測液中的氧化復原探針Fe(CN)63-/4-發(fā)生靜電作用，使電荷轉(zhuǎn)移電阻(Rct)從〔2.90.6〕k降到〔0.30.61〕k，Tau溶液濃度在0.2~1.0mol/L時與Rct變化值呈線性關(guān)系，其濃度低至0.2mol/L時，仍可觀察到Tau-Tau互相作用。〔3〕Tau-金屬離子互相作用大腦中高濃度的金屬離子使Tau金屬化，因而廣受關(guān)注。在Cu2+與非磷酸化的Tau〔n-Tau〕和P-Tau互相作用的研究中[81]，將n-Tau和P-Tau分別置于不同pH、濃度的含Cu2+溶液中孵育，經(jīng)CV檢測，結(jié)果顯示，在中性pH(7.4)時，n-Tau和P-Tau與Cu2+的結(jié)合程度類似；pH過高或過低時，通過影響P-Tau構(gòu)造而阻礙其結(jié)合Cu2+。除此之外，Cu2+和Zn2+可競爭性結(jié)合P-Tau，P-Tau與Zn2+優(yōu)先結(jié)合構(gòu)成絡合物后，阻礙Cu2+與P-Tau結(jié)合。Ahmadi等[82]研究了Tau、P-Tau與Fe2+、Fe3+的互相作用。在金電極外表固定Tau，分別置于含F(xiàn)e2+和Fe3+的溶液中孵育。與Tau-Fe3+相比，在Tau-Fe2+中檢測到明顯降低的Rct和增大的電流密度，提示Fe2+更易結(jié)合Tau。經(jīng)圓二色光譜測量Tau的二級構(gòu)造(螺旋，225nm)變化的峰強度，在Fe2+中該峰強度在前3小時內(nèi)穩(wěn)定增長，在24小時后恢復到225nm；在Fe3+中該峰強度緩慢加強，在24小時后仍未恢復到225nm，證實Fe2+、Fe3+可引起Tau構(gòu)象改變，但Fe2+對Tau構(gòu)象的影響是迅速、可逆的，F(xiàn)e3+對Tau構(gòu)象的影響是緩慢、不可逆的。經(jīng)DPV測量P-Tau與Fe2+、Fe3+在不同PK作用下電流強度的變化顯示，Tyr位點顯著影響P-Tau、Fe2+互相作用，而Ser、Thr位點顯著影響P-Tau與Fe3+互相作用。5.2.2、Tau的定量檢測當前，電化學定量檢測Tau的研究報道較少。Derkus等[83]構(gòu)建了雙抗夾心型電化學生物傳感器同時檢測髓鞘堿性蛋白(Myelinbasicprotein,MBP)和Tau。絲網(wǎng)印刷碳電極經(jīng)氧化石墨烯和聚酰胺-胺樹枝狀大分子修飾后，固定MBP和Tau的抗體，二抗分別綴合CdS和PbS，經(jīng)DPV和EIS檢測Cd2+和Pb2+的電化學信號。MBP和Tau的LOD分別為0.30nmol/L和0.15nmol/l，線性范圍分別為0.50nmol/L~500nmol/L和0.25~250nmol/L。檢測人工CSF中MBP、Tau的回收率分別為96.3%~111.1％和99.1%~111.1％，顯示該傳感器具有較好的臨床應用潛能。Wang等[84]構(gòu)建了含四個金微帶電極的電化學生物傳感器檢測Tau，如此圖6A所示，包括一個工作電極〔WE〕、一個對電極〔CE〕和兩個參比電極〔RE〕。工作電極外表修飾自組裝單層膜并固定Tau抗體，Tau-抗體特異性結(jié)合引起電化學信號變化，實現(xiàn)Tau的檢測，方式方法的LOD為10-14mol/L，線性范圍是10-14~10-7mol/L，靈敏度明顯優(yōu)于ELISA，可檢測人血清中低至0.03pmol/L的Tau。結(jié)適宜配體的高親和力與AuNPs可放大信號的優(yōu)勢，Shui等[85]基于電化學生物傳感方式方法聯(lián)用抗體-適配體測定Tau，如此圖6B所示，金電極上固定的抗體捕獲Tau后，與半胱胺、AuNPs和適配體結(jié)合構(gòu)成復合物，進一步放大電化學信號。檢測Tau的LOD為0.42pmol/L，線性范圍為0.5~100pmol/L，人血清樣本中Tau的回收率為97.1%~102.0%，RSD為4.8%~5.75%，顯示其對復雜實際樣品良好的檢測效果。圖6(A)四電極電化學生物傳感器的構(gòu)成和檢測Tau工作原理[84];(B)聯(lián)用抗體-適配體的三明治夾心型電化學生物傳感器測定Tau的示意圖[85]6、結(jié)論與瞻望本文介紹了Tau的構(gòu)造與形態(tài)、主要的翻譯和修飾經(jīng)過以及常規(guī)分析方式方法，闡述了通過光學、電化學生物傳感方式方法檢測Tau的與最新研究與應用進展。因Tau構(gòu)造的特殊性、PTM與聚集經(jīng)過的復雜性，提高研究方式方法的靈敏度、選擇性以及多樣性仍然是當下研究重點。將來的研究將集中于應用新型納米材料提高靈敏度、開發(fā)新型辨別元件提高選擇性以及提高方式方法的實用性方面。因檢測Tau與P-Tau對Tau病早期診斷、跟蹤、預防和治療具有重要意義，拓展多樣性研究并進一步促進其實用性，將是將來研究的方向。TOC(TableofContents)：Tau蛋白是介入神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的微管相關(guān)蛋白，因構(gòu)象改變、異常mRNA剪接、翻譯后修飾等導致Tau病。本文基于Tau的構(gòu)造和形態(tài)，在介紹常規(guī)檢測方式方法的同時，重點關(guān)注光學、電化學生物傳感的研究現(xiàn)在狀況。Tau,asamicrotubule-relatedproteininvolvedinthedevelopmentofthenervoussystem,causingtaupathyafterundergoingaseriesofchanges.Forexample,conformationalchanges,abnormalmRNAsplicingandaseriesofpost-translationalmodifications.BasedonthestructureandmorphologyofTau,theconventionaldetectionmethodsofTauareintroducedinthisreview.Meanwhile,theresearchstatusbasedonopticalbiosensorandelectrochemicalbiosensorarefocusedemphatically.以下為參考文獻[1]IttnerLM,KeYD,DelerueF,BiM,GladbachA,vanEerselJ,WolfingH,ChiengBC,ChristieMJ,NapierA,EckertA,StaufenbielM,HardemanE,GotzJ.Cell,2018,142(3):387-397[2]SchollM,MaassA,MattssonN,AshtonNJ,BlennowK,ZetterbergH.Mol.Cell.Neurosci.,2022,97:18-33[3]RankovicM,ZweckstetterM.Neurosci.Biobehav.Rev.,2022,98:1-9[4]SahaP,SenN.AgeingRes.Rev.,2022,178:72-79[5]VillemagneVL,VelakoulisD,DoreV,BozinoskiS,MastersCL,RoweCC,WalterfangM.Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging.,2022,46(5):1132-1138[6]TakedaS.Neurosci.Res.,2022,141:36-42[7]VillemagneVL,FoderoMT,MastersCL,RoweCC.LancetNeurol.,2021:14:114-124[8]HallB,MakE,CervenkaS,AigbirhioFI,RoweJB,OBrienJT.AgeingRes.Rev.,2021:36:50-63[9]HammesJ,DrzezgaA,vanEimer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