神經(jīng)系統(tǒng)中Tau蛋白的常規(guī)分析方法綜述,SCI醫(yī)學(xué)論文

神經(jīng)系統(tǒng)中Tau蛋白的常規(guī)分析方法綜述,SCI醫(yī)學(xué)論文摘要：Tau蛋白〔簡稱Tau〕，是一種介入神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的微管相關(guān)蛋白。其可經(jīng)歷構(gòu)象改變、異常mRNA剪接等,從微管解離，經(jīng)系列翻譯后修飾(Post-translationalmodification,PTM)，本身構(gòu)成病理性聚集，進而造成神經(jīng)退行性病變，最終構(gòu)成Tau病。研究Tau的病理經(jīng)過，分析評估其PTM及定量檢測其濃度變化，對Tau病的早期診斷、跟蹤、預(yù)防和治療具有重要意義。本文對當(dāng)前國內(nèi)外Tau的常規(guī)分析方式方法進行了概述和比擬，重點闡述光學(xué)、電化學(xué)生物傳感方式方法的最新研究進展與相關(guān)應(yīng)用，對將來發(fā)展方向進行了瞻望，為Tau蛋白的深切進入研究與應(yīng)用提供參考。本文關(guān)鍵詞語：Tau蛋白;Tau病;生物傳感器;翻譯后修飾;評述;Abstract：Tauprotein,simplyreferredtoasTau,isatypeofmicrotubule-associatedproteininvolvedinthedevelopmentofthenervoussystem.Afterexperiencingconformationalchanges,abnormalmRNAsplicing,etc.Taudissociatesfrommicrotubulesandundergoesaseriesofpost-translationalmodification(PTM)toformpathologicalaggregation,whichinducesneurodegenerativediseasesandtauopathieseventually.NumerousclinicalstudiessuggestthatstudyingthepathologicalprocessofTauprotein,analyzingandevaluatingitsPTMandquantitativedetectionofconcentrationchangesareofgreatsignificancefortheearlydiagnosis,tracking,preventionandtreatmentoftauopathies.Inthispaper,theconventionalmethodsofTauproteinathomeandabroadweresummarizedandcompared.Specifically,therelatedapplicationsandlatestresearchprogressofopticalandelectrochemicalbiosensorsweremainlydescribed.Furthermore,thesummaryofitsfuturedirectionsandthepotentialapplicationswereproposed,whichprovidedreferenceforthefurtherresearchandapplication.Keyword：Tauprotein;Tauopathies;Biosensor;Post-translationalmodification;Review;1、引言Tau蛋白〔簡稱Tau〕，是一種介入神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的微管相關(guān)蛋白，其富集于神經(jīng)元軸突周圍，與微管蛋白結(jié)合構(gòu)成微管，可穩(wěn)定微管并促進軸突運輸[1]。Tau經(jīng)歷構(gòu)象改變、異常mRNA剪接等，從微管解離，經(jīng)系列翻譯后修飾(Post-translationalmodification,PTM)，本身構(gòu)成病理性聚集，進而造成神經(jīng)退行性病變，最終構(gòu)成Tau病[2,3]。在進行性核上性麻木、皮質(zhì)基底節(jié)變性、額顳癡呆等原發(fā)性Tau病，C型Niemann-Pick病、阿爾茲海默病(Alzheimerdisease,AD)等繼發(fā)性Tau病中均可檢測到Tau的異常修飾、含量變化及病理沉積[4,5]。華而不實，由Tau異常聚集構(gòu)成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(Neurofibrillarytangle,NFT)是AD的病理標(biāo)志之一[6]。研究Tau的病理經(jīng)過，分析評估其PTM及定量檢測其濃度變化，對Tau病的早期診斷、跟蹤、預(yù)防和治療具有重要意義。當(dāng)前，已有少量關(guān)于Tau的神經(jīng)成像技術(shù)的評述與報道。如Villemagne[7]等研究了示蹤劑的選擇，Hall等[8]研究了Tau與認知障礙的相關(guān)性，Hammes等[9]研究了Tau在神經(jīng)退行性疾病中的病理性聚集。但并沒有全面反映近年來針對Tau的病理經(jīng)過、分析檢測方式方法的最新研究進展。基于Tau構(gòu)造的特殊性、PTM與聚集經(jīng)過的復(fù)雜性等，對Tau的分析方式方法的靈敏度、高效性提出了更高層次的要求。本文對Tau的常規(guī)分析方式方法進行了概述和比擬，重點闡述光學(xué)、電化學(xué)生物傳感方式方法的最新研究進展與應(yīng)用，對其將來發(fā)展方向進行了瞻望。2、Tau的構(gòu)造與形態(tài)2.1、構(gòu)造Tau由位于17染色體長臂的基因編碼，含16個外顯子，長352~441個氨基酸，分子量為45~65kDa。Tau可分為N末端投射功能區(qū)(N端)、脯氨酸富集區(qū)、微管結(jié)合區(qū)(Microtubule-bindingdomain,MBD)和C末端功能區(qū)(C端)。華而不實，N端長度不確定，可插入由外顯子2(E2)、3(E3)控制的額外片段。脯氨酸富集區(qū)含大量磷酸化位點，而C端提供了部分磷酸化位點[10,11]。重復(fù)序列(R1-R4)位于MBD，其微管結(jié)合力最強并促進微管自聚集[12,13]，同時亦是雙螺旋細絲(Pairedhelicalfilament,PHF)的核心構(gòu)造。人類Tau因mRNA剪輯方式不同，表示出出6種同工異構(gòu)體，即Tau352、381、383、410、412和441，其差異在于C端能否存在3或4個重復(fù)序列，N端能否存在有1或2個插入物[12]。外顯子10(E10)編碼R2片段，能保存E10且具有四個重復(fù)序列的Tau統(tǒng)稱為4RTau；不保存E10且只要3個重復(fù)序列的Tau統(tǒng)稱為3RTau[14]。成年人腦內(nèi)3RTau、4RTau表示出量相當(dāng)，而成年老鼠只表示出4RTau[15]。2.2、形態(tài)Tau單體構(gòu)造類似回形針，如此圖1A。其可經(jīng)歷構(gòu)象改變、異常mRNA剪接等，脫離微管致微管解聚并從惰性單體轉(zhuǎn)變?yōu)榭删奂姆N子形式〔病理性Tau〕。病理性Tau經(jīng)C端-MBD，N端-C端互相作用，折疊構(gòu)成Tau的低聚物[16]，如此圖1B。病理性Tau以朊病毒樣形式沿突觸在神經(jīng)元間傳播，構(gòu)成的低聚物經(jīng)系列PTM后進一步在神經(jīng)元中聚集構(gòu)成PHF[17]，如此圖1C。圖1(A)Tau單體[16];(B)Tau低聚物[16];(C)病理性Tau的傳播經(jīng)過[17]3、Tau的PTMTau的PTM種類包括磷酸化(Phosphorylation)、糖基化(Glycation)、硝化(Nitration)、泛素化(Ubiquitination)、乙?；?Acetylation)、甲基化(Methylation)和脯氨酰異構(gòu)化(Prolyl-isomerization)等[18]。PTM可影響Tau的活性、構(gòu)造及與其它蛋白質(zhì)的互相作用。華而不實，磷酸化作為關(guān)鍵致病步驟遭到廣泛關(guān)注[19]。3.1、磷酸化磷酸化是在蛋白激酶(Proteinkinases,PK)作用下將ATP的磷酸基團轉(zhuǎn)移到Tau氨基酸殘基上，構(gòu)成磷酸化Tau(P-Tau)的經(jīng)過。PK包括脯氨酸定向PK、非脯氨酸定向PK和酪氨酸蛋白PK[20,21]。去磷酸化是經(jīng)蛋白磷酸酶(Proteinphosphatase,PP)去除P-Tau氨基酸殘基上的磷酸基團的經(jīng)過，PP主要包括PP1、PP2A、PP2B、PP2C、PP3和PP5[22]。華而不實，PP2A的去磷酸化效應(yīng)最強，在AD患者腦中的表示出和活性均降低[23]。岡田酸(OA)可使PP1、PP2A失活引起氧化應(yīng)激損傷，進而誘導(dǎo)P-Tau[24]。Tau含85個磷酸化位點，華而不實包括45個絲氨酸(Ser)、35個蘇氨酸(Thr)和5個酪氨酸(Tyr)殘基。部分磷酸化位點可以發(fā)生去磷酸化，但其發(fā)生反響所需PK、PP的種類與數(shù)量不同[25,26]。健康神經(jīng)元中，磷酸化與去磷酸化保持動態(tài)平衡。當(dāng)PP、PK調(diào)控失衡，磷酸化水平提高至正常的2～3倍，即引起過度磷酸化[27]，可使Tau失去生物活性而不可溶、抗降解且易聚集，喪失穩(wěn)定微管的正常功能并干擾和分解細胞骨架，最終影響軸突運輸機制并促成突觸功能障礙和神經(jīng)變性[28,29]。除此之外，-淀粉樣蛋白(Amyloid-protein，A)、異常糖基化的誘導(dǎo)可以促成過度磷酸化[30,31]。3.2、其它PTM糖基化經(jīng)非酶促反響在氨基酸上修飾糖基，可使Tau降解受阻而發(fā)生聚集[32]。硝化經(jīng)硝基(-NO2)共價修飾Tyr殘基[33]，抑制Tau結(jié)合與穩(wěn)定微管的能力，使其更易聚集[34]。人體外硝化位點包括Tyr18、Tyr29、Tyr197和Tyr394，但Tyr29和Tyr197硝化更易引起Tau聚集[35]。泛素化是在系列酶的作用下將泛素修飾在C端MBD的賴氨酸(Lys)殘基上，其隨著PHF的增加而增加[36]。在AD患者PHF、腦脊液(Cerebrospinalfluid,CSF)中，泛素化Tau含量較高[37]。乙?；墙?jīng)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶在Lys殘基修飾乙?；?，其可調(diào)節(jié)細胞功能和能量代謝并誘導(dǎo)P-Tau[38]。甲基化是通過在Lys和精氨酸殘基上引入甲基，可影響Tau與微管結(jié)合及Tau同工異構(gòu)體間的互相作用[39]。甲基化位點多分布于MBD，可促進磷酸化并與乙酰化、泛素化等存在競爭作用[40]。脯氨酰異構(gòu)化于Thr231重排二硫鍵，使Tau從順式構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榉词綐?gòu)象[41]。反式構(gòu)象的Tau不與微管結(jié)合，經(jīng)聚集構(gòu)成PHF[42]；肽基-脯氨酰順/反異構(gòu)酶可使其轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖綐?gòu)象，恢復(fù)與微管結(jié)合力并促進PP2A去磷酸化[43]。當(dāng)前，磷酸化作為調(diào)控AD的關(guān)鍵步驟而遭到廣泛關(guān)注。正常情況下，磷酸化和去磷酸化分別負、正調(diào)控Tau與微管的親和力，且二者保持動態(tài)平衡[44]。病理情況下，Tau因過度磷酸化構(gòu)成P-Tau，其與微管結(jié)合力減小而脫離微管，致微管解聚、神經(jīng)元發(fā)生變性和死亡，最終誘導(dǎo)AD[45]；同時，易自我聚集的P-Tau在某些PTM影響下，經(jīng)歷形態(tài)改變、發(fā)生聚集并最終構(gòu)成NFT[20]，上述兩種途徑同時發(fā)生則進一步加快了AD的病理進程〔圖2〕。圖2Tau引起AD的病理進程4、Tau的常規(guī)分析方式方法Tau的常規(guī)分析方式方法主要包括神經(jīng)成像、免疫檢測和質(zhì)譜(Massspectrometry,MS)技術(shù)。華而不實，神經(jīng)成像技術(shù)可用于研究Tau的病理成像，免疫檢測方式方法用于血漿或CSF中Tau或P-Tau的分析，質(zhì)譜技術(shù)則主要用于研究Tau的PTM。4.1、神經(jīng)成像神經(jīng)成像泛指能夠直接或間接對腦部的功能、構(gòu)造和藥理學(xué)特性進行成像的技術(shù)，可捕捉腦部Tau的形態(tài)改變，利于臨床研究和診斷，包括正電子發(fā)射斷層掃描(Positronemissioncomputedtomography,PET)、單光子發(fā)射計算機化斷層顯像(Single-photonemissioncomputedtomography,SPECT)和磁共振成像(Magneticresonanceimaging,MRI)等。PET經(jīng)放射性示蹤劑標(biāo)記抗體，對細胞外表抗原進行掃描顯像，為無創(chuàng)方式方法[46]。Tau與示蹤劑標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合后，經(jīng)PET顯示分布情況，示蹤劑保存的形貌與預(yù)期病理階段對應(yīng)，且Tau的沉積形式與代謝減退之間存在密切關(guān)系[47]。當(dāng)前，18F-AV-T807和18F-AV-1451是Tau常用的示蹤劑[48,49]，但因示蹤劑的半衰期較短(18F:110min)，使PET檢測Tau的應(yīng)用受限[50]。SPECT是以單光子放射性核素標(biāo)記藥物作為顯像劑，通過掃描病人體內(nèi)放射性標(biāo)記藥物發(fā)射的射線的成像技術(shù)。苯基二芐基苯并噻唑〔PDB〕是常用藥物，小鼠的生物分布實驗表示清楚，PDB衍生物在大腦中呈持續(xù)放射性水平，當(dāng)前尚不合適用于人體NFT成像[51]。MRI經(jīng)體外高頻磁場對靜磁場中的人體施加某特定頻率的射頻脈沖，激發(fā)人體內(nèi)水和脂肪的氫質(zhì)子而引起磁共振現(xiàn)象，并通過獲得的電磁信號重建人體信息。多參數(shù)MRI、高分辨率構(gòu)造MRI等對評估Tau病理改變意義重大[52,53]。4.2、免疫檢測方式方法免疫檢測基于抗原-抗體的特異性結(jié)合，包括酶聯(lián)免疫法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot,WB)、基于納米粒子的免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒错?Nanoparticles-immunopolymerasechainreaction,Nano-iPCR)和免疫磁減量(Immunomagneticreduction,IMR)等。ELISA是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的方式方法之一。Arai等[54]采用ELISA證明AD患者的CSF-Tau(〔95.6105.3〕pg/mL)顯著高于正常人((32.743.2)pg/mL)，靈敏度為93.8％，特異性為75％，提示可經(jīng)CSF-Tau預(yù)測AD。Kohnken等[55]利用夾心ELISA測定AD患者CSF-P-Tau的截斷值為10.1ng/ml，靈敏度為85％，特異性為97％，總體準(zhǔn)確度為91％。與CSF-Tau相比，CSF-P-Tau因與AD進程高度相關(guān)更受關(guān)注。WB又稱免疫印跡，是將蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳分離后，通過抗原-抗體的特異性結(jié)合完成檢測。其操作簡單，可直接對抗體進行熒光標(biāo)記，廣泛用于定量檢測Tau和P-Tau[56]。R?thlisberger等[57]采用WB獲得AD患者唾液中P-Tau和總Tau的比值(P-Tau/T-Tau)，與正常人相比(0.96)，75%的AD患者P-Tau/T-Tau可升高至1.00，該法靈敏度為73％，特異性為50％。唾液與血漿、CSF相比，因無創(chuàng)、易得等優(yōu)點廣受關(guān)注。但因敏感性和特異性缺乏，尚無法直接用于臨床測試。Nano-iPCR是經(jīng)納米粒子放大信號，結(jié)合免疫PCR檢測的技術(shù)。Stegurov[58]等采用Nano-iPCR定量檢測Tau，經(jīng)PCR板孔內(nèi)的抗體捕獲Tau構(gòu)成抗原-抗體復(fù)合物后，結(jié)合金納米粒子〔AuNPs〕標(biāo)記的二抗，構(gòu)成雙抗夾心復(fù)合物，經(jīng)免疫PCR檢測。Tau的檢出限(Limitofdetection,LOD)為5pg/mL，線性范圍為10-10000pg/mL，回收率為89%~113%，明顯優(yōu)于ELISA的分析性能(LOD，140pg/mL；線性范圍，75-600pg/mL)。IMR是通過測量靶蛋白與磁性納米顆粒(MagneticNanoparticles,MNPs)結(jié)合導(dǎo)致檢測體系中分散的MNPs混合頻率降低的百分比來測定靶分子。Chiu等[59]應(yīng)用標(biāo)記MNPs的抗體捕獲Tau，隨著Tau含量增高，分散的MNPs構(gòu)成團簇，使檢測體系中分散的MNPs混合頻率降低，基于IMR信號值的變化定量檢測Tau。結(jié)果顯示，早期AD組血漿的Tau為〔53.911.7〕pg/mL，明顯高于健康老年組(〔15.66.9〕pg/mL)和輕度認知障礙組(〔33.25.4〕pg/mL)，提示經(jīng)測量血漿Tau可預(yù)測AD。4.3、質(zhì)譜技術(shù)MS技術(shù)具有靈敏度高、樣品用量少、可同時進行分離和鑒定等優(yōu)勢，多用于研究Tau的PTM。Min等[60]采用MS技術(shù)研究了Tau的乙?；?，證實其直接導(dǎo)致P-Tau積累并調(diào)節(jié)PP和PK活性；干擾乙?；?，可直接影響磷酸化進程。Thomas等[61]分析了Tau的甲基化和泛素化，證實甲基化Lys分布于N端和MBD，在Lys254位點與泛素化競爭底物，與乙酰化、磷酸化等PTM共同調(diào)節(jié)Tau的功能。研究表示清楚，小鼠和人的Tau序列具有高度類似性，如小鼠Tau430的序列與人類Tau441相比，有89％一樣、92％類似[15]。Morris等[62]經(jīng)研究野生型小鼠和人淀粉樣前體蛋白小鼠內(nèi)源性Tau430的PTM，證實兩種類型小鼠的Tau430具有類似的PTM，同一Lys位點存在乙酰化、泛素化和甲基化的競爭；發(fā)生磷酸化的位點多在MBD附近，且因MBD存在高密度的帶正電荷Lys殘基，更易發(fā)生乙?；图谆?。當(dāng)前，MS被廣泛應(yīng)用于研究Tau的PTM，但其維護成本高、操作復(fù)雜。當(dāng)前，Tau的常規(guī)分析方式方法在安全性、靈敏度及檢測成本等方面仍存在一定的缺乏，開發(fā)愈加高效、經(jīng)濟、快速、準(zhǔn)確的分析方式方法對Tau病的預(yù)防、干涉和治療具有重要意義。5、生物傳感方式方法當(dāng)前，應(yīng)用于Tau分析檢測研究的生物傳感方式方法主要包括光學(xué)和電化學(xué)生物傳感方式方法。5.1、光學(xué)生物傳感方式方法基于輸出的特征光學(xué)信號，檢測Tau的光學(xué)生物傳感方式方法包括外表等離子共振(Surfaceplasmonresonance,SPR)、局部外表等離子共振(Localizedsurfaceplasmonresonance,LSPR)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)和外表加強拉曼散射(Surface-enhancedramanscattering,SERS)等。SPR是金屬介質(zhì)外表的自由電子吸收入射光的能量后發(fā)生共振的現(xiàn)象。在目的分子結(jié)合金屬介質(zhì)外表吸附的生物分子后，引起折射率發(fā)生改變，進而造成共振光譜的移動，可據(jù)此實現(xiàn)對目的分子的定量檢測[63]。Lisi等[64]基于SPR平臺，采用抗體捕獲Tau，設(shè)計了直接檢測(A)、無標(biāo)記三明治夾心(B)及標(biāo)記三明治夾心(C)三種形式定量檢測Tau，如此圖3所示。檢測Tau的線性范圍分別為7~250、2~25和125~1000nmol/L，LOD分別為15、2和0.125nmol/L。圖3基于外表等離子體共振技術(shù)檢測Tau的三種形式：(A)直接檢測；(B)無標(biāo)記三明治夾心法；(C)標(biāo)記三明治夾心法適配體是經(jīng)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化〔SELEX〕技術(shù)挑選得到的人工合成的單鏈核酸序列，可直接與靶分子(金屬離子、蛋白質(zhì)、細胞和微生物等)結(jié)合，與抗體相比，其批次間差異小、穩(wěn)定性和特異性更佳[65]。Kim等基于SPR平臺聯(lián)用抗體-適配體檢測Tau381[66]及同時檢測Tau381與-1抗胰蛋白酶〔Antitrypsin,AAT〕[67]。如此圖4A和4B所示，在SPR傳感片外表固定適配體，捕獲靶標(biāo)物并結(jié)合抗體，構(gòu)成類三明治復(fù)合物。該法檢測Tau381的LOD為10fmol/L，線性范圍為2~80pmol/L，并用于同時檢測人血漿樣品AAT和Tau，顯示了臨床應(yīng)用的潛能。圖4基于抗體和適配體聯(lián)用的SPR平臺檢測Tau[66](A)和同時檢測AAT、Tau[67](B)的示意圖LSPR是電介質(zhì)包圍的金屬納米構(gòu)造中的自由電子在局部外表發(fā)生共振產(chǎn)生的光學(xué)現(xiàn)象，受金屬納米顆粒的種類、形狀以及大小的變化影響[68]。Vestergaard等[69]基于多點定位的LSPR芯片檢測Tau，LSPR芯片經(jīng)活化、固定Tau抗體并進一步捕獲Tau后，引起LSPR芯片外表厚度的增加，通過測定吸光度的變化實現(xiàn)測定。該法可檢測低至10pg/mL的CSF-Tau，低于臨床區(qū)分AD患者與正常人的CSF-Tau的臨界值(195pg/mL)。Kim等[70]基于LSPR平臺，利用不同類型的AuNPs偶聯(lián)抗體，同時完成多靶標(biāo)的準(zhǔn)確分離和鑒定。球形AuNPs(直徑50nm)、長寬比分別為1.6、3.6的短棒、長棒狀A(yù)uNPs偶聯(lián)抗體后，分別用于捕獲Tau、A1-40和A1-42，然后采用光譜儀檢測。結(jié)果顯示，Tau、A1-40和A1-42的LOD分別為23.6、34.9、26fmol/L，可在10~108fmol/L的濃度范圍對AD生物標(biāo)志物進行同時快速檢測。因血漿中存在多種AD生物標(biāo)志物(Tau、A1-40、A1-42)干擾Tau的檢測，Kim等[71]聯(lián)用長寬比為3.67的長棒桿AuNPs和鹽酸胍，提高靶向Tau的能力。鹽酸胍可毀壞Tau與其它蛋白質(zhì)分子間氫鍵、減弱疏水作用而減少其折疊和聚集，進而提高對Tau的捕獲量，該方式方法檢測Tau的LOD為1.56pmol/L，線性范圍103~108fmol/L。測定人血漿中Tau的含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relativestandarddeviation,RSD)為1.98%~3.60%，回收率為94.43%~102.27%。SERS與納米金屬材料聯(lián)用可加強拉曼信號并提高信噪比[72]。Zengin等[73]利用MNPs復(fù)合物固定的抗體捕獲Tau，與AuNPs標(biāo)記的二抗結(jié)合、構(gòu)成三明治復(fù)合物后定量檢測Tau，如此圖5A所示。該法無需純化即可快速檢測Tau，LOD低至25fmol/L，線性范圍25fmol/L~500nmol/L。FRET是基于兩個分別作為能量供體與能量受體的熒光基團距離處于1.0~10.0nm之間時，供體的能量向受體轉(zhuǎn)移而引起的現(xiàn)象[74]。Kjaergaard等[75]利用FRET研究了Tau的聚集，如此圖5B所示，分別用FRET供體和受體標(biāo)記等量Tau。Tau發(fā)生聚集時，供體和受體標(biāo)記的Tau距離縮小，發(fā)生FRET，產(chǎn)生熒光響應(yīng)信號。該方式方法測定Tau低聚物的LOD為4.25nmol/L，線性范圍37~104nmol/L。圖5(A)基于SERS平臺聯(lián)用MNPs和AuNPs檢測Tau的示意圖[73];(B)基于FRET平臺檢測Tau[75]因光學(xué)傳感具有靈敏度高、成本低、穩(wěn)定性好和抗電磁干擾能力強等優(yōu)點，針對Tau的光學(xué)傳感研究具有宏大發(fā)展?jié)撃堋?.2、電化學(xué)生物傳感方式方法電化學(xué)生物傳感方式方法[76]具有響應(yīng)速度快、成本低、靈敏度高和易于微型化等特點，遭到廣泛關(guān)注。當(dāng)前Tau的電化學(xué)生物傳感研究包括病理學(xué)監(jiān)測和定量檢測，常用的電化學(xué)檢測技術(shù)包括循環(huán)伏安法(Cyclicvoltammetry,CV)、電化學(xué)阻抗譜(Electrochemicalimpedancespectroscopy,EIS)、方波伏安法(Squarewavevoltammetry,SWV)和差分脈沖伏安法(Differentialpulsevoltammetry,DPV)等。5.2.1、Tau的病理學(xué)監(jiān)測〔1〕針對P-Tau的研究當(dāng)前僅有少數(shù)對P-Tau的電化學(xué)研究報道，尚無直接檢測P-Tau的報道。如Martic等[77]研究了5--二茂鐵基三磷酸腺苷(Fc-ATP)與糖原合成激酶3-(GSK-3)、PKA、肉瘤相關(guān)激酶〔Src〕對P-Tau的催化作用，測定了其最大反響速度(Vmax)和在1/2Vmax的底物濃度(KM)。在金電極外表固定Tau，在Fc-ATP與PK的作用下發(fā)生磷酸化。Fc-ATP中負電荷的-磷酸基從ATP轉(zhuǎn)移到Ser、Thr或Tyr殘基引起電流密度改變，可用于檢測Fc-ATP濃度，線性范圍為5-200mol/L，LOD為2mol/L。濃度依靠性實驗結(jié)果顯示，GSK-3、Src和PKA的KM值分別為〔110.5〕、〔70.5〕和〔130.5〕mol/L，Vmax為〔〔0.010-0.025〕0.005〕A/(cm2min)。因不同PK作用的磷酸化位點存在差異，Rains等[78]進一步監(jiān)測了Fc-ATP與多種PK(Gsk-3、Src、Abl、Fyn和TTBK等)對P-Tau的催化作用，結(jié)果顯示,多種PK聯(lián)用后對P-Tau的催化作用大于單一PK，且PK的種類和磷酸化順序?qū)au膜的電化學(xué)特性影響不同。Jahnke等[79]基于人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)和微電極測量平臺研究了P-Tau。在環(huán)狀培養(yǎng)容器固定細胞后，施加溝通電壓并記錄Rct，結(jié)果顯示，SH-SY5Y經(jīng)OA處理后，在10h內(nèi)Rct降至28%19％，提示OA具有誘導(dǎo)P-Tau的作用；在OA處理前，將SH-SY5Y與Tau激酶抑制劑SRN預(yù)孵育1小時后，在前8h內(nèi)Rct無顯著變化，10h后降低至24%7％，表示清楚SRN對OA誘導(dǎo)P-Tau的阻礙作用。(2)Tau-蛋白質(zhì)互相作用為了監(jiān)測Tau之間的互相作用,分析其早期錯誤折疊，Esteves等[80]采用EIS監(jiān)測固定于Au電極上的Tau在Tau溶液中孵育前后的電化學(xué)阻抗信號變化。Tau-Tau互相作用時，帶正電的Tau與檢測液中的氧化復(fù)原探針Fe(CN)63-/4-發(fā)生靜電作用，使電荷轉(zhuǎn)移電阻(Rct)從〔2.90.6〕k降到〔0.30.61〕k，Tau溶液濃度在0.2~1.0mol/L時與Rct變化值呈線性關(guān)系，其濃度低至0.2mol/L時，仍可觀察到Tau-Tau互相作用?！?〕Tau-金屬離子互相作用大腦中高濃度的金屬離子使Tau金屬化，因而廣受關(guān)注。在Cu2+與非磷酸化的Tau〔n-Tau〕和P-Tau互相作用的研究中[81]，將n-Tau和P-Tau分別置于不同pH、濃度的含Cu2+溶液中孵育，經(jīng)CV檢測，結(jié)果顯示，在中性pH(7.4)時，n-Tau和P-Tau與Cu2+的結(jié)合程度類似；pH過高或過低時，通過影響P-Tau構(gòu)造而阻礙其結(jié)合Cu2+。除此之外，Cu2+和Zn2+可競爭性結(jié)合P-Tau，P-Tau與Zn2+優(yōu)先結(jié)合構(gòu)成絡(luò)合物后，阻礙Cu2+與P-Tau結(jié)合。Ahmadi等[82]研究了Tau、P-Tau與Fe2+、Fe3+的互相作用。在金電極外表固定Tau，分別置于含F(xiàn)e2+和Fe3+的溶液中孵育。與Tau-Fe3+相比，在Tau-Fe2+中檢測到明顯降低的Rct和增大的電流密度，提示Fe2+更易結(jié)合Tau。經(jīng)圓二色光譜測量Tau的二級構(gòu)造(螺旋，225nm)變化的峰強度，在Fe2+中該峰強度在前3小時內(nèi)穩(wěn)定增長，在24小時后恢復(fù)到225nm；在Fe3+中該峰強度緩慢加強，在24小時后仍未恢復(fù)到225nm，證實Fe2+、Fe3+可引起Tau構(gòu)象改變，但Fe2+對Tau構(gòu)象的影響是迅速、可逆的，F(xiàn)e3+對Tau構(gòu)象的影響是緩慢、不可逆的。經(jīng)DPV測量P-Tau與Fe2+、Fe3+在不同PK作用下電流強度的變化顯示，Tyr位點顯著影響P-Tau、Fe2+互相作用，而Ser、Thr位點顯著影響P-Tau與Fe3+互相作用。5.2.2、Tau的定量檢測當(dāng)前，電化學(xué)定量檢測Tau的研究報道較少。Derkus等[83]構(gòu)建了雙抗夾心型電化學(xué)生物傳感器同時檢測髓鞘堿性蛋白(Myelinbasicprotein,MBP)和Tau。絲網(wǎng)印刷碳電極經(jīng)氧化石墨烯和聚酰胺-胺樹枝狀大分子修飾后，固定MBP和Tau的抗體，二抗分別綴合CdS和PbS，經(jīng)DPV和EIS檢測Cd2+和Pb2+的電化學(xué)信號。MBP和Tau的LOD分別為0.30nmol/L和0.15nmol/l，線性范圍分別為0.50nmol/L~500nmol/L和0.25~250nmol/L。檢測人工CSF中MBP、Tau的回收率分別為96.3%~111.1％和99.1%~111.1％，顯示該傳感器具有較好的臨床應(yīng)用潛能。Wang等[84]構(gòu)建了含四個金微帶電極的電化學(xué)生物傳感器檢測Tau，如此圖6A所示，包括一個工作電極〔WE〕、一個對電極〔CE〕和兩個參比電極〔RE〕。工作電極外表修飾自組裝單層膜并固定Tau抗體，Tau-抗體特異性結(jié)合引起電化學(xué)信號變化，實現(xiàn)Tau的檢測，方式方法的LOD為10-14mol/L，線性范圍是10-14~10-7mol/L，靈敏度明顯優(yōu)于ELISA，可檢測人血清中低至0.03pmol/L的Tau。結(jié)適宜配體的高親和力與AuNPs可放大信號的優(yōu)勢，Shui等[85]基于電化學(xué)生物傳感方式方法聯(lián)用抗體-適配體測定Tau，如此圖6B所示，金電極上固定的抗體捕獲Tau后，與半胱胺、AuNPs和適配體結(jié)合構(gòu)成復(fù)合物，進一步放大電化學(xué)信號。檢測Tau的LOD為0.42pmol/L，線性范圍為0.5~100pmol/L，人血清樣本中Tau的回收率為97.1%~102.0%，RSD為4.8%~5.75%，顯示其對復(fù)雜實際樣品良好的檢測效果。圖6(A)四電極電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)成和檢測Tau工作原理[84];(B)聯(lián)用抗體-適配體的三明治夾心型電化學(xué)生物傳感器測定Tau的示意圖[85]6、結(jié)論與瞻望本文介紹了Tau的構(gòu)造與形態(tài)、主要的翻譯和修飾經(jīng)過以及常規(guī)分析方式方法，闡述了通過光學(xué)、電化學(xué)生物傳感方式方法檢測Tau的與最新研究與應(yīng)用進展。因Tau構(gòu)造的特殊性、PTM與聚集經(jīng)過的復(fù)雜性，提高研究方式方法的靈敏度、選擇性以及多樣性仍然是當(dāng)下研究重點。將來的研究將集中于應(yīng)用新型納米材料提高靈敏度、開發(fā)新型辨別元件提高選擇性以及提高方式方法的實用性方面。因檢測Tau與P-Tau對Tau病早期診斷、跟蹤、預(yù)防和治療具有重要意義，拓展多樣性研究并進一步促進其實用性，將是將來研究的方向。TOC(TableofContents)：Tau蛋白是介入神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的微管相關(guān)蛋白，因構(gòu)象改變、異常mRNA剪接、翻譯后修飾等導(dǎo)致Tau病。本文基于Tau的構(gòu)造和形態(tài)，在介紹常規(guī)檢測方式方法的同時，重點關(guān)注光學(xué)、電化學(xué)生物傳感的研究現(xiàn)在狀況。Tau,asamicrotubule-relatedproteininvolvedinthedevelopmentofthenervoussystem,causingtaupathyafterundergoingaseriesofchanges.Forexample,conformationalchanges,abnormalmRNAsplicingandaseriesofpost-translationalmodifications.BasedonthestructureandmorphologyofTau,theconventionaldetectionmethodsofTauareintroducedinthisreview.Meanwhile,theresearchstatusbasedonopticalbiosensorandelectrochemicalbiosensorarefocusedemphatically.以下為參考文獻[1]IttnerLM,KeYD,DelerueF,BiM,GladbachA,vanEerselJ,WolfingH,ChiengBC,ChristieMJ,NapierA,EckertA,StaufenbielM,HardemanE,GotzJ.Cell,2018,142(3):387-397[2]SchollM,MaassA,MattssonN,AshtonNJ,BlennowK,ZetterbergH.Mol.Cell.Neurosci.,2022,97:18-33[3]RankovicM,ZweckstetterM.Neurosci.Biobehav.Rev.,2022,98:1-9[4]SahaP,SenN.AgeingRes.Rev.,2022,178:72-79[5]VillemagneVL,VelakoulisD,DoreV,BozinoskiS,MastersCL,RoweCC,WalterfangM.Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging.,2022,46(5):1132-1138[6]TakedaS.Neurosci.Res.,2022,141:36-42[7]VillemagneVL,FoderoMT,MastersCL,RoweCC.LancetNeurol.,2021:14:114-124[8]HallB,MakE,CervenkaS,AigbirhioFI,RoweJB,OBrienJT.AgeingRes.Rev.,2021:36:50-63[9]HammesJ,DrzezgaA,vanEimerenT.Curr.Neurol.Neurosci.Rep.,2021,18(12):86[10]BakotaL,UssifA,JeserichG,BrandtR.Mol.Cell.Neurosci.,2021,84:132-141[11]CombsB,HamelC,KanaanNM.Neurobiol.Dis.,2021,94:18-31[12]GuoT,NobleW,HangerDP.ActaNeuropathol.,2021,133(5):665-704[13]TochioN,MurataT,Utsunomiya-TateN.Biochem.Biophys.Res.Commun.,2022,508(1):184-190[14]EspindolaSL,DamianichA,AlvarezRJ,SartorM,BelforteJE,FerrarioJE.CellRep.,2021,23(3):709-715[15]SealeyMA,VourkouE,CowanCM,BossingT,QuraisheS,GrammenoudiS.Neurobiol.Dis.,2021,105:74-83[16]HimmelsteinDS,WardSM,LanciaJK,PattersonKR,BinderLI.Pharmacol.Ther.,2020,136(1):8-22[17]ChuD,LiuF.ACSChem.Neurosci.,2022,10(2),931-944[18]DomiseM,DidierS,MarinangeliC,ZhaoH,ChandakkarP,BueeL,ViolletB,DaviesP,MarambaudP,VingtdeuxV.Sci.Rep.,2021:6:26758[19]BaasPW,QiangL.TrendsCellBiol.,2022,29(6):452-461[20]MartinL,LatypovaX,TerroF.Neurochem.Int.,2018,58(4):458-471[21]VanderHargJM,EggelsL,BangelFN,RuigrokSR,ZwartR,HoozemansJJM.Neurobiol.Dis.,2021,103:163-173[22]VirshupDM,ShenolikarS.Mol.Cell.Biochem.,2018,33(5):537-545[23]MartinL,LatypovaX,WilsonCM,MagnaudeixA,PerrinML,Terro,F.AgeingRes.Rev.,2020,12(1):39-49[24]VirshupDM,ShenolikarS.Mol.Cell.,2018,33(5):537-545[25]HangerDP,ByersHL,WrayS,LeungKY,SaxtonMJ,SeereeramA.J.Biol.Chem.,2007,282(32):23645-23654[26]NobleW,OlmV,TakataK,CaseyE,MaryO,MeyersonJ.Neuron,2003,38(4):555-565[27]LassenPS,ThygesenC,LarsenMR,KempfSJ.J.Proteomics,2021,161:11-25[28]OnoK.Neurochem.Int.,2021,119:57-70[29]BueeL,BussiereT,Buee-ScherrerV,DelacourteA,HofPR.BrainRes.Rev.,2000,33(1):95-130[30]LloretA,FuchsbergerT,GiraldoE,VinaJ.FreeRadicalBiol.Med.,2021,83:186-191[31]SatoY,NaitoY,Grundke-IqbalI,IqbalK,EndoT.FEBSLett.,2001,496(2-3):52-60[32]NeculaM,KuretJ.J.Biol.Chem.,2004,279(48):49694-49703[33]IschiropoulosH.Biochem.Biophys.Res.Commun.,2003,305(3):776-783[34]ReyesJF,FuY,VanaL,KanaanNM,BinderLI.Am.J.Pathol.,2018,178(5):2275-2285[35]ReynoldsMR,ReyesJF,FuY,BigioEH,Guillozet-BongaartsAL,BerryRW.J.Neurosci.,2006,26(42):10636-10645[36]CrippsD,ThomasSN,JengY,YangF,DaviesP,Yang,AJ.J.Biol.Chem.,2006,281(16):10825-10838[37]IqbalK,Grundke-IqbalI.Mol.Neurobiol.,1991,5(2-4):399-410[38]MinSW,ChoSH,ZhouY,SchroederS,HaroutunianV,SeeleyWW.Neuron,2018,67(6):953-966[39]FunkKE,ThomasSN,SchaferKN,CooperGL,LiaoZP,ClarkDJ.Biochem.J.,2020,462:77-88[40]Tapia-RojasC,Cabezas-OpazoF,DeatonCA,VergaraEH,JohnsonGVW,QuintanillaRA.Prog.Neurobiol.,2022,175:54-76[41]BulbarelliA,LonatiE,CazzanigaE,GregoriM,MasseriniM.Mol.Cell.Neurosci.,2018,42(1):75-80[42]ZhouXZ,KopsO,WernerA,LuPJ,ShenM,StollerG.Mol.Cell.,2000,6(4):873-883[43]LavoieSB,AlbertAL,VincentM.MS-Med.Sci.,2003,19(12):1251-1258[44]PekelesH,QureshiHY,PaudelHK,SchipperHM,GornistkyM,ChertkowH.AlzheimersDementia,2022,11:53-60[45]LassenPS,ThygesenC,LarsenMR,KempfSJ.J.Proteomics,2021,161:11-25[46]JonassonM,WallA,ChiotisK,LeuzyA,ErikssonJ,AntoniG,NordbergefA.NeuroImageClin.,2022,22(10):1016-1031[47]ChoH,ChoiJY,HwangMS,LeeJH,KimYJ,LeeHM.Neurology,2021,87(4):375-383[48]ChienDT,BahriS,SzardeningsAK,WalshJC,MuF,SuMY.J.AlzheimersDis.,2020,34(2):457-468[49]BejaninA,SchonhautDR,LaJoieR,KramerJH,BakerSL,SosaN.Brain,2021,140(12):3286-3300[50]ArtunO.Radiat.Phys.Chem.,2021,149:73-83[51]BenadibaM,LuurtsemaG,Wichert-AnaL,BuchpigelCA,FilhoGB.Rev.Bras.Psiquiatr.,2020,34:125-148[52]WellsJA,OCallaghanJM,HolmesHE,PowellNM,JohnsonRA,SiowB.NeuroImage,2021,111:369-378[53]HampelH,BlennowK,ShawLM,HoesslerYC,ZetterbergH,TrojanowskiJ.Exp.Gerontol,2018,45(1),30-40[54]AraiH,TerajimaM,MiuraM,HiguchiS,MuramatsuT,MachidaN.Ann.Neurol.,1995,38(4),649-652[55]KohnkenR,BuergerK,ZinkowskiR,MillerC,KerkmanD,DeBernardisJ.Neurosci.Lett.,2000,287(3):187-190[56]CohenL,WaltDR.Chem.Rev.,2022,119(1):293-321[57]R?thlisbergerP,HollensteinM.Adv.DrugDeliveryRev.,2021:134:3-21[58]StegurovL,DrberovE,BartosA,DrberP,?povD,DrberP.J.Immunol.Methods,2020,406:137-142[59]ChiuMJ,ChenYF,ChenTF,YangSY,YangFPG,TsengTW.Hum.BrainMapp.,2020,35(7):3132-3142[60]MinSW,ChoSH,ZhouY,SchroederS,HaroutunianV,SeeleyWW.Neuron,2018,67(6):953-966[61]ThomasSN,FunkKE,WanY,LiaoZ,DaviesP,KuretJ.ActaNeuropathol.,2020,123(1):105-117[62]MorrisM,KnudsenGM,MaedaS,TrinidadJC,IoanoviciuA,BurlingameAL.Nat.Neurosci.,