基因工程制藥一

一、概述生物技術(shù)的核心就是基因工程，基因工程技術(shù)最成功的應(yīng)用就是用于生物治療的新型生物藥物的研制。傳統(tǒng)生物藥物由于來(lái)源及制備上的困難、價(jià)格等因素的影響，此外在制備過(guò)程可能受到的病毒、衣原體、支原體等的感染等問(wèn)題，促使人們尋求安全、實(shí)用、療效可靠的新方法來(lái)制備生物藥物。1第二章基因工程制藥

應(yīng)用基因工程技術(shù)可十分方便且有效地解決上述提到的問(wèn)題，從量、質(zhì)上都可以得到改進(jìn)，且可以創(chuàng)造全新物質(zhì)。癌癥、病毒性疾病、心血管疾病以及內(nèi)分泌等方面的預(yù)防、治療和診斷已可通過(guò)基因工程技術(shù)獲得。2第二章基因工程制藥利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的藥物

包括醫(yī)用活性蛋白和多肽：免疫性蛋白，各種抗原和單克隆抗體；細(xì)胞因子，干擾素、白介素、生長(zhǎng)因子；激素:胰島素、生長(zhǎng)激素；酶類(lèi):尿激酶、鏈激酶、蚓激酶、超氧化物歧化酶。

3第二章基因工程制藥利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥物的優(yōu)點(diǎn)

可以大量生產(chǎn)過(guò)去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（如胰島素、干擾素、細(xì)胞因子等），為臨床使用提供有效的保障；可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對(duì)其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍；利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；4第二章基因工程制藥利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥物的優(yōu)點(diǎn)內(nèi)源生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時(shí)存在的不足之處，可通過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去除；

如白細(xì)胞介素-2的第125位半胱氨酸是游離的，有可能引起-S-S-鍵的錯(cuò)配而導(dǎo)致活性下降，如將此半胱氨酸改為絲氨酸或丙氨酸，白細(xì)胞介素-2的活性以及熱穩(wěn)定性均有提高；可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來(lái)源。5第二章基因工程制藥二、基因工程藥物生產(chǎn)的基本過(guò)程

基因工程技術(shù)就是將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌，實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。6第二章基因工程制藥基因工程藥物制造的主要程序

獲得目的基因組建重組質(zhì)粒構(gòu)建基因工程菌或細(xì)胞培養(yǎng)工程菌產(chǎn)物分離純化除菌過(guò)濾半成品檢驗(yàn)成品檢驗(yàn)原料包裝7第二章基因工程制藥8第二章基因工程制藥基因工程藥物生產(chǎn)的上游和

下游技術(shù)上游技術(shù)：主要指的是目的基因分離、工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建。上游階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成；下游技術(shù)：主要指的是從工程菌（或細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量控制等。9第二章基因工程制藥三、目的基因的獲得

對(duì)于原核生物，其基因總量不大，可以選用合適的限制性核酸內(nèi)切酶切下目的基因。對(duì)于真核生物不能進(jìn)行直接分離。真核細(xì)胞中基因總量較大，從染色體中直接分離純化目的基因極為困難。另外，真核基因一般都有內(nèi)含子，如果以原核細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，即使分離出真核基因，由于原核細(xì)胞缺乏mRNA轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)，真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA也不能被加工、拼接成為成熟的mRNA，因此不能直接克隆真核基因。10第二章基因工程制藥克隆真核基因的方法

逆轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法11第二章基因工程制藥什么是逆轉(zhuǎn)錄法先分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)cDNA，然后進(jìn)行互補(bǔ)cDNA

的克隆表達(dá)。從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞中提取mRNA，以其為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成該蛋白質(zhì)mRNA的互補(bǔ)DNA(complementaryDNA)，再以互補(bǔ)DNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶作用下，最終合成編碼該蛋白質(zhì)的雙鏈DNA序列。該序列不含內(nèi)含子。12第二章基因工程制藥逆轉(zhuǎn)錄法的步驟mRNA的純化cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成cDNA克隆將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞cDNA文庫(kù)的鑒定目的cDNA克隆的分離和鑒定13第二章基因工程制藥mRNA的純化

細(xì)胞內(nèi)含有三種RNA，mRNA占RNA總量的2%-5%，相對(duì)分子量大小不一致，分離也有很大的困難。但是mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸（polyA）組成的末端，長(zhǎng)達(dá)20-250個(gè)腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸（Oligo

dT）-纖維素上，從而可以用親和層析法將mRNA從細(xì)胞總RNA上分離出來(lái)，可得到純度較高的mRNA。mRNA(messengerRNA)，信使RNArRNA(（ribosomalRNA），核糖體RNA，tRNA(（tranferRNA），轉(zhuǎn)移tRNA）、

14第二章基因工程制藥mRNA的純化用高濃度鹽溶液使mRNA特異結(jié)合于寡聚dT。再以低鹽溶液和蒸餾水將其洗脫，經(jīng)過(guò)兩次寡聚dT，可得到較純的mRNA。15第二章基因工程制藥cDNA第一鏈的合成一般mRNA都帶有3‘-polyA，所以可用寡聚dT作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開(kāi)始cDNA鏈的合成。在合成反應(yīng)體系中加入一種放射性標(biāo)記的dNTP，在反應(yīng)中以及反應(yīng)后可通過(guò)測(cè)定放射性標(biāo)記的dNTP摻入量，計(jì)算出cDNA的合成效率。16第二章基因工程制藥cDNA第一鏈的合成在凝膠電泳后，進(jìn)行放射自顯影分析產(chǎn)物的分子大小，探索最佳反應(yīng)條件。一次好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可使寡聚dT選出的mRNA有5%~30%被拷貝。17第二章基因工程制藥cDNA第二鏈的合成先用堿解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈，然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。由于第一鏈cDNA鏈3‘末端往往形成一個(gè)發(fā)夾形結(jié)構(gòu)，所以，可以從這一點(diǎn)開(kāi)始合成cDNA第二鏈。核糖核酸酶H(RNaseH)是一種核糖核酸內(nèi)切酶，它能夠特異性地水解雜交DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈。該酶不能消化單鏈或雙鏈DNA。18第二章基因工程制藥cDNA第二鏈的合成此反應(yīng)是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1專(zhuān)一性切除單鏈DNA，因此用它可以切除發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)切除后，雙鏈cDNA分子的大小常用變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測(cè)定。19第二章基因工程制藥cDNA克隆用于cDNA克隆的載體有兩類(lèi)：質(zhì)粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌體DNA（如gt10、gt11等）。根據(jù)重組后插入的cDNA是否能夠表達(dá)、能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)，又將載體分為表達(dá)型和非表達(dá)型載體。pUC及gt11為表達(dá)型載體，在cDNA插入位置的上游具有啟動(dòng)基因順序；而pBR322及gt10為非表達(dá)型載體。20第二章基因工程制藥cDNA克隆在cDNA克隆操作中應(yīng)該根據(jù)不同的需要選擇適當(dāng)?shù)妮d體。cDNA插入片段小于10kb，可選質(zhì)粒載體，如大于10kb則應(yīng)選用噬菌體DNA為載體。選用表達(dá)型載體可以增加目的基因的篩選方法，有利于目的基因的篩選。21第二章基因工程制藥將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞體外包裝的噬菌體，感染感受態(tài)大腸桿菌形成噬菌斑?；蜣D(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌使質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。22第二章基因工程制藥cDNA文庫(kù)的鑒定根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑顏色改變法。然后采用凝膠電泳、分子雜交、DNA序列分析測(cè)定等方法進(jìn)行進(jìn)一步篩選和鑒定。23第二章基因工程制藥目的cDNA克隆的分離和鑒定

從cDNA文庫(kù)中分離特異的cDNA克隆主要采用：核酸探針雜交法：用層析和高分辨電泳等技術(shù)純化微克量的目的蛋白質(zhì)。根據(jù)目的蛋白質(zhì)純品的氨基酸序列分析結(jié)果，人工合成相應(yīng)的單鏈寡核苷酸作為探針，從cDNA文庫(kù)中分離特異cDNA克隆。24第二章基因工程制藥目的cDNA克隆的分離和鑒定免疫反應(yīng)鑒定法：在既無(wú)可供選擇的基因表型特征，又無(wú)合適探針的情況下，本法是重要途徑。用表達(dá)型載體構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，可用免疫學(xué)方法分組逐一鑒定各cDNA的表達(dá)產(chǎn)物，即以某種蛋白質(zhì)的抗體尋找相應(yīng)的特異cDNA克隆。25第二章基因工程制藥目的cDNA克隆的分離和鑒定分離得到含有目的基因的陽(yáng)性克隆后，必須對(duì)其作進(jìn)一步的驗(yàn)證和鑒定，主要是進(jìn)行限制酶圖譜的繪制、雜交分析、基因定位、基因測(cè)序以及確定基因的轉(zhuǎn)錄方向、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)等。1985，PCR發(fā)明以后，RT-PCR得到了廣泛的應(yīng)用。26第二章基因工程制藥化學(xué)合成法較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以采用人工化學(xué)合成法合成。其先決條件是已知目的基因的核苷酸序列，或已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，按相應(yīng)的密碼子推導(dǎo)出DNA的堿基序列。用化學(xué)方法合成目的基因不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進(jìn)行退火使連接成較長(zhǎng)的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。27第二章基因工程制藥人工化學(xué)合成的限制不能合成太長(zhǎng)的基因，50~60bp。人工合成時(shí)，遺傳密碼的簡(jiǎn)并性可導(dǎo)致中性突變，為選擇密碼子帶來(lái)很大的困難。費(fèi)用較高。同一種氨基酸具有兩個(gè)或更多個(gè)密碼子的現(xiàn)象稱(chēng)為密碼子的簡(jiǎn)并性28第二章基因工程制藥四、基因表達(dá)基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過(guò)程?；蚬こ讨谢蚋咝П磉_(dá)研究是指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動(dòng)，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。

29第二章基因工程制藥什么是最佳的基因表達(dá)體系目的基因的表達(dá)產(chǎn)量高表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定生物活性高表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化30第二章基因工程制藥宿主細(xì)胞的選擇

適合目的基因表達(dá)的宿主細(xì)胞應(yīng)滿足以下要求:

容易獲得較高濃度的細(xì)胞能利用廉價(jià)易得的原料不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素31第二章基因工程制藥宿主細(xì)胞的選擇發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)容易進(jìn)行代謝調(diào)控容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取32第二章基因工程制藥基因表達(dá)的微生物宿主細(xì)胞原核細(xì)胞：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌；真核細(xì)胞：酵母菌、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞。33第二章基因工程制藥原核細(xì)胞－大腸桿菌因?yàn)榇竽c桿菌的分子遺傳學(xué)研究深入，生長(zhǎng)迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系。特點(diǎn)：表達(dá)基因工程產(chǎn)物的形式多種多樣，有細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)（包含體）、胞內(nèi)可溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)等，極少數(shù)還可以分泌到細(xì)胞外表達(dá)。34第二章基因工程制藥大腸桿菌限制：沒(méi)有信號(hào)肽，所以產(chǎn)品多為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物，提取時(shí)需破碎細(xì)胞，這樣細(xì)胞質(zhì)內(nèi)其他蛋白質(zhì)也釋放出來(lái)，造成提取困難。因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)變性復(fù)性才恢復(fù)活性。蛋白質(zhì)不能糖基化。產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個(gè)蛋氨酸殘基。其內(nèi)毒素很難除去。35第二章基因工程制藥枯草芽胞桿菌分泌能力強(qiáng)，蛋白質(zhì)不形成包含體產(chǎn)物蛋白質(zhì)不能糖基化有很強(qiáng)的胞外蛋白酶對(duì)產(chǎn)物降解36第二章基因工程制藥鏈霉菌

作為外源性基因表達(dá)受到重視不致病、使用安全分泌能力強(qiáng)表達(dá)產(chǎn)物可糖基化37第二章基因工程制藥真核細(xì)胞－酵母酵母菌是研究基因表達(dá)最有效的單細(xì)胞真核微生物。其基因組小，世代時(shí)間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無(wú)毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達(dá)。38第二章基因工程制藥絲狀真菌有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力。能正確進(jìn)行翻譯后加工。糖基化方式與高等真核生物相似。

39第二章基因工程制藥哺乳動(dòng)物細(xì)胞

優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，純化容易。產(chǎn)物是糖基化的接近天然物。缺點(diǎn)：生長(zhǎng)慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度稀。40第二章基因工程制藥目前的狀況目前使用最廣泛的宿主仍然是大腸桿菌和釀酒酵母。因?yàn)閷?duì)它們的遺傳背景研究得比較清楚，建立了許多適合于它們的克隆載體和DNA導(dǎo)入方式。并且許多外源在這兩種宿主菌中得到表達(dá)成功。41第二章基因工程制藥大腸桿菌中的基因表達(dá)基因工程的目的和基本手段，是選用合適的載體（vector)把供體DNA（外源基因）運(yùn)載到受體細(xì)胞內(nèi)，從而復(fù)制擴(kuò)增大量的目的DNA分子或轉(zhuǎn)錄表達(dá)為相應(yīng)的產(chǎn)物。42第二章基因工程制藥理想載體的條件

根據(jù)真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的特點(diǎn)，表達(dá)載體應(yīng)具備下列條件：載體能夠獨(dú)立復(fù)制，有復(fù)制起點(diǎn)，有嚴(yán)緊型和松弛型，嚴(yán)緊型伴隨宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制，在宿主細(xì)胞中拷貝少（1-3）；松弛型的復(fù)制可不依賴(lài)與宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中拷貝多達(dá)3000個(gè)。

43第二章基因工程制藥

應(yīng)有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，利于外源基因的克隆、鑒定和篩選。應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所