第五章工業(yè)微生物育種誘變劑

第五章工業(yè)微生物育種誘變劑第1頁，共60頁。2

誘變：通過人為的方法，利用物理、化學(xué)因素處理微生物以引起突變，這一過程稱為誘發(fā)突變。第2頁，共60頁。第3頁，共60頁。4

第4頁，共60頁。5

第5頁，共60頁。6

在DNA復(fù)制過程中取代正常堿基，整合進(jìn)DNA分子

它們產(chǎn)生異構(gòu)體的頻率高，出現(xiàn)堿基錯配的概率也高堿基類似物是如何提高突變頻率的?第6頁，共60頁。（一）堿基類似物的誘變機(jī)制——現(xiàn)以5-BU為例來分析堿基類似物的誘變機(jī)制。當(dāng)胸腺嘧啶分子結(jié)構(gòu)中5位碳原子上的甲基被溴（Br）原子取代，就構(gòu)成了5-BU的結(jié)構(gòu)式。

5-溴尿嘧啶（5-BU）的結(jié)構(gòu)第7頁，共60頁。8

5-溴尿嘧啶（5-BU）的堿基配對第8頁，共60頁。9

第9頁，共60頁。10

G≡CG≡BUeG≡CG≡BUeG≡CA=TA=BUk

A:TA:BUk

A:TG≡BUeA:TG≡CG≡BUeG≡C→A=T5-BU摻入錯誤A:T→G≡C第10頁，共60頁。由于5-BU的誘變作用是在DNA復(fù)制過程中實(shí)現(xiàn)的，因此，處在靜止或休眠狀態(tài)的細(xì)胞是不適合的。細(xì)菌采用對數(shù)期的細(xì)菌，霉菌、放線菌采用孢子，但要進(jìn)行前培養(yǎng)，使孢子處于萌動狀態(tài)，并要加大5-BU的濃度，處理過程要進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。第11頁，共60頁。12

第12頁，共60頁。13

第13頁，共60頁。（二）堿基類似物的誘變處理方法（以5-BU為例）5-BU是白色結(jié)晶粉末，能溶于水或乙醇。誘變處理方法如下：1.單獨(dú)處理新鮮斜面的細(xì)菌——轉(zhuǎn)接到前培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中——培養(yǎng)到對數(shù)期——離心除去培養(yǎng)液——加入生理鹽水或緩沖液——饑餓培養(yǎng)8—10小時——加入5-BU到培養(yǎng)液中，使最后的處理濃度為25—40μg/ml,混合均勻——取0.1—0.2ml菌懸液加入到瓊脂平板上涂布培養(yǎng)——在適宜溫度下，使之在生長過程中誘變處理——培養(yǎng)后挑取單菌落，進(jìn)行篩選。第14頁，共60頁。真菌、放線菌孢子，則要提高5-BU的濃度（0.1—1mg/ml），加到孢子懸液后，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)數(shù)小時(一般6—12h)——分離于平皿——適溫培養(yǎng)——挑取單菌落，進(jìn)行篩選。2.與輻射線復(fù)合處理據(jù)報道，如果菌體先用5-BU等堿基類似物進(jìn)行處理，使它們首先滲入到DNA分子中，然后用輻射線照射，誘變效果會比單獨(dú)使用輻射線更好。因此，堿基類似物也是一種輻射誘變的增敏劑。第15頁，共60頁。16

（a）亞硝酸（b）羥胺（c）甲基磺酸乙酯（d）N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍第16頁，共60頁。17

第17頁，共60頁。18

亞硝酸的脫氨基作用及其誘發(fā)的突變

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A:TG┆C第19頁，共60頁。亞硝酸的處理方法試劑的配制（1）1mol/LpH4.5醋酸緩沖液（2）0.1mol/L亞硝酸鈉溶液（3）0.07mol/LpH8.6磷酸氫二鈉溶液2.處理方法（以處理濃度0.025mol/L為例）取孢子懸液1ml，pH4.5醋酸緩沖液2ml及0.1mol/L亞硝酸鈉溶液1ml，最后處理濃度為0.025mol/L。于25—26℃保溫10—20min，加入0.07mol/L、pH8.6的磷酸氫二鈉溶液20ml，使pH下降至6.8左右，以終止反應(yīng)。稀釋分離于平板。第20頁，共60頁。如果是處理細(xì)菌，亞硝酸最后濃度以0.05mol/L為例：將斜面新鮮菌體移入肉湯培養(yǎng)基，適溫培養(yǎng)到對數(shù)期，將培養(yǎng)液進(jìn)行離心，棄去上清液，用生理鹽水洗滌。pH4.5醋酸緩沖液和0.1mol/L硝酸鈉溶液1:1濃度加入沉淀的菌體中，使之懸浮。于35—37℃處理5—10min、加入5倍的pH8.6的磷酸氫二鈉溶液，使pH下降到6.8。取一定量進(jìn)行后培養(yǎng)1.5—2h。然后稀釋分離于平板上。注：在亞硝酸處理菌體或孢子時要嚴(yán)格控制好溫度，否則會影響誘變效果。第21頁，共60頁。22

第22頁，共60頁。羥胺的誘變機(jī)制改變了結(jié)構(gòu)的胞嘧啶第23頁，共60頁。根據(jù)誘變機(jī)制，羥胺不能使突變回復(fù)，即不能使A:T

G:C轉(zhuǎn)換，進(jìn)行逆向突變。由于羥胺是誘發(fā)G:CA:T的專一性誘變劑，因此，可以用來鑒別突變體是A:T

G:C還是G:CA:T轉(zhuǎn)換。羥胺的處理方法：常用濃度為0.1—5%，可直接在溶液中處理，時間1—2h，然后分離培養(yǎng)。但一般都加到瓊脂平板或振蕩培養(yǎng)基中，然后接入孢子或細(xì)菌，在適溫下培養(yǎng)，生長過程中處理，所用濃度比直接處理時低些。第24頁，共60頁?！榛瘎┦钦T發(fā)突變中一類相當(dāng)有效的化學(xué)誘變劑，這類誘變劑具有一個或多個活性烷基，它們易取代DNA分子中活潑的氫原子，直接與一個或多個堿基起烷化反應(yīng)，從而改變DNA分子結(jié)構(gòu)，引起突變。雙功能烷化劑單功能烷化劑多功能烷化劑根據(jù)烷化劑中活性烷基的數(shù)目亞硝基類、磺酸酯類、硫酸酯類、重氮烷類、乙烯亞胺類化合物硫芥子、氮芥子類等第25頁，共60頁。26

烷化堿基部分烷化劑部分烷化劑

和

烷化堿基

甲基磺酸甲酯亞硝基乙基脲7-甲基鳥嘌呤3-甲基腺嘌呤O6-甲基鳥嘌呤第26頁，共60頁。烷化劑的誘變機(jī)制——烷化劑主要使通過烷化基團(tuán)使DNA分子上的堿基及磷酸部分烷化，DNA復(fù)制時導(dǎo)致堿基配對錯誤而引起突變。堿基中容易發(fā)生烷化作用的是嘌呤類。其中鳥嘌呤N7是最易起反應(yīng)的位點(diǎn)，幾乎可以和所有烷化劑起烷化作用；甲基磺酸乙酯主要使嘌呤N7烷基化。第27頁，共60頁。其次引起烷化的位點(diǎn)是鳥嘌呤N3、腺嘌呤N2、腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。這些位點(diǎn)引起堿基置換的僅占烷化作用的10%左右。因此，由這些位點(diǎn)改變所引起的突變僅是少數(shù)。此外，DNA分子中比較多的烷化位點(diǎn)是鳥嘌呤O6、胸腺嘧啶O4，這些可能都是引起突變的主要位點(diǎn)。第28頁，共60頁。如果鳥嘌呤N7等位點(diǎn)被烷化后，它和核糖結(jié)合鍵發(fā)生水解反應(yīng)，引起鳥嘌呤從DNA分子上脫落下來，使DNA鏈上堿基空缺，在以后的復(fù)制過程中其它游離堿基有可能錯誤摻入。GC就可能變?yōu)槿魏螇A基對G:C——A:T轉(zhuǎn)換及G:C——C:G或G:C——T:A顛換而導(dǎo)致突變。第29頁，共60頁。由于烷基化后的鳥嘌呤，易離子化，由原來的酮式變?yōu)椴环€(wěn)定的烯醇式，不能和胞嘧啶配對，而是與胸腺嘧啶錯誤配對，結(jié)果發(fā)生G:C——A:T轉(zhuǎn)換而導(dǎo)致突變。第30頁，共60頁。

烷化鳥嘌呤的堿基配對

第31頁，共60頁。烷化劑除了以上誘變作用之外，還有可能使兩個鳥嘌呤N7位點(diǎn)形成共價鍵，一般雙功能烷化劑容易引起DNA雙鏈間的交聯(lián)，造成變異或死亡。第32頁，共60頁。33

總結(jié)鳥嘌呤N7位點(diǎn)的烷化作用第33頁，共60頁。烷化劑的性質(zhì)——烷化劑的性質(zhì)比較活潑，不太穩(wěn)定，在水溶液中容易發(fā)生水解。——它們大部分半衰期很短，其長度與溫度、溶液pH關(guān)系很大。因此，化學(xué)誘變劑要現(xiàn)用現(xiàn)配。——不少烷化劑見光后，容易發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，和水解作用一樣，有的分解產(chǎn)物會失去誘變作用或具毒性。因此，保藏時要注意避光，置棕色瓶中，放在干燥器或冰箱中保存。——另外，配制烷化劑溶液時，要采用合適的pH緩沖液。第34頁，共60頁。烷化劑名稱理化特性pH7水中半衰期/h分子量狀態(tài)水溶性溶點(diǎn)或沸點(diǎn)20℃30℃37℃甲基磺酸乙酯(EMS)無色液體約8%沸點(diǎn)85~86℃/10mmHg932610.4124乙烯亞胺(EI)無色液體易溶于水沸點(diǎn)56℃/760mmHg43亞硝基乙基脲(NEU)粉紅色液約5%沸點(diǎn)53℃/5mmHg84117亞硝基甲基脲(NMU)黃色固體35103硫酸二乙酯(DES)無色油狀物不易溶3.3410.5亞硝基胍(NTG)黃色固體熔點(diǎn)118℃烷化劑的某些性質(zhì)第35頁，共60頁。幾種常用的烷化劑：1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（簡稱亞硝基胍，NTG或NG或MNNG）為黃色結(jié)晶狀物質(zhì)，性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光易分解，放出NO，顏色由黃色變?yōu)榫G色，誘變效應(yīng)降低。須保存在棕色瓶中，并在避光、干燥、低溫條件下貯存。NTG不溶于水，須加助溶劑，使用時現(xiàn)配現(xiàn)用。NTG有超誘變劑之稱，能使細(xì)胞發(fā)生一次或多次突變，誘變效果好，尤其適合于誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變株。其中處理細(xì)菌、放線菌等微生物時，不經(jīng)淘汰，就可以直接得到10%以上的營養(yǎng)缺陷型突變株。而用一般誘變劑處理只能達(dá)百分之幾至千分之幾。第36頁，共60頁。NTG的水溶液中隨著不同的pH將產(chǎn)生不同的分解產(chǎn)物，從而影響誘變效應(yīng)。當(dāng)溶液pH低于5.5時，NTG分解成HNO2,HNO2本身就具誘變作用；當(dāng)溶液pH在8.0以上時，NTG會分解產(chǎn)生重氮甲烷（CH2N2），對核酸起烷化作用，引起微生物突變；當(dāng)溶液pH為6.0時，NTG本身和DNA起烷化反應(yīng)而導(dǎo)致突變。通常在pH6.0的條件下進(jìn)行誘變處理。由于酸堿條件影響NTG的誘變效果，因此，無論是配制NTG溶液，還是制備均懸液都要用適宜的緩沖溶液。常用的由磷酸緩沖液和Tris緩沖液.第37頁，共60頁。1.取新鮮的斜面，用一定pH值的緩沖液或Tris緩沖液洗下細(xì)菌制成菌懸液。如果采用細(xì)菌細(xì)胞或絲狀菌孢子（真菌或放線菌）須進(jìn)行前培養(yǎng)，可用有關(guān)培養(yǎng)基代替以上緩沖液，孢子培養(yǎng)時間控制在大部分孢子處在萌動階段，經(jīng)離心、洗滌，用緩沖液制成懸液，濃度約在106-107ml-1；NTG的誘變處理方法：第38頁，共60頁。2.配制NTG母液：由于NTG不溶于水，配制需加助溶劑甲酰胺或丙酮少許，然后加緩沖溶液，其比例為9：1（緩沖溶液9ml：NTG丙酮溶液1ml），一般NTG母液濃度配成1mg/ml。使用時取母液0.2ml，加菌懸液1.8ml，NTG最后處理濃度為100μg/ml。一般處理濃度隨菌種不同而異，通常細(xì)菌為100—1000μg/ml，而放線菌、真菌孢子為1000—3000μg/ml。3.將以上菌懸液和NTG溶液混合于一試管內(nèi)，置該菌生長適宜的溫度下保溫處理若干時間。第39頁，共60頁。4.終止反應(yīng)。用冷的生理鹽水稀釋到50倍以上或在低溫下進(jìn)行離心洗滌，除去藥液，加無菌水使沉淀懸浮并作成一定稀釋度分離于平皿。處理完畢后，馬上把接觸過NTG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸泡處理。除以上直接以溶液處理外，也可以進(jìn)行如下方法誘變處理：1.搖瓶振蕩處理2.在平皿上生長過程處理第40頁，共60頁。NTG是一種強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)，操作時要帶橡皮手套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。凡接觸過NTG的器皿必須及時、單獨(dú)處理，例如用自來水大量沖洗或用1—2mol/L的NaOH或2%的Na2S2O3浸泡過夜，洗凈。第41頁，共60頁。42

第42頁，共60頁。43

溴化乙錠（EtBr）由美國的腫瘤研究所合成，故名。這是一些由烷化劑與吖啶類化合物相結(jié)合的化合物。第43頁，共60頁。44

B嵌入到舊鏈上導(dǎo)致插入突變A嵌入到新合成鏈上導(dǎo)致缺失突變第44頁，共60頁。移碼誘變劑的嵌入并不導(dǎo)致突變，必須通過DNA的復(fù)制才形成突變，因此這類誘變劑只能作用于生長態(tài)的細(xì)胞。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中利用溴化乙錠能嵌入到DNA分子的特性，將其作為常用的DNA染料；在微生物遺傳育種中溴化乙錠是酵母菌小菌落突變型的有效誘變劑。第45頁，共60頁。46

第46頁，共60頁。重視化學(xué)誘變劑的操作安全化學(xué)誘變劑多數(shù)是極毒的致癌藥品，在進(jìn)行誘變操作后的處置以及誘變劑的保藏等方面的安全防護(hù)都是及其重要的。如有疏忽，就可能對人體健康的環(huán)境帶來惡果，萬萬不可麻痹。使用化學(xué)誘變劑一般要求避光、密封、低溫、干燥等；盡可能不觸及人體任何部位；對殘余物要及時進(jìn)行消毒、稀釋處理。第47頁，共60頁。48

——物理誘變劑是指通常使用物理輻射中的各種射線，包括紫外線、X射線、γ射線、快中子、α射線、β射線、微波、超聲波、電磁波、激光射線和宇宙線等。第48頁，共60頁。第49頁，共60頁。50

第50頁，共60頁。51

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