生物芯片表達(dá)譜分析技術(shù)

生物芯片表達(dá)譜分析技術(shù)主要內(nèi)容常用公共微陣列數(shù)據(jù)庫

GEO，ArrayExpress常用微陣列數(shù)據(jù)預(yù)處理軟件

R(Bioconductor)，Arraytool識別差異表達(dá)基因方法

Foldchange,Ttest,SAM常用公共數(shù)據(jù)庫及檢索實例目前主要芯片數(shù)據(jù)庫

GEO主頁面簡介GEO數(shù)據(jù)庫創(chuàng)建于2000年，是當(dāng)今最大、最全面的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)資源。GEO數(shù)據(jù)庫覆蓋廣泛的生物學(xué)內(nèi)容，包括疾病、代謝、藥理學(xué)、藥學(xué)、免疫學(xué)和生態(tài)學(xué)等。數(shù)據(jù)來自世界各地實驗室研究者的提交。數(shù)據(jù)類型包括核苷酸陣列（cDNA、寡核苷酸），比較基因組雜交，質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)組等等。包含1600多個物種：/geo/summary/?type=taxfullGEO組成及結(jié)構(gòu)

GEO將研究者遞交的數(shù)據(jù)分成三個等級的實體類型，分別是平臺(platform)、系列(series)和樣本(sample),它們每個均可保存到獨立相關(guān)的數(shù)據(jù)庫，因為它們分別被賦予了一個唯一的、永恒不變的標(biāo)志符。數(shù)據(jù)庫中的記錄種類1：平臺（Platform）：描述芯片的特性，如寡核苷酸探針組,cDNA,SAGE標(biāo)簽,抗體等。一個平臺可以被不同樣本、不同系列引用。平臺登錄號的首字母為“GPL”。樣本（Sample）：描述了樣本是如何從未處理狀態(tài)到形成最后的提交數(shù)據(jù)，包括經(jīng)過何種處理，處理方式，如何從中提取待測生物分子，生物分子如何被標(biāo)記，如何雜交，如何掃描，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過何種處理轉(zhuǎn)化為提交數(shù)據(jù)，以及最后提交結(jié)果中每種分子的測量值。一個樣本只能引用一種平臺，卻可以被多個系列引用。樣本登錄號的首字母為“GSM”。系列（Series）：包括一組相關(guān)的樣本，以及對整個研究的介紹。一個系列可以引用多個樣本，可以引用多個平臺。系列登錄號的首字母為“GSE”。數(shù)據(jù)庫中的記錄種類2：數(shù)據(jù)集（Dataset）:是由系列整理后形成的，一個系列可以形成一個或者多個數(shù)據(jù)集。一個數(shù)據(jù)集只引用一個平臺，且經(jīng)過處理后，同一個數(shù)據(jù)集內(nèi)的不同芯片間同一個基因的值是可以直接比較的。數(shù)據(jù)集登錄號首字母是“GDS”。表達(dá)譜（Profile）:從數(shù)據(jù)集中抽取的，一個基因在不同個樣本中的表達(dá)值組成的數(shù)組。數(shù)據(jù)的檢索、瀏覽與下載根據(jù)需求在該對話框中輸入關(guān)鍵字例如：lungbloodmiRNAhomo數(shù)據(jù)下載ArrayExpress主頁面http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/ArrayExpress是一個公開的，免費訪問的數(shù)據(jù)庫

用戶可進行提交，查詢和下載相應(yīng)的表達(dá)數(shù)據(jù)。ExperimentsArchive------檢索窗口

截止到目前為止收錄1223250個芯片（array）數(shù)據(jù)，涉及到43124個實驗（experiment）工作，涵蓋200多個物種。包含基因表達(dá)數(shù)據(jù)，copynumber數(shù)據(jù)，microRNA表達(dá)數(shù)據(jù)等不同類型的高通量數(shù)據(jù)。ArrayExpress簡介在上述箭頭所指區(qū)域內(nèi)，可以直接輸入實驗數(shù)據(jù)編號，查詢數(shù)據(jù)樣本量，癌型等關(guān)鍵詞信息進行相應(yīng)查詢。例如：實驗數(shù)據(jù)編號-----E-GEOD-17710，E-MEXP-1029，E-AFMX-5，E-SMDB-2287，E-TABM-343等等關(guān)鍵詞-----humanlungcancermicroRNA或者不輸入任何信息直接點擊進入下述頁面，返回所有的實驗數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)查詢和下載可以在上述箭頭所示區(qū)域進行進一步的過濾篩選：A：如果查詢lung相關(guān)數(shù)據(jù)，只要輸入lung，會自動提示如下相關(guān)信息進行篩選ABCDE注意：若輸入多個關(guān)鍵詞，默認(rèn)的是AND連接，輸入lungcancer其實匹配的是‘lungANDcancer’。B：可以進行物種過濾查詢，有如下200多個物種可供選擇C：可以通過數(shù)據(jù)涉及平臺進行過濾查詢，包括affymatrix，agilent，illumina等多種芯片平臺。D和E：可對數(shù)據(jù)類型（蛋白，RNA，DNA等），芯片技術(shù)類型（質(zhì)譜，測序等）進行過濾篩選。例如進行如下篩選返回64個結(jié)果：點擊箭頭所示‘加號’，展示如下結(jié)果：ABCDEFG下載數(shù)據(jù)預(yù)處理的數(shù)據(jù)：

E-GEOD18842.processed.1.zip原始數(shù)據(jù)：

E-GEOD-18842.raw.1.zipE-GEOD-18842.raw.2.zipE-GEOD-18842.raw.3.zip

樣本信息：

E-GEOD-18842.sdrf.txt

平臺信息：

A-AFFY-44.adf.txt微陣列數(shù)據(jù)預(yù)處理及其相應(yīng)的軟件圖像分析和數(shù)據(jù)提取數(shù)據(jù)預(yù)處理差異表達(dá)篩選后續(xù)芯片數(shù)據(jù)分析芯片數(shù)據(jù)分析流程芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理 1.

背景校正(BackgroundCorrection)；

2.標(biāo)準(zhǔn)化(Normalization); 3.合并(Summary).中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化方法(quantile)中位數(shù)標(biāo)化步驟如下：第一步：對每張芯片的數(shù)據(jù)點排序。第二步：求出同一位置的幾次重復(fù)實驗數(shù)據(jù)的均值，并用該均值代替該位置的基因的表達(dá)量。第三步：將每個基因還原到本身的位置上。局部加權(quán)回歸標(biāo)化(Loess)方法局部加權(quán)回歸標(biāo)化步驟如下：第一步：首先確定以x為中心的一個區(qū)間(Window)內(nèi)參加局部回歸的觀察值的個數(shù)q。q值設(shè)的越高則得到的擬和曲線越平滑，但對變量關(guān)系的細(xì) 微變化越不敏感。小的q值會對細(xì)微的變化很敏感，但是得到的擬和曲線變得很粗糙。第二步：定義區(qū)間內(nèi)所有點的權(quán)數(shù)，權(quán)數(shù)由權(quán)數(shù)函數(shù)來決定，任一點的權(quán)數(shù)是權(quán)數(shù)函數(shù)的曲線的高度。第三步：對每個區(qū)間內(nèi)的q個散點擬和一條直線，擬合曲線描述這個區(qū)間內(nèi)的變量關(guān)系。第四步：擬合值y值就是在x點的y的擬合值。

對基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析，其重要任務(wù)之一是篩選差異表達(dá)基因，即通過比較正常和疾病狀態(tài)下基因表達(dá)的差異。常用篩選差異表達(dá)基因的方法：

1.倍數(shù)法（foldchange）

2.T檢驗（T-test）

3.SAM（significanceanalysisofmicroarrays）

篩選差異表達(dá)基因FC方法-foldchangeFC（Foldchange）常稱為倍數(shù)法或倍數(shù)差異法，是早期基因芯片實驗常采用的篩選差異基因表達(dá)的方法，其算法如下：其中和分別為對不同分組每例觀測的基因表達(dá)水平取對數(shù)后的均值。FC法僅比較不同組件變量平均差別的大小，其缺點顯而易見，即沒有考慮到數(shù)據(jù)的離散程度，受極端值的影響較大，而極端值是微陣列實驗中的常見現(xiàn)象。同時沒有給出差異的顯著性。

T檢驗（T-test）T檢驗是傳統(tǒng)兩組均數(shù)比較方法，理論上要求兩組數(shù)據(jù)均來自正態(tài)分布總體且兩組數(shù)據(jù)的總體方差相等。如果要評斷兩組樣本平均數(shù)之間的差異程度，其統(tǒng)計量T值的計算公式為：

T

=a=(1/n1+1/n2)/(n1+n2-2)S(i):第i個基因兩組均數(shù)差的標(biāo)準(zhǔn)誤不足：由于標(biāo)準(zhǔn)誤的估計建立在小樣本的基礎(chǔ)上，標(biāo)準(zhǔn)誤的穩(wěn)定性受到影響，而在大量基因中不可避免存在部分具有極小標(biāo)準(zhǔn)誤的基因，t檢驗在樣本標(biāo)準(zhǔn)誤較小的情況下，即使表達(dá)均數(shù)間的差值并不大，也可能得到很大的t值而被判斷為差異表達(dá)，造成了假陽性。

t檢驗在一定程度上也會受到極端值的影響。SAM

（significanceanalysisofmicroarrays）SAM基本原理是在傳統(tǒng)t檢驗公式的分母加上一個較小的正數(shù)S0，使構(gòu)建的統(tǒng)計量在分子（均數(shù)差值）較小的情況下不容易得到較大的t值。通過上述調(diào)整可以在很大程度上限制表達(dá)水平較低的基因被識別為差異表達(dá)基因，并且使得統(tǒng)計量的分布較少依賴于基因表達(dá)水平。

公式中S0的取值需要保證統(tǒng)計量d(i)的變異系數(shù)最小，d(i)的變異系數(shù)可以通過permutation方法作為s(i)的函數(shù)求得。SAM的初衷是避免將表達(dá)水平和變異程度均較低的無生物學(xué)意義的基因識別為差異表達(dá)基因，在t檢驗公式的分母中加入一個較小的正數(shù)，使得SAM法對基因表達(dá)的變異程度敏感性降低，而對基因表達(dá)平均水平的組間差異敏感性增強。即使差異表達(dá)具有較小變化的基因不會因為具有很小的標(biāo)準(zhǔn)誤而被誤判為差異表達(dá)基因，減小了t檢驗的不穩(wěn)定性。決定其調(diào)整程度大小的“修正因子”S0由樣本數(shù)據(jù)計算得到，這一特點使其可因數(shù)據(jù)的不同而改變調(diào)整的程度。SAM在某種程度了減弱了極端值的影響。Bioconductor是針對基因組分析的一組R語言擴展包source("/getBioC.R")getBioC()

Affy芯片數(shù)據(jù)分析舉例1.Backgroundmethods：

"bg.correct“"mas""none""rma“2.NormalizationMethods：

"constant""contrasts""invariantset""loess""methods" "qspline""quantiles""quantiles.robust“3.Summarizationmethods：

"avgdiff""liwong""mas""medianpolish""playerout”4.DifferentialExpressionGenemethods“samr““t.test"

#LoadtheBioconductorpackageaffy.>library(affy)#Readthe.CELfiledata.>Data=ReadAffy()#ComputetheRMAmeasuresofexpression.>expr=justRMA(Data,background="RMA”,normalize="quantile")#Writethedatatoatab-delimitedtextfile.>write.exprs(expr,file="mydata.txt")BRB-ArrayTools是一款為