實驗2重組質粒的提取及鑒定2015

1實驗二 重組DNA的提取及酶切鑒定復旦大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學實驗教學中心邵紅shaohx@2一、實驗目的掌握以下方法和技術：1.質粒DNA的小量快速制備2.質粒DNA的限制性內切酶酶切3.DNA的瓊脂糖凝膠電泳3二、實驗原理

分離質粒DNA有三個步驟：1.培養(yǎng)細菌使質粒擴增2.收集和裂解細菌（本實驗：SDS裂解）

3.分離和純化質粒DNA（本實驗：堿變性法）1.質粒DNA的小量快速制備4堿變性法抽提質粒DNASolutionIIpH12.6SolutionIIIpH4.8離心后去向染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋解開不能復性沉淀中質粒DNA氫鍵部分斷裂，cccDNA互補鏈不完全分離復性上清中5硅基質材料(樹脂）與DNA雙鏈相互作用的原理DNA分子中的磷酸二酯鍵骨架在鹽溶液的作用下脫水，使得暴露的磷酸基團吸附硅膠。雙鏈DNA分子一旦被硅膠吸附，一般的洗液不能將其洗脫下來，只有水溶性的緩沖液，如TE或水重新水化后，DNA才能從層析柱上定量回收。62.質粒DNA的限制性內切酶酶切

BamHI+XbaI雙酶切（酶切完全時）

瓊脂糖凝膠電泳凝膠中2條區(qū)帶

3.5kbpSV2載體片段

4.8kbc-myc目的基因片段pSV-c-mycBamHIXbaIc-myc基因片段4.8kbpSV2載體片段3.5kb7 瓊脂糖——海藻中提取的線狀高聚物 加熱融化成清澈、透明的溶液 凝固后成凝膠3.瓊脂糖凝膠電泳89DNA在凝膠中的遷移率的影響因素DNA分子的大小瓊脂糖的濃度

DNA的構象

所加電壓嵌入染料的存在電泳緩沖液的組成及其離子強度1011不同含量標準的瓊脂糖凝膠的分離范圍瓊脂糖凝膠濃度線狀DNA分子分離范圍（%，m/V）（kb）0.35~600.51~300.61~200.70.8~121.00.5~101.20.4~61.50.2~42.00.1~312

質粒DNA的3種構象瓊脂糖凝膠電泳凝膠中1、2、3條帶都有可能共價閉合環(huán)形DNA開環(huán)DNA線性DNA存在復制中間體可能13DNA瓊脂糖凝膠電泳緩沖液14 1%瓊脂糖凝膠電泳中： 溴酚藍遷移速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同； 二甲苯氰FF約與長4000bp的DNA相同增加樣品密度，以確保DNA均勻進入樣品孔里使樣品呈現(xiàn)顏色在電場中可預知速率（向陽極涌動的染料）15三、實驗器材與試劑（詳見實驗講義）16四、實驗步驟

（詳見實驗講義）1.質粒DNA的小量快速制備（AXYGENAxyPrep質粒DNA小量制備試劑盒）注意事項：1.首次使用前，將RNaseA全部加入BufferS1中，4℃貯存2.首次使用前，BufferW2concentrate中加入指定體積的無水乙醇3.使用前檢查BufferS2是否出現(xiàn)沉淀，若有應在37℃加熱溶解并冷卻至室溫使用4.自行準備無核酸和核酸酶污染的tip頭和離心管5.BufferS2使用后立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶菌效率17將細菌培養(yǎng)物全部倒入15ml離心管，4500rpm，5min加250μlBufferS1，吹打混勻（也可Vortex）以充分懸浮細菌，轉入1.5ml離心管加250μlBufferS2，上下顛倒，溫和混勻4~6次使菌體裂解加350μlBufferS3，上下顛倒，溫和混勻6~8次，12000g離心10min吸取上清至已置于2ml離心管的制備管中，12000g離心1min，棄濾液同上，在制備管中加500μlBufferW1，12000g離心1min，棄濾液在制備管中加700μlBufferW2，12000g離心1min，棄濾液，重復以BufferW2洗滌（離心）一次，再空離心1次將制備管移入新的1.5ml離心管，在膜中央加60μlEluent或去離子水，室溫靜置1min，12000g離心1min，即為質粒DNA。避免劇烈搖晃，此步驟不宜超過5min避免劇烈搖晃Eluent液65度溫育可提高洗脫效率請保持同步！離心機配平棄上清，瀝干，注意細菌沉淀別倒掉了！182.質粒DNA的限制性內切酶的雙酶切Buffer42μlBamHⅠ(20U/μl)1μlXbaⅠ(20U/μl)1μlddH2O10μl質粒DNA6μl20μl混勻后短暫離心，37℃水浴1小時注意：加樣順序保證每樣試劑加入反應體系乙?；疊SA可不加加樣完成后需混勻，短暫離心反應結束后，上樣電泳前需短暫離心，再加凝膠加樣緩沖液及時將酶放回-20℃冰箱以保證酶的活力19準備好制膠器，插好梳子并保證梳子距底部0.5mm-1.2mm灌膠（事先加GelRed）注意趕氣泡待凝準備好凝膠，加熱熔解20注意事項：標液面高度以觀察水分是否蒸發(fā)過多，若溶解后水分蒸發(fā)過多，補水2.三角燒瓶上覆打過洞的保鮮膜（防水蒸發(fā)）防爆沸和燙傷（帶手套）加6μlGelRed后立即灌膠（戴手套）稱量agarose加入TAE60ml，勿晃微波爐溶膠注意先做好制膠準備！1%agarose凝膠1%agarose凝膠21在電泳槽內加電泳緩沖液拔去加樣梳，將制好的凝膠連同內架放入電泳槽內，保證液面高于凝膠面加入6×凝膠加樣緩沖液和DNA（1:5比例混合）依次加樣，并加好Marker連通電源，80V電泳至溴酚藍帶達到凝膠的1/2處結果觀察和記錄DNA從陰極向陽極遷移EBr從陽極向陰極遷移（加樣后不能移動電泳槽?。?2凝膠成像及分析系統(tǒng)233.DNA的1%瓊脂糖凝膠電泳制膠：1%agarose，防過熱暴沸上樣準備（1份凝膠加樣緩沖液加5份DNA）上樣和電泳:每組上樣2個（未酶解質粒和雙酶切產物）未酶解質粒10μl+2μl凝膠加樣緩沖液雙酶切產物20μl+4μl凝膠加樣緩沖液Marker5μl,放中間，2組1塊膠

各組先做好準備，兩組統(tǒng)一集中上樣后電泳

電泳槽和電泳儀不可移動24

未酶切酶切未酶切酶切Marker10μl+2μl20μl+4μl10μl+2μl20μl+4μl5μl4.結果觀察和記錄80~100V電泳，直到溴酚藍帶泳動到凝膠的1/2至2/3處停止。紫外燈下觀察，拍照記錄。上樣圖示：25預期結果未酶切質粒對照組雙酶切實驗組雙酶切實驗組雙酶切對照組雙酶切未酶切質粒Marker26未酶切質粒對照組雙酶切實驗組雙酶切λDNA/HindшMarker-23130-9416-6557-4361-2027-23221%agarose凝膠電泳27發(fā)散性思考：為何細菌平板上的長出的細菌集合是單克?。ㄒ粋€細菌來源）的？請例舉可能的解釋來支持或反對這一說法。為何線性的質粒不易轉入細菌內，如何從機理上解釋，從實驗中證明？連接時是否會出現(xiàn)多聚體？思考與疑問：做感受態(tài)時，為何要在冰浴下進行？是否還有其他可能原因

為了讓細胞膜流動性降低，利于DNA的結合，同時使細胞暫停生長，維持在對數(shù)生長期的高活性全程在冰浴下進行，反復