抗核抗體譜檢測（免疫印跡法）

抗核抗體譜檢測（免疫印跡法）目的熟悉自身免疫性疾病抗核抗體譜檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，以便于更加規(guī)范化的操作，提高免疫檢驗質(zhì)量，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。適用范圍適用于免疫室內(nèi)自身免疫性疾病抗核抗體譜檢測職責(zé)檢驗科主任負(fù)責(zé)組織人員制定自身免疫性疾病抗核抗體譜檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序，免疫室組長負(fù)責(zé)組織人員具體實施。SOP本標(biāo)準(zhǔn)程序的變動，可由任一使用本SOP字：專業(yè)組長、科主任。原理該歐蒙印跡法試劑盒用于體外定性檢測血清或血漿中的人抗nRNPSm天然SS-A和Ro-5、SS-、Scl-7、PM-Sc、Jo-、CENP、PCNAdsDN、核小體、組蛋白、核P蛋白和AMAM214種不同抗原IgG也包括IgA和IgM）與相應(yīng)抗原結(jié)合。為檢測已結(jié)合的抗體，加入酶標(biāo)抗人IgG（酶結(jié)合物）進(jìn)行第二次溫育，然后加入酶底物，以產(chǎn)生可觀察的顏色反應(yīng)。標(biāo)本采集及實驗標(biāo)本要求2-3ml，待分離血清后，離心/分血2ml，分離血清備用。也可使用EDTA無污染，避免溶血，避免反復(fù)凍融，不可用NaN3標(biāo)本存放：2-8C1482-8℃密閉運(yùn)輸。標(biāo)本拒收條件：蛋白變性標(biāo)本，標(biāo)本中含有顆粒物質(zhì)，細(xì)菌污染，嚴(yán)重溶血或脂血標(biāo)本不能做測定。試劑成份抗原包被的實驗?zāi)l（天然A和、Jo-1、CENPB、PCNA、dsDNA、核小體、組蛋白、核糖體PAMA。陽性對照（，人，0倍濃縮。酶結(jié)合物堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG，10倍濃縮。標(biāo)本緩沖液清洗緩沖液10倍濃縮。底物液

規(guī)格16條1×0.02ml1×3ml1×100ml1×50ml/5-溴-4--3--磷酸鹽1×30ml使用。結(jié)果判定模板溫育盤塑料封膜實驗說明書附:nRNP/Sm：小牛和兔胸腺提取物，經(jīng)親和層析純化的天然U1-nRNP。Sm：牛脾臟和胸腺提取物，經(jīng)親和層析純化的天然Sm。SS-A：牛脾臟和胸腺提取物，經(jīng)親和層析純化的天然SS-A。

1張2×8槽1張1份：重組的，相應(yīng)的人A用桿狀病毒系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。SS-B：小牛和兔胸腺提取物，經(jīng)親和層析純化的天然SS-B。：牛和兔胸腺提取物，經(jīng)親和層析純化的天然（A拓?fù)洚悩?gòu)酶。PM-SclcDNA用桿狀病毒系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。Jo-1：小牛和兔胸腺提取物，經(jīng)親和層析純化的天然Jo-1（-tRNA合成酶。CENPB：重組的著絲點(diǎn)蛋白BcDNA用桿狀病毒系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。：重組的（，相應(yīng)的人A用桿狀病毒系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。dsDNA：從鮭魚睪丸提取物中高度純化的天然雙鏈。核小體：從牛胸腺提取物中純化的天然核小體。組蛋白：從牛胸腺提取物中純化的各種類型組蛋白的混合物。核糖體P蛋白：小牛和兔胸腺提取物，用親和層析純化的天然核糖體P蛋白。AMAM2：從豬心臟提取物中純化的天然M2抗原（丙酮酸脫氫酶復(fù)合物。儀器設(shè)備：:BT-2.0型.:80-2.移液器：芬蘭雷博公司，每年由國家計量單位進(jìn)行一次校準(zhǔn)。漩渦混勻器試劑要求使用前所有試劑均必須于室溫（18-25C）平衡30分鐘。從第一次使用起，試劑盒如保存在2-8C，并且沒有污染的情況下，可穩(wěn)定至所標(biāo)示的有效期。操作步驟::1:101稀釋（15ul1.5ml樣本緩沖液稀釋并混勻。:使用時用干凈的吸管從瓶中吸取需要量用標(biāo)本緩沖液1:10稀釋。如可取0.15ml1.35ml（一條膜條需要量:10倍濃縮。使用時用干凈的吸管從瓶中吸取需要量用蒸餾水1:10稀釋。1ml濃縮緩沖液用9ml蒸餾水稀釋。稀釋后的緩沖液應(yīng)在同一個工作日用完。:1:10115ul1.5ml標(biāo)本緩沖液稀釋并用漩渦混勻器（不要用加樣器）.:每槽中加1.5ml標(biāo)本緩沖液，于室溫在搖擺搖床上溫育5分鐘。之后吸去槽內(nèi)液體。:1.5ml已稀釋血清。于室溫在搖擺搖床上溫30分鐘。:吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1.5ml35分鐘。酶結(jié)合物溫育吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1.5ml35分鐘。:吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1.5ml35分鐘。:在溫育槽中分別加入1.5ml底物液，于室溫C）在搖擺搖床上溫育10分鐘。:吸去槽內(nèi)液體，用蒸餾水清洗膜條31分鐘。結(jié)果判讀:（錄在結(jié)果判定模板上，在相應(yīng)抗原的位置出現(xiàn)白色條帶為陰性。根據(jù)抗原帶著色的深淺，可將結(jié)果分為陰性、臨界陽性和陽性。抗原帶著色的深淺抗原帶著色的深淺無色著色非常弱著色與質(zhì)控帶強(qiáng)度相同結(jié)果陰性陽性強(qiáng)陽性質(zhì)量控制：膜條上有質(zhì)控帶。質(zhì)控帶出現(xiàn)強(qiáng)的顏色反應(yīng)，表明實驗結(jié)果可靠。定標(biāo):實驗?zāi)l上各種抗原的反應(yīng)性已用疾病控制中心（美國亞特蘭大）提供的人參考血清CDC-ANA#1-11進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。CDC血清與歐蒙印跡法ANA譜的反應(yīng)性如下：抗原CDC1CDC2CDC3CDC4CDC5CDC6CDC7CDC8CDC9CDC1CDC110均質(zhì)/環(huán)狀斑點(diǎn)/SS-B斑點(diǎn)RNPSm核仁型SS-A著絲點(diǎn)Scl-70Jo-1PM-SclnRNP/S+-+++------mSm+-+-+------SS-A-++---+----Ro-52-++---+--+-SS-B-++--------Scl-70--------+--PM-Scl----------+Jo-1---------+-CENPB-------+---PCNA-- - - - - --- - -dsDNA+- - - - - --- - -核小體+- - - - - +-- - -組蛋白+- - - - - +-- - -核糖體P蛋白-- - - - - --- - -M2-- - - - - -+- - -這些CDC血清的特異性已用免疫熒光模型（細(xì)胞和靈長類肝臟擴(kuò)散或?qū)α髅庖唠娪镜慕Y(jié)果進(jìn)行驗證，這些血清不是單一特異性的。說明：檢測范圍：歐蒙印跡法是一種定性檢測方法。一般不受檢測范圍限制，標(biāo)本稀釋度為1:101。交叉反應(yīng)：所用抗原的質(zhì)量（抗原和抗原來源）IgG類抗nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、PM-Scl、Jo-1、CENP、PCNA、dsDNAAMAM2抗體，未發(fā)現(xiàn)與其它自身抗體之間的交叉反應(yīng)。5mg/ml20mg/ml度為0.4mg/ml的黃疸對檢測結(jié)果沒有影響。內(nèi)差異則通過在同一天內(nèi)多次分析典型的標(biāo)本進(jìn)行檢測敏感性及特異性：22混合性結(jié)締組織病RNP/SmELISA100％。對健康獻(xiàn)血員100SLE風(fēng)濕病組n=14n＝38，n＝25）96％。Sm：對45例SLE患者血清標(biāo)本檢測抗Sm抗體，以ELISA作為參照，敏感性為100％。對健康獻(xiàn)血員（n＝50）和非SLE風(fēng)濕病組（干燥綜合征n=14，硬皮病n＝38，多肌炎n＝25）的特異性為100％。SS-A：14SS-AELISA為100SLE（n＝22）95％。Ro-52：對103例SLE和干燥綜合征（SLEn＝23，干燥綜合征n＝77和新生兒狼瘡n＝3）患者血清標(biāo)本檢測抗Ro-52抗體，以免疫印跡法作為參照，敏感性為100％。對健康獻(xiàn)血員（n＝50）的特異性為100％?？筊o-52抗體沒有疾病特異性，在肌炎、硬皮病和其它風(fēng)濕性疾?。?1-16）中均可出現(xiàn)陽性，如，20例硬皮病患者中有7例抗Ro-52抗體陽性。SS-B：14SS-BELISA為100SLE（n＝22）97％。18Scl-70ELISA為100％。對健康獻(xiàn)血員SLE風(fēng)濕病組n＝22n＝14n＝25）100％。（HEp-2/猴肝14PM-Scl抗體陽性。對健康獻(xiàn)血員的特異性為10SL風(fēng)濕病組MCTD2＝1，肌炎2）9％。5Jo-1ELISA100％。對健康獻(xiàn)血員（n＝50）100SLE風(fēng)濕病組（n＝38，MCTDn＝14）99％。CENPB20例用間接免疫熒光法猴肝）CENP1抗體陽性（9％。對健康獻(xiàn)血員（n＝50）100SLE風(fēng)濕病組（MCTDn＝22n＝14，25）97％。（HEp-2/猴肝1型的血清標(biāo)本，有13PCNA抗體陽性。對健康獻(xiàn)血員1SLE組（n＝83）dsDNA：對36例SLE患者血清標(biāo)本檢測抗dsDNA抗體，以ELISA作為參照，敏感性為94％。對健康獻(xiàn)血員（n＝50）和非SLE風(fēng)濕病組（干燥綜合征n＝14，硬皮病n＝18）的特異性為100％。ELISA97％（n＝14n＝18）的特異性為100％。組蛋白：對41例SLE患者血清標(biāo)本檢測抗組蛋白抗體，以ELISA作為參照，敏感性為78％。對健康獻(xiàn)血員（n＝50）的特異性為100％，對非SLE風(fēng)濕病組（干燥綜合征n＝14，硬皮病n＝18）的特異性為97％。核糖體P蛋白：對49例SLE患者的血清標(biāo)本檢測抗核糖體P蛋白抗體，以ELISA作為參照，敏感性為82％。對健康獻(xiàn)血員（n＝50）和非SLE風(fēng)濕病組（干燥綜合征n＝14，硬皮病n＝18）的特異性為100％。AMAM2：對26AMAM2ELISA為100（自身免疫性肝炎n=28,中毒性肝損害n=38B/Cn=69）99%。臨床意義：高滴度的抗U1-nRNP抗體是混合性結(jié)締組織病（MCTD，夏普綜合征）的標(biāo)志，陽性率為95-100％，抗體滴度與疾病活動性相關(guān)。在30-40％的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中也可檢出抗U1-nRNP抗體，但幾乎總伴有抗Sm抗體?？筍m抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特異性標(biāo)志，與抗dsDNA抗體一起，是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷指標(biāo)，但陽性率僅為5-10％?？筍S-A抗體與各類自身免疫性疾病相關(guān)，最常見于干燥綜合征40-8％、也見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡和原發(fā)性膽汁性肝硬化外，在100％的新生兒紅斑狼瘡中可出現(xiàn)抗SS-A抗體。該抗體可經(jīng)胎盤傳給胎兒引起炎癥反應(yīng)和新生兒先天性心臟傳導(dǎo)阻滯。由于抗Ro-52抗體可在各種自身免疫性疾病中出現(xiàn)，因而單獨(dú)的抗Ro-52抗體陽性不應(yīng)判斷為抗SS-A抗體陽性或作為SLE及干燥綜合征的特異性指標(biāo)?？筍S-B抗體幾乎僅見于干燥綜合征（40-80％）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（10-20％）的女性患者中，男女比例為29:1。在干燥綜合征中抗SS-A抗體和抗SS-B抗體常同時出現(xiàn)。抗Scl-70抗體見于25-75％的進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥（彌散型）患者中，因?qū)嶒灧椒ê图膊』顒有远?。在局限型硬化癥中不出現(xiàn)。在50-70%的所謂的重疊綜合征患者中可檢出PM-Scl肌炎PM、皮肌炎D）和進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥Sc。抗PM-Scl抗體在進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥（彌散型）3%，在多肌炎和皮肌炎中的陽性率為8%?？笿o-1抗體見于多肌炎，陽性率為25-35％。常與合并肺間質(zhì)纖維化相關(guān)。抗著絲點(diǎn)抗體與局限型進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥（CREST綜合征：鈣質(zhì)沉著、病、食管功能障礙、指硬皮病、遠(yuǎn)端血管擴(kuò)張）有關(guān)，陽性率為70-90%。抗PCNA抗體對系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有很高的特異性，但其陽性率僅為3％。dsDNASm抗體外，抗dsDNA可作為該病的一個血清學(xué)指標(biāo)，陽性率為40-90%。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中可檢出抗核小體抗體，但是，由于用傳統(tǒng)的核小體制品70SLE的特異性診斷指標(biāo)這一應(yīng)用價值受到了很大限制。歐蒙印跡法中用一種由歐蒙實驗室擁有的專利技術(shù)制備的新的核小體制品作為抗原基質(zhì)，這種改良的核小體制品純度高，經(jīng)電泳證實只含有核小體單體，不含H1Scl-70、其它非組蛋白和殘留的染色質(zhì)DNA成分。用該試劑進(jìn)行檢測時，抗核小體抗體對SLE的特異性幾乎為100和多肌炎患者血清不反應(yīng)。抗一種或幾種組蛋白抗體或抗H2A-H2B復(fù)合物抗體在藥物（其它藥物）誘導(dǎo)的紅斑狼瘡中比較常見（陽性率為95。另外，在30-7015-50%的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中也可檢出抗組蛋白抗體?？购颂求wP蛋白抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特異性標(biāo)志。在歐蒙的一個多中心研究中檢測了360（SL79（/和206份健康獻(xiàn)血員血清中的抗核糖體P（ARP