雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)三

雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)一目的要求1.復(fù)習(xí)鞏固免疫化學(xué)的基本知識(shí)2.熟練掌握免疫擴(kuò)散法的操作步驟3.掌握其在抗血清效價(jià)的測(cè)定和特異性抗體的分析中的應(yīng)用二實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖的疏散網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于大分子的自由遷移合適比例的抗原抗體結(jié)合后聚集形成沉淀；沉淀的產(chǎn)生阻止抗原抗體復(fù)合物的自由運(yùn)動(dòng)；沉淀帶形成一種特異性的半滲透性屏障，阻滯相同抗原抗體復(fù)合物，而允許不同的分子通過(guò)。沉淀線的特征與位置：

1抗原、抗體的特異性和濃度，

2抗原、抗體分子的大小

3擴(kuò)散率當(dāng)抗原體存在多種成分時(shí)，將呈現(xiàn)多條沉淀線以至交叉反應(yīng)線，因此可用來(lái)檢查抗原和免疫血清的特異性、純度或濃度比較抗原之間的異同點(diǎn)，因而應(yīng)用范圍較廣。1.雙擴(kuò)散用于疾病診斷：以IBD診斷為例，中心孔加IBD標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，周圍孔分別加IBD標(biāo)準(zhǔn)抗原、生理鹽水、待檢抗原1.2.3.4。2.雙擴(kuò)散用于抗體檢測(cè)：以免疫雞IBD抗體檢測(cè)為例，中心孔加IBD標(biāo)準(zhǔn)抗原，周圍孔分別加IBD標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、IBD陰性血清、待檢血清1.2.3.4。三操作步驟1．瓊脂玻板的制備梅花型打孔圖將溶化的1.5%瓊脂倒在培養(yǎng)皿中，使之能將表面覆蓋，制成厚度約2～3mm厚的瓊脂糖凝膠板，待冷卻后根據(jù)所需形狀打孔。（切勿劇烈振蕩融化后的瓊脂糖，防止氣泡的出現(xiàn)。）2．免疫擴(kuò)散及結(jié)果觀察注意：加樣至孔滿為止，不可外溢。待孔內(nèi)液體滲入凝膠后即可放于溫盒中。濕盒于37℃中，一般保溫24～48h，觀察抗原抗體產(chǎn)生的白色沉淀線。每孔加入抗原/抗體10μl四結(jié)果記錄五討論ABCDEFAgAb試討論以上六種情況中抗原和抗體的濃度差異以及在凝膠中的擴(kuò)散率大小（用＞、＜、≈表示）實(shí)驗(yàn)四

火箭免疫電泳【目的要求】1.復(fù)習(xí)鞏固免疫化學(xué)的基本知識(shí)2.熟練掌握火箭免疫電泳的操作步驟3.掌握其在抗血清效價(jià)的測(cè)定和特異性抗體的分析中的應(yīng)用。【實(shí)驗(yàn)原理】在電場(chǎng)作用下，抗原在含定量抗體的離子瓊脂糖中泳動(dòng)后，如二者比例合適時(shí)，可在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)錐形的沉淀峰，形似火箭狀，故又稱為火箭電泳。此沉淀峰的高度與抗原的濃度成正比，與抗體的濃度成反比。+10mm5mm【操作步驟】1.瓊脂糖玻板的制備

30ml1.5％的瓊脂糖懸液（0.45g瓊脂糖+0.025M的巴比妥緩沖液）→微波爐溶解→等溫度降到56℃時(shí)→加入200μl抗體→澆制瓊脂厚度為1～2mm抗體瓊脂板。2.抗原在稀釋板中倍比稀釋

1/1、1/2、1/4、1/8、待測(cè)樣品100ul抗原50ul1/1抗原50ul緩沖液50ul緩沖液50ul緩沖液50ul1/2抗原50ul1/4抗原1/11/21/41/8首先加入首先加入首先加入3．打孔、加樣火箭電泳試驗(yàn)示意圖待瓊脂凝固后，于距玻板一長(zhǎng)邊10mm處，以3mm孔徑打孔器打孔一排，孔距5mm。電泳前各孔中加入抗原液，每孔20μL。4．電泳：250伏1.5小時(shí)（濾紙搭橋）5．結(jié)果判定電泳結(jié)束