大鼠脊髓損傷BBB評(píng)分中文版

Westernblot試驗(yàn)操作步驟一、蛋白樣品制備1 用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下（不要將培養(yǎng)基倒掉） ，用吸管將其吸至離心管中用4℃預(yù)冷的PBS1ml沖洗培養(yǎng)瓶2次收集入上述離心管中1000rpm，離心10min倒掉上清，沉淀用1mlPBS重懸，轉(zhuǎn)入EP管中，再加1mlPBS沖洗離心管壁上殘留的細(xì)胞轉(zhuǎn)入EP管中4℃，4000rpm，離心5min倒掉上清液（用搶把殘余上清吸干凈）配制裂解液，計(jì)算所需用量，每個(gè)EP管中加入100ul裂解液(10mg組織/100ul)若有4管（4組），配制400ul裂解液：PMSF儲(chǔ)備液濃度100mM，用RIPA稀釋至1Mm.【單去污劑裂解液（PMSF）：1mol/LTris·HCl（pH8.0）2.5ml;NaCl0.438gTritonX-1000.5ml;蒸餾水至50ml;混勻后4℃保存】4℃裂解30-45min，每5min振蕩一次4℃14000g離心5min，取上清（移入1.5ml的EP管中）。蛋白定量（常用BCA法，參見蛋白定量試劑盒使用說(shuō)明）每管蛋白一致，分裝約20ul/管左右（加入5×buffer并用RIPA稀釋成1×）將蛋白樣100℃，變性5min，，-80℃（or-20℃）保存。二、SDS的配制：試劑及配制：（1）30%丙烯酰胺：丙烯酰胺 29g，N,N-亞甲基雙丙烯酰胺 1g，去離子水至100ml，過(guò)濾，避光，4℃貯存。（2）1.5mmol/LTris溶液（PH8.8）：稱取18.15gTris堿(分析純)加適量的超純水溶解，用濃鹽酸(分析純)調(diào)pH值至8.8，加超純水定容至 100ml，室溫儲(chǔ)存。（3）1.0mmol/LTris溶液（pH6.8）：稱取12.1gTris堿(分析純)加適量的超純水溶解，用濃鹽酸(分析純)調(diào)pH值至6.8，加超純水定容至 100ml，室溫儲(chǔ)存。（4）10%SDS：1gSDS加入10ml去離子水，室溫貯存。（5）10%過(guò)硫酸銨溶液：0.1g過(guò)硫酸銨加入1ml水，4℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。（6）TEMED（可購(gòu)買成品）（7）5×電泳緩沖液(Tankbuffer)：稱取15.14gTris堿(分析純)，72.1g甘氨酸(分析純)，5gSDS(分析純)，加適量的超純水溶解，pH值應(yīng)該在8.3左右，加超純水定容1000ml，室溫儲(chǔ)存。（8）分離膠、濃縮膠液配方：（兩個(gè)用小燒杯，用完立即刷）總體積5ml2ml5ml濃度12%分離膠5%濃縮膠10%分離膠水(ml)1.61.41.930%丙烯酰胺(ml)2.00.331.71.5mmol/LTris溶液(pH8.8)(ml)1.3—1.31.0mmol/LTris溶液(pH6.8)(ml)—0.25—10%SDS(ml)（透明）0.050.020.0510%過(guò)硫酸銨溶液(ml)0.050.020.05TEMED(ml)（鋪膠前加）0.0020.0020.002制膠程序：（小分子量）（1）裝板（小玻璃朝外）（2）配制分離膠，加TEMED后，充分混勻，立即注入玻璃板間隙，從一邊開始，并為濃縮膠留足夠空間（梳齒長(zhǎng)約1cm）。立即覆蓋蒸餾水至頂部，天冷可放入烤箱15-20分鐘，待分離膠聚合后，用濾紙吸去上面的水層，再灌入濃縮膠（配方見上表），插入樣品梳，避免氣泡出現(xiàn)。（3）待聚合后（約20分鐘），拔出樣品梳，將電極緩沖液注滿電泳槽的前后槽，在加樣孔中加入10-20ul樣品（蛋白量20ug左右）。左側(cè)第一孔加maker，樣品不夠可用laodingbuffer。電泳：接通電源，濃縮膠80伏約半小時(shí)，此后分離膠120/160伏繼續(xù)1小時(shí)左右。三、轉(zhuǎn)膜：1、轉(zhuǎn)移緩沖液的配制：（先用先配）試劑用量甘氨酸14.413gTris堿3.0285g無(wú)水甲醇40-200ml（蛋白量150以上加40）水至10002、轉(zhuǎn)膜程序：（1）剪4張濾紙，和一張PVDF膜，大小與凝膠相同（濾紙要比膠小，膜稍大以防轉(zhuǎn)膜時(shí)發(fā)生短路）。在膜的一角做一記號(hào)（或剪角）。（2）將剪好的膜依次序浸入 100%甲醇（10秒）→去離子水（5min）→轉(zhuǎn)移緩沖液（大于10min）。（3）濾紙和海綿（纖維）墊浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中（大于 10min）（4）剝膠，并將凝膠裁成合適大小，切角以做記號(hào)。（5）安裝轉(zhuǎn)膜裝置：從正極（紅色）→負(fù)極（黑色）依次為：白色邊盒→多孔墊片→（ 1~2張）濾紙→PVDF膜→凝膠→（1~2張）濾紙→多孔墊片→黑色邊盒?？凵系蹩酆蟛暹M(jìn)轉(zhuǎn)膜槽中。轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)加冰盒，防止電泳時(shí)過(guò)熱。（6）接通電源：恒流電轉(zhuǎn)移兩個(gè)小時(shí)，電流一般是 100mA（視蛋白大小而定）。（7）電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，將膜取出。四、封閉及免疫反應(yīng)（一）試劑的配制：1．5xTBS：（PH7.5）用時(shí)稀釋5倍試劑1000ml用量Tris-base6.05gNaCl43.83g去離子水至1000ml2．1xTBST：1xTBS+0.05%Tween-20試劑1000ml用量Tween-200.5ml1xTBS1000ml3．Blockingbuffer：1xTBST+5%DryMilk試劑100ml用量DryMilk5g1xTBST100ml（二）、免疫反應(yīng)程序：取膜（平頭鑷子，玻璃平皿），放入10mlBlockingbuffer（封閉緩沖液），室溫輕搖2h，或4℃過(guò)夜。一抗孵育，用TBST配制，1:1000（比例須看說(shuō)明書，裝入塑封袋中趕凈氣泡后用封口機(jī)封口），室溫?fù)u床上孵育1h后4℃過(guò)夜。用TBST室溫洗膜10min×3次二抗孵育。用Tbst稀釋，1:2000（比例須看說(shuō)明書，方法同上），室溫輕搖45min-2h。用TBST洗膜10min×3次。五、顯影：試劑（1） 超敏發(fā)光液（ECL）（A、B液等比混合）（2） 顯影液：顯影粉（按說(shuō)明書配制）（3） 定影液：定影粉（按說(shuō)明書配制）顯影程序（1）發(fā)光液工作液的配制：等體積混合適量A液（200ul）和B液(200ul)，視膜大小而定，直接在保鮮膜上混合。（2）顯色反應(yīng)：將膜取出，用吸水紙略吸去過(guò)多的液體（切勿接觸膜的蛋白面），然后置于保鮮膜上，浸入并與發(fā)光液均勻充分地接觸。（3）壓片檢測(cè)：將膜固定于暗盒內(nèi)（蛋白面朝膠片）。暗盒內(nèi)放入膠片，壓片曝光。（壓片時(shí)間要摸索，15s-過(guò)夜）（4）顯影：膠片放入顯影液，觀察顯影情況。（時(shí)間視顯影情況而定）（5）定影：膠片放入定影液，2-10min。流水沖洗，干燥保存六、ECL膜再生試劑膜再生液：（500ml）SDS：10g；Tris：3.62g（Tris堿）；H2O：400ml調(diào)PH值6.7；定容至500ml；加250μlβ-巰基乙醇。膜再生程序：（1） TBST洗膜10min×3次（2） 用時(shí)將膜浸在膜再生液中， 60℃水浴30min（搖床）（3） TBST洗膜10min×3次（4） 封閉液封閉法脊髓損傷的行為學(xué)評(píng)分評(píng)估大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。將動(dòng)物放置于平臺(tái)上,觀察記錄其后肢的行走及肢體活動(dòng)。評(píng)分分三部分第一部分為0一7分,評(píng)判動(dòng)物后肢各關(guān)節(jié)活動(dòng)第二部分為8一13分,評(píng)判后肢的步態(tài)及協(xié)調(diào)功能第三部分為14一21分,評(píng)判運(yùn)動(dòng)中爪的精細(xì)動(dòng)作,三項(xiàng)滿分為21分.定義：將動(dòng)物放入一開口盆中，輕敲盆壁，使其爬行，觀察動(dòng)物的臀、膝、踝關(guān)節(jié)行走、軀干運(yùn)動(dòng)及其協(xié)調(diào)情況。無(wú)可觀察到的后肢運(yùn)動(dòng)1或2個(gè)后肢關(guān)節(jié)輕度活動(dòng)，一般為髖關(guān)節(jié)/膝關(guān)節(jié)。1個(gè)后肢關(guān)節(jié)大幅運(yùn)動(dòng)和另一關(guān)節(jié)輕度活動(dòng)2個(gè)后肢關(guān)節(jié)大幅運(yùn)動(dòng)所有3個(gè)后肢關(guān)節(jié)輕度活動(dòng)2個(gè)后肢關(guān)節(jié)輕度運(yùn)動(dòng)和第3個(gè)關(guān)節(jié)大幅運(yùn)動(dòng)2個(gè)后肢關(guān)節(jié)大幅運(yùn)動(dòng)，第3個(gè)關(guān)節(jié)輕度活動(dòng)所有3個(gè)后肢關(guān)節(jié)大幅運(yùn)動(dòng)不負(fù)重?cái)[動(dòng)，或足底著地，但不負(fù)重僅站立的時(shí)候足底負(fù)重或偶爾/頻繁/持續(xù)以足背負(fù)重步行，無(wú)足底負(fù)重步行偶見負(fù)重步行，但前、后肢不協(xié)調(diào)由頻繁到持續(xù)負(fù)重步行，但無(wú)前、后肢協(xié)調(diào)由頻繁到持續(xù)負(fù)重步行，偶見前、后肢協(xié)調(diào)由頻繁到持續(xù)負(fù)重步行，頻繁前、后肢協(xié)調(diào)持續(xù)協(xié)調(diào)足底步行，優(yōu)勢(shì)爪在剛觸地和抬起時(shí)旋轉(zhuǎn)頻繁足底步行，持續(xù)前、后肢協(xié)調(diào)，偶爾足背側(cè)步行持續(xù)協(xié)調(diào)足底步態(tài)，當(dāng)前肢向前時(shí)無(wú)或偶有伸趾，優(yōu)勢(shì)爪剛觸地時(shí)平行持續(xù)協(xié)調(diào)足底步態(tài)，頻繁伸趾，優(yōu)勢(shì)爪觸地時(shí)平行，抬起時(shí)旋轉(zhuǎn)持續(xù)協(xié)調(diào)足底步態(tài)，頻繁伸趾，優(yōu)勢(shì)爪在觸地及抬起時(shí)均平行持續(xù)協(xié)調(diào)足底步態(tài)，持續(xù)伸趾，優(yōu)勢(shì)爪在觸地及抬起時(shí)均平行基本內(nèi)容同18，尾在部分或全部觀察期中下垂基本內(nèi)容同18，尾持續(xù)上翹，但軀體不穩(wěn)春天的風(fēng)是有靈性的，依著風(fēng)的眼眸，我看到了那一株株桃花讀信的倩影，在桃林深處，紫色的青藤爬滿那個(gè)小屋。我的小城，桃花已然開成海，像是一場(chǎng)粉色的春夢(mèng)。是否，可以赴一場(chǎng)最美的相逢，如是，便不負(fù)曾經(jīng)許下的約定。守住心底最美風(fēng)景，是一種風(fēng)度，一種期望。讓心，隨花兒輕舞，讓夢(mèng)，隨蝶兒翩躚。等一縷柔風(fēng)載滿詩(shī)意，落滿我的小院，好想，牽著你的手走在花開的路上，臨摹又一個(gè)春的相遇，陌上綠色蔓延，讓深情的詩(shī)句落在眉彎，打開靈魂的心門，寫盡情意綿綿。春雨如絲，暖了一季寒涼露出溫暖，碧水映藍(lán)天，云朵兒似乎摸到嫩草尖尖?；ㄏ闶?，暗香盈袖。我們微笑著，不說(shuō)話，就十分美好。生命里，總會(huì)有一些人，漸行漸遠(yuǎn)，偶爾想起，卻只是停留在文字里，那一抹淡淡的回憶。唯有春天，總那么詩(shī)意明亮，始終暈染著眉心，讓澀澀的往事隨風(fēng)，讓一些溫暖的記憶溫潤(rùn)著心房。珍惜眼前的幸福，緊握手中的暖意，面向青山綠水，一路微笑，一路行走 ??情暖山水間，盈一份詩(shī)意于心田，以云的飄逸輕盈過(guò)往，以花的姿態(tài)擁馨香滿懷，以文字的杯盞邀約一曲細(xì)水長(zhǎng)流。煮一壺春色，與時(shí)光對(duì)語(yǔ)。窗前，柳枝兒發(fā)芽，玉蘭含苞，時(shí)光一直繞指馨香。心念如這徐徐春風(fēng)，蕩漾成一片流云。春落人間，一種別樣的景致美了心境，所有的疲憊與憂愁也隨風(fēng)而去，微笑著面對(duì)生活，用內(nèi)心的那份熱情，那份純真來(lái)經(jīng)營(yíng)生活，來(lái)創(chuàng)造幸福，何嘗不是一種快樂？我的流年，風(fēng)過(guò)，紅塵入畫；雨落，纏綿入心。行走在春天里，眼里滿是明麗與清澈，一樹一樹的花開，細(xì)碎而芬芳；一片一片的綠地，靜美而清新。嗅著陽(yáng)光的味道，把自己置身于大自然中，真好！只要心足夠明媚，縱然有小小的陰霾也無(wú)妨。我們一路走來(lái)，沿途總會(huì)有美麗的風(fēng)景。于喧囂紅塵中，守著心靈的一方山水。不亂于心，不困于情，不畏將來(lái)，不念過(guò)往。春水初生，耐人尋味。春雨如絲，絲如媚，綿綿的不著一點(diǎn)兒聲息。踏春而去，不知是哪一處的紅塵山水在心間已布滿了雅致，心如花開，一朵嫻雅的光陰，柔軟著眼