項目一-核酸的生產(chǎn)精講學習資料

項目一--核酸的生產(chǎn)精講核酸的化學組成1.核酸的元素組成：組成核酸的主要元素有：C、H、O、N、P等，其中P的含量最大，約占總量的9%~10%。2.核酸的基本組成單位：核苷酸（單核苷酸）RNA和DNA都是以單核苷酸為基本單位所組成的多核苷酸長鏈，核苷酸是由戊糖、磷酸和含氮堿基三類成分構成的。1.一般性質（核酸的分子大小、形狀、黏度、溶解度）2.核酸的酸堿性3.核酸的變性、復性和分子雜交：4.核酸雜交：核酸的物理化學性質核酸的水解產(chǎn)物：核酸核苷酸磷酸核苷戊糖核糖脫氧核糖含氮堿嘌呤堿嘧啶堿核酸的生理功能基因的核苷酸序列決定了蛋白質的氨基酸序列，同時核酸還可自我復制傳遞給子代，因此在每個生物體中，核酸是遺傳信息的載體和各種生命活動信息指令的根本來源。中心法則：第二章核酸的制備和應用制備途徑及選擇材料：有三種途徑，分別是從生物組織中直接分離提取、選育高產(chǎn)核酸類物質的微生物菌種通過發(fā)酵法制得、化學合成。應用較多的主要是前兩種。大多數(shù)核酸在細胞中是以蛋白質結合的狀態(tài)存在，因此在制備核酸時要將它雨蛋白質分離開。選材：選用生長較旺盛的組織，如胰、脾、胸腺等，這類組織比同樣體積的其他組織，如肌肉等組織含有更多的細胞數(shù)，核酸的含量較高。

核酸制備的基本步驟破碎細胞提取純化核酸分離純化的一般原則1.保持核酸分子一級結構的完整性，是核酸結構與功能的最基本要求。2.排除其他分子的污染，保證核酸的純度。核酸的提取、分離純化從動植物組織和微生物中提取核酸一般原則是首先要破碎細胞，提取核蛋白，然后把核酸和蛋白質分離，再沉淀核酸進行純化。核酸屬于大分子化合物，具有復雜的空間三維結構，為了使得到的核酸保持天然狀態(tài)，在提取分離是要注意避免強酸、強堿對核酸的降解，避免高溫、機械剪切力對核酸空間結構的破壞，操作時在溶液空間中加入核酸酶抑制劑，整個操作過程要在低溫（0°C左右）條件下進行，同時還要注意避免劇烈的攪拌。包括：1）核蛋白的提取2）核蛋白中蛋白質的去除3）核酸的分離純化核酸含量的測定方法及原理1．紫外分光光度法核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵系統(tǒng)，能吸收紫外光，RNA和DNA的紫外吸收高峰在260nm波長處。一般在260波長下，每1毫升含1μgRNA溶液的光吸收值為0.022，每1毫升含1μgDNA溶液的光吸收值約0.020，故測定未知濃度RNA或DNA溶液在260nm的光吸收值即可計算出其中核酸的含量。此法操作簡單、迅速。若樣品內混雜有大量的核苷酸或蛋白質等能吸收紫外光的物質，則測光誤差較大，故應設法事先除去。2.定磷法核酸分子結構含有一定比例的磷（RNA的含磷量約8.5%~9.0%，DNA含磷量約9.2%）測定其含磷量即可求出核酸的量。核酸分子中的有機磷經(jīng)強酸消化后形成無機磷，在酸性條件下，無機磷與鉬酸銨結合成黃色磷鉬酸銨沉淀，當有還原劑存在時，Mo從+6被還原為+4價，+4價的Mo再與試劑中的其他MoO4結合成Mo(MoO)2或Mo3O8,呈藍黑色，稱為鉬藍。在一定濃度范圍內，藍色的深淺與磷含量成正比，可用比色法測定。若樣品中尚含有無機磷，需做對照測定，消除無機磷的影響，以提高準確性。3．定糖法（1）地衣酚顯色法測定RNA含量:RNA與濃鹽酸共熱時發(fā)生降解，產(chǎn)生的核糖又可轉變?yōu)榭啡贔eCl3或CuCl2催化下，糠醛與3,5—二羥基甲苯（地衣酚，苔黑酚）反應形成綠色復合物，該產(chǎn)物在670nm處有最大吸收值。當RNA濃度為20~250μg/ml時，光密度與RNA度成正比。（2）二苯胺法測定DNA含量

DNA分子中有2—脫氧核糖殘基在酸性溶液中加熱降解，產(chǎn)生2—脫氧核糖并形成ω－羥基－?－酮基戊醛，后者與二苯胺試劑反應生成藍色化合物，藍色化合物在595nm處有最大吸收，且DNA在40~400μg范圍內時，光密度與DNA濃度成正比。在反應液中加入少量乙醛，可以提高反應靈敏度。第三章RNA和DNA的提取及測定一、RNA的提取和含量測定由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也各異。一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法是實驗室中最常見的。組織勻漿用苯酚處理離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質則留在酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出。酵母含RNA達2.67~10%，而DNA含量僅為0.03~0.516%，為此，提取RNA多以酵母為原料。

RNA含量的測定，多以地衣酚法。制取方法1、材料：干酵母粉2、試劑：0.2%NaOH溶液，0.05mol/LNaOH溶液，乙酸，95%乙醇，無水乙醚。3、器材：容量瓶、吸量管、量筒（10,50mL）、沸水浴、離心機、布氏漏斗、抽濾瓶、石蕊試紙。4、操作流程酵母RNA提取稱4g干酵母粉置于100mL燒杯中，加入40mL0.2%NaOH溶液，沸水浴加熱30min，經(jīng)常攪拌。然后加入數(shù)滴乙酸溶液使提取液呈酸性（石蕊試紙檢查），4000r/min離心10~15min.取上清液，加入30mL95%乙醇，邊加邊攪動，后靜置，待RNA沉淀完全后，布氏漏斗抽濾。濾渣先用95%乙醇洗兩次，每次用10mL。再用無水乙醚洗兩次，每次10mL，洗滌時可用細玻璃棒小心攪動沉淀。最后再用布氏漏斗抽濾，沉淀在空氣中干燥。稱量所得RNA粗品的重量。RNA地衣酚顯色測定標準曲線的制作：去12支烘干試管，按下表編號及加入試劑。平行做兩份。畢置沸水浴加熱25分鐘，取出冷卻，以零號管作對照，于670nm波長處測定光吸收值。取兩管平均值，以RNA濃度為橫坐標，光吸收為縱坐標作圖，繪制標準曲線。 試管編組（x2）

試劑012345標準RNA溶液/mL00.40.81.21.62.0蒸餾水/mL2.01.61.20.80.40.0地衣酚—Cu2+/mL2.02.02.02.02.02.03）、樣品的測定

取2支試管，各加入2.0

ml樣品液，再加2.0

ml地衣酚—Cu2+試劑，如前述進行測定。4）、RNA含量的計算根據(jù)測得的光吸收值，從標準曲線上查出相當該光吸收的RNA含量。按下式計算出制品中RNA的百分含量：

待測液中測得的RNA含量（μg/mL）*100%RNA%=待測液中制品的含量（μg/mL）二、DNA的提取和含量測定

DNA主要集中在細胞核內，因此通常選擇細胞核含量比例大的生物組織作為提取紙杯DNA的材料。本實驗中選取豬肝作為實驗材料，用濃鹽法法制備DNA。制取方法1.材料：新鮮的豬肝2.試劑：0.1mol/LNaCL-0.05mol/L檸檬酸鈉混合液0.015mol/LNaCl-0.0015mol/L檸檬酸三鈉溶液、95%乙醇、NaCl固體、5%SDS、氯仿、DNA標準液、二苯胺試劑操作流程1）取新鮮的豬肝，稱20g，剔除結締組織，用0.1mol/LNaCl、0.05mol/L檸檬酸鈉溶液沖洗除去血水，在冰浴上剪成碎末。2）加入2倍組織重的0.1mol/LNacl、0.05mol/L檸檬酸鈉混合液（40mL）置高速組織搗碎機內破碎細胞膜，獲得組織漿液。3）組織漿液于3000r/min離心15min，棄去上層液，收集沉淀（包括細胞核）。4）向細胞核沉淀中加入6倍組織重的10%（1.71mol/L）NaCl溶液120mL,充分攪勻，置冰箱內過夜。5）次日將所得的半透明粘稠狀液體連續(xù)注入預冷的11倍體積（1320mL）蒸餾水中，輕輕搖勻，DNP（脫氧核糖核蛋白）即呈絮狀沉淀析出，置于冰箱內放置數(shù)小時。6）上層清夜利用虹吸法析出，剩余含有沉淀的少量溶液經(jīng)離心（3000r/min,10min）,收集DNP沉淀。7）將DNP沉淀再溶于原組織重約4倍體積（80mL）的10%NaCl溶液中，輕輕攪拌加速溶解。8)加入1/2體積的氯仿-異戊醇溶液40mL，上下劇烈震蕩10min，使組蛋白分離，于3000r/min，離心10min。析出上面含有DNA和DNP的水層，棄去兩層間的變性蛋白凝膠，回收下層有機相。9）上層水再次加入20mL氯仿-異戊醇混合液，繼續(xù)抽提取出蛋白質，多次重復操作直至兩相之間無明顯變性蛋白質凝膠生成。10）最后吸出上清液并將它連續(xù)注入體積預冷至4°C的95%乙醇中。11）用玻璃棒小心撈出纖維狀DNA鈉鹽沉淀，瀝干乙醇溶液后，依次用80%~95%乙醇洗滌，最后用少量無水乙醇洗滌，輕輕壓擠沉淀，盡量吸盡乙醇后，鋪開在表面皿上。置真空干燥器內干燥，即得白色纖維狀的DNA鈉鹽。二、DNA含量的測定1）標準曲線的制定取14只試管，分成7組按下表操作

1234567DNA含量/μg04080160240320400DNA標準溶液/mL00.20.40.81.21.62.0蒸餾水/mL2.01.81.61.20.80.40二苯胺試劑/mL4.04.04.04.04.04.04.0混勻，60°C恒溫水浴保溫1h，冷卻后595nm處比色A595

每組取兩管光吸收平均值，以DNA濃度為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線。2）樣