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認(rèn)證信息

認(rèn)證類型：個人認(rèn)證

認(rèn)證主體：雷**（實(shí)名認(rèn)證）

IP屬地：湖北

IP屬地：湖北 上傳時間：2023-01-14 格式：PPT 頁數(shù)：33 大?。?.04MB 積分：28 舉報 版權(quán)申訴

如何構(gòu)建質(zhì)?？寺?/p>

周鴻雁2011.06.15目的基因目的載體BaxpCMV-Sport6EcoRⅠBglⅡ連接Bax基因至EGFP載體思路加入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)加入BglⅡ酶切位點(diǎn)連接↑酶切↑目的基因兩側(cè)加入酶切位點(diǎn)MCS多克隆位點(diǎn)BaxpCMV-Sport6缺點(diǎn)：無熒光：GFP、Dsred無標(biāo)簽:Flag、HA、MycpCMVSPORT6MCSGene：BAXMGC:20956,IMAGE:4578562Insertsite：EcoRI,XhoI

構(gòu)建過程★設(shè)計引物(增加酶切位點(diǎn),BglⅡ,EcoRⅠ)目的基因PCR雙酶切載體(BglⅡ,EcoRⅠ)瓊脂糖凝膠電泳DNA膠回收(基因,載體)雙酶切目的基因(BglⅡ,EcoRⅠ)目的基因與載體相連DH5α轉(zhuǎn)化鑒定第一步：

設(shè)計目的基因PCR引物

目的：

1）通過PCR方法擴(kuò)增目的基因

2）在目的基因片斷兩端增加酶加位點(diǎn)★酶切位點(diǎn)旁需加入保護(hù)堿基設(shè)計引物前需解決的問題?1、選擇酶切位點(diǎn)?2、選擇保護(hù)堿基?3、終止密碼子PEGFPMCS選擇酶切插入位點(diǎn)：1、兩個酶切位點(diǎn)間隔遠(yuǎn)2、目的基因序列中無相應(yīng)酶切位點(diǎn)3、酶切緩沖液一致▲▲▲▲▲BAXinsertsequenceatggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggcccaccagctctgagcagatcatgaagacaggggcccttttgcttcagggtttcatccaggatcgagcagggcgaatggggggggaggcacccgagctggccctggacccggtgcctcaggatgcgtccaccaagaagctgagcgagtgtctcaagcgcatcggggacgaactggacagtaacatggagctgcagaggatgattgccgccgtggacacagactccccccgagaggtctttttccgagtggcagctgacatgttttctgacggcaacttcaactggggccgggttgtcgcccttttctactttgccagcaaactggtgctcaaggccctgtgcaccaaggtgccggaactgatcagaaccatcatgggctggacattggacttcctccgggagcggctgttgggctggatccaagaccagggtggttgggacggcctcctctcctactttgggacgcccacgtggcagaccgtgaccatctttgtggcgggagtgctcaccgcctcactcaccatctggaagaagatgggctgaenzymeBAXbufferSalⅠ0XhoⅠ12,3,4EcoRⅠ01,2,3,4BamHⅠ1BglⅡ03PstⅠ0BclⅠ0**DNAStar軟件-MapDraw功能AGATCT----BglⅡbuffer3GAATTC----EcoRIbuffer3AGATCT目的基因CTTAAGAGATCT---目的基因---CTTAAGPCR產(chǎn)物產(chǎn)物酶切效率低、不準(zhǔn)確！！酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基protectionseqence:

GGAAGATCTTCC

2h=25%,20h>90%

CCGGAATTCCGG

2h>90%,20h>90%切割率提高酶切活性、增加酶切效率、縮短酶切時間保護(hù)堿基:

限制性內(nèi)切酶識別特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白還要占據(jù)識別位點(diǎn)兩邊的若干個堿基，這些堿基對內(nèi)切酶穩(wěn)定的結(jié)合到DNA雙鏈并發(fā)揮切割DNA作用是有很大影響設(shè)計引物原則引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，引物序列的GC含量一般為40-60%2.引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳3.避免引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)4.引物的特異性5.堿基隨機(jī)分布cggcggtgatggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggcc

Primer1ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG(length---21,GC%---71.8%,Tm---71.4)ggagtgctcaccgcctcactcaccatctggaagaagatgggctg

aggcccccagPrimer2

TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG(length---25,GC%---52%,Tm---68.4)設(shè)計引物Primer5軟件引物中是否應(yīng)包含終止密碼子？MCS在EGFP之后表達(dá)，需加終止密碼子MCS在DsRed之前表達(dá)，不可以加終止密碼子加入保護(hù)堿基及酶切位點(diǎn)Primer1GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAGPrimer2

CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG★MCS與熒光相連的地方應(yīng)特別注意有無移碼調(diào)整開放閱讀框（ORF）熒光表達(dá)在前時(EGFP)Primer1GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAGPrimer2CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG因TGA為終止密碼子，所以之后的移碼不需理會熒光表達(dá)在后時(DsRed)Primer1CCGGAATTCatggaggcgctaattcctgtcPrimer2CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg熒光表達(dá)在后時需加KOZAK序列Primer1CCGGAATTCgccaccatggaggcgctaattcctgtcPrimer2

CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccggKOZAK序列:gccacc,加在起始密碼子之前PrimerfinalPrimer1GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAGPrimer2CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG33.5uLdH2O10uLphusionHFbuffer1uLdNTP(10mM)2.5uLprimerforward/reward1uLBAX1.5ulDMSO0.5uLphusionpolymerase50uL

1.98℃(1min)2.98℃(5s)3.65℃(20s)4.72℃(20s)5.backtostep2for25times6.72℃(10min)7.18℃forever第二步：PCR目的基因Phusion超保真PCR試劑盒Buffer3:2ulvector:4ul100%BSA:0.2ulEcoRⅠ:1ulBglⅡ:2ulddH2O:10.8ul37℃4hEcoRⅠBglⅡ第三步：雙酶切載體20ul第四步：瓊脂糖凝膠電泳、

凝膠回收0.6%gel6*loadingbuffer50ulsample80V目的基因5kb2.5kb載體瓊脂糖濃度%DNA分離范圍0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～3Buffer3:2ulBAX:15ul100%BSA:0.2ulEcoRⅠ:0.5ulBglⅡ:1ulddH2O:1.3ul37℃4h第五步：雙酶切及回收目的基因20ulTAKARA片斷回收試劑盒第六步：回收效率驗(yàn)證5kb2.5kbLoadingvolume:5ulFromlefttoright:Marker:15000bpEGFPBAXrestrictionBAXPCRMarker:100bpT4ligasebuffer:2ulT4ligase:1ulBax:3ulvector:1ulddH2O:13ulT4ligasebuffer:2ulT4ligase:1ulBax

:6ulvector

:1ulddH2O:10ulT4ligasebuffer:2ulT4ligase:1ulBax

:10ulvector

:1ulddH2O:6ul(1)(2)(3)16℃過夜第六步：連接載體100ng:100x目的基因分子量載體分子量X4/1~10/1目的基因的量為:第七步：轉(zhuǎn)化

100ulDH5α+20ul連接產(chǎn)物第八步：驗(yàn)證(1)PCR1-1213-24Positive:2,7,9,105.4uLdH2O2uLphusionHFbuffer0.2uLdNTP(10mM)0.5uLprimerforward0.5uLprimerreward1uL菌液稀釋液0.3ulDMSO0.1uLphusionpolymerase10uL