第六、七章植物細(xì)胞及原生質(zhì)體培養(yǎng)

植物細(xì)胞及原生質(zhì)體培養(yǎng)第一節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)（plantcellculture）：指對(duì)植物器官或愈傷組織上分離出來(lái)的單細(xì)胞(或小細(xì)胞團(tuán))進(jìn)行培養(yǎng)，形成單細(xì)無(wú)性系或再生植物的技術(shù)。植物細(xì)胞培養(yǎng)的意義：（1）研究細(xì)胞生理代謝過(guò)程及各種影響因子；（2）用于植物品種的改良（細(xì)胞株遺傳轉(zhuǎn)化）；（3）用于植物次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)。單細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)一、單細(xì)胞培養(yǎng)（通常以葉片為材料）（一）單細(xì)胞的分離 分離方法：機(jī)械法（薄壁細(xì)胞組織排列松散，細(xì)胞間接觸少）和酶解法（利用專(zhuān)一性水解酶降解細(xì)胞間中膠層）。各有優(yōu)缺點(diǎn)。（二）單細(xì)胞培養(yǎng) 對(duì)分離得到的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)其分裂增殖，形成細(xì)胞團(tuán)，再通過(guò)細(xì)胞分化形成芽、根等器官或胚狀體，直到長(zhǎng)成完整植株的技術(shù)。

培養(yǎng)方法：平板培養(yǎng)（淺層液體培養(yǎng)和固體平板培養(yǎng)）、看護(hù)培養(yǎng)、微室培養(yǎng)、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)法。（1）平板培養(yǎng)法：分散的植物細(xì)胞接種于含薄層固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)過(guò)程稱(chēng)為平板培養(yǎng)法。方法是將經(jīng)機(jī)械破碎過(guò)篩或酶(纖維素酶及果膠酶等)消化分散純化的細(xì)胞，經(jīng)計(jì)數(shù)及稀釋?zhuān)臃N到加熱熔化而剛冷卻至35℃左右的固體培養(yǎng)基中充分混勻，傾入培養(yǎng)皿中，石蠟密封，于25℃培養(yǎng)，約20天后細(xì)胞即可生長(zhǎng)成團(tuán)。統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)情況。（2）看護(hù)培養(yǎng)法：從懸浮培養(yǎng)物或脆弱愈傷組織上用針或玻璃毛細(xì)管分離單細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞放在一個(gè)方形濾紙片的上表面，而濾紙片放在活躍生長(zhǎng)的愈傷組織上進(jìn)行培養(yǎng)的方法。（3）微室培養(yǎng)法：懸浮單細(xì)胞接種于凹玻片或玻璃環(huán)與蓋玻片組成的微室內(nèi)的固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。（4）條件培養(yǎng)基培養(yǎng)：條件培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入高密度的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。一定時(shí)間后這些細(xì)胞就會(huì)向培養(yǎng)基中分泌一些物質(zhì)，使培養(yǎng)基條件化。這樣的培養(yǎng)被利用來(lái)進(jìn)行某些單細(xì)胞的培養(yǎng)的方法。條件培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：將液體培養(yǎng)中培養(yǎng)了4~6周的高密度細(xì)胞濾掉，將該培養(yǎng)基制成液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基用來(lái)培養(yǎng)單細(xì)胞或低密度細(xì)胞群體，可明顯提高單細(xì)胞培養(yǎng)物存活和分裂能力。二、細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)(cellsuspensionculture)

是指將游離的植物細(xì)胞按一定的細(xì)胞密度，懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法。適宜于大規(guī)模培養(yǎng)，細(xì)胞工程產(chǎn)業(yè)的技術(shù)基礎(chǔ)。（一）細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程：

1.擇適宜的外植體；

2.誘導(dǎo)疏松愈傷組織；

3.選擇適宜的培養(yǎng)基；

4.懸浮培養(yǎng)；

5.懸浮細(xì)胞的繼代與選擇；

6.懸浮細(xì)胞的同步化；

7.懸浮愈傷組織形成及植株再生。

（二）懸浮培養(yǎng)類(lèi)型：

1.分批培養(yǎng)(Batchculture)：

分批培養(yǎng)是在一個(gè)封閉的系統(tǒng)中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)物增加到一定量時(shí)，需繼代培養(yǎng)，即取出少量培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)液中。 生長(zhǎng)過(guò)程與微生物類(lèi)似，有延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減慢期及靜止期等階段。接種時(shí)細(xì)胞要達(dá)到一定細(xì)胞濃度，通常為0.25xl06細(xì)胞／ml-0.5x106細(xì)胞／m1。

B.半連續(xù)培養(yǎng)：是利用培養(yǎng)罐等裝置進(jìn)行細(xì)胞大量培養(yǎng)的一種方式。在半連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)容器內(nèi)細(xì)胞增殖到一定數(shù)量后，倒出一半細(xì)胞懸浮液于另一培養(yǎng)罐等容器，再分別加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。半連續(xù)培養(yǎng)能夠重復(fù)獲得大量均一的培養(yǎng)細(xì)胞供進(jìn)一步利用。C.連續(xù)培養(yǎng)(Continuousculture):

是用一定容積的非密閉系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)過(guò)程中不斷注入新鮮培養(yǎng)基，而使?fàn)I養(yǎng)物連續(xù)得到補(bǔ)充，細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖連續(xù)進(jìn)行，同時(shí)有等體積的培養(yǎng)物排除系統(tǒng)。分為封閉型和開(kāi)放型（恒濁、恒化培養(yǎng)）連續(xù)培養(yǎng)兩種。恒濁培養(yǎng)恒化培養(yǎng)

（三）優(yōu)良懸浮培養(yǎng)體系要求：

A.懸浮培養(yǎng)物分散性好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般由幾十個(gè)以下的細(xì)胞組成。

B.均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。

C.生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的量一般2—3天甚至更短時(shí)間便可增加一倍。三、細(xì)胞培養(yǎng)的特性：

1.植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大，具有纖維素細(xì)胞壁，抗剪切力差；

2.細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，易受微生物污染，有時(shí)需用抗生素；

3.細(xì)胞生長(zhǎng)的中期及對(duì)數(shù)期，易凝聚為直徑達(dá)350um一400um的團(tuán)塊，懸浮培養(yǎng)較困難；

4.培養(yǎng)時(shí)需供氧，培養(yǎng)液粘度大，不能耐受強(qiáng)力通風(fēng)攪拌；并具有群體效應(yīng)

5.培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，且產(chǎn)量較低，培養(yǎng)過(guò)程具有結(jié)構(gòu)與功能全能性。1

四、植物細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求及培養(yǎng)基１.營(yíng)養(yǎng)需求：

植物細(xì)胞生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)較微生物細(xì)胞復(fù)雜，除水分外，其它營(yíng)養(yǎng)成分可分為如下幾類(lèi)：

(1)無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng):如N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I等；

(2)維生素：如維生素B1、B6、煙酸、肌醇、生物素、泛酸鈣及葉酸等；

(3)碳源:如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等；

(4)天然物:

如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、荸薺汁、生梨汁及蘋(píng)果汁等；

(5)植物激素:如生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸；其它有油菜素內(nèi)酯、三十烷醇、肽類(lèi)、半支蓮醇、月光花素、石蒜素、玉米素等；(6)氨基酸類(lèi):如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、賴(lài)氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、組氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氯酸、蘇氨酸、酪氨釀、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等；(7)核酸及其水解物:如DNA、RNA、黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤及胸腺嘧啶等；(8)其它成分:如氯化膽堿、膽質(zhì)素、膠氨酸、蘋(píng)果酸及反丁烯二酸等.2.培養(yǎng)基：

(1)固體培養(yǎng)基：添加瓊脂等

(2)液體培養(yǎng)基：不加瓊脂等第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用一、植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)

天然植物成分生產(chǎn)、生物轉(zhuǎn)化二、突變體的選擇

直接選擇、間接選擇三、誘導(dǎo)多倍體四、生產(chǎn)人工種子SyntheticseedsofMulberryandbanana（云杉海藻酸鈣凝膠）人工種子的保存是難點(diǎn)！第七章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)及細(xì)胞融合植物原生質(zhì)培養(yǎng)和細(xì)胞融合可用產(chǎn)生遠(yuǎn)緣雜種；是目前植物細(xì)胞及基因工程的核心技術(shù)。一、植物原生質(zhì)體培養(yǎng)通過(guò)一定方法除去細(xì)胞壁，而得到一個(gè)裸露的植物細(xì)胞，即為原生質(zhì)體(Protoplast)。游離的原生質(zhì)體像正常的植物細(xì)胞那樣具有全能性，在一定條件下培養(yǎng)可以重新再生出完整植株。

自1970年首次獲得煙草原生質(zhì)體再生植株成功以來(lái)，通過(guò)原生質(zhì)體獲得再生植株的植物約有280余種，其中有20種為我國(guó)首先報(bào)道。原生質(zhì)體培養(yǎng)包括原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)、植株再生等過(guò)程。(一)原生質(zhì)體的制備：1、材料來(lái)源與預(yù)處理：（1）材料來(lái)源：可以用各種組織和器官，但多應(yīng)用葉片、愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。以及莖尖、根尖、子葉和胚性組織。

（2）預(yù)處理：

A.預(yù)質(zhì)壁分離：17-20℃酶液中靜置半小時(shí)，再于28-34℃保溫，或?qū)⒉牧现糜谂c酶液中糖濃度相同的溶液中預(yù)培養(yǎng)1h左右，再浸于酶液中消化即可達(dá)到質(zhì)壁分離目的；

B.預(yù)培養(yǎng):

將除去下表皮的葉片于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，再用酶消化去壁，所得原生質(zhì)體分裂頻率較高；

C.暗處理:將室溫下生長(zhǎng)5-7個(gè)星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其葉片制備的原生質(zhì)體有活力；

D.光處理:將葉片于日光或燈光下照射2—6h令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生質(zhì)體分離；

E.低溫處理:夏季應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)材料其萌動(dòng)種子應(yīng)于4℃過(guò)夜后再播種，從其植株葉片上分離的原生質(zhì)體培養(yǎng)效果較佳。2.制備原生質(zhì)體的酶類(lèi)：高等植物細(xì)胞壁主要成分為a-纖維素，其次為半纖維素、果膠質(zhì)及蛋白質(zhì)。細(xì)胞生長(zhǎng)的不同階段及不同物種的細(xì)胞壁組成與結(jié)構(gòu)不同，木質(zhì)化及次生加厚的細(xì)胞壁不被酶消化，故選擇材料和消化細(xì)胞壁的酶類(lèi)是制備原生質(zhì)體關(guān)鍵。常用的酶類(lèi)有：A.纖維素酶，如OnozukaR—10及RS，國(guó)內(nèi)常用的為EA3-867，其中含少量果膠酶；B.半纖維素酶，如RhozymeHP150，用于懸浮細(xì)胞、豆科根瘤、幼苗子葉及根細(xì)胞原生質(zhì)體的分離;C.果膠酶，如MacerozymeR—10又叫離析酶，主要含果膠酶，活力較高，其含雜酶較多，用量不超過(guò)2％，作用時(shí)間長(zhǎng)有毒害作用；此外亦用PectalyaseY—23，也叫離析軟化酶，活力極高，葉片用量一般為0．1％，懸浮細(xì)胞為0．05％；D.崩潰酶（Driselase)，為一種粗酶制劑，具有纖維素酶及果膠酶活性；E蝸牛酶，主要用于體細(xì)胞原生質(zhì)體分離。

酶液配制：

需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl2·2H20(0.1mmol/L一10mo1/L)及KH2PO4(0.75mmol/l)等滲透穩(wěn)定劑，以維持原生質(zhì)體完整性。酶液pH值相當(dāng)重要，纖維素酶及果膠酶單獨(dú)使用時(shí)，其pH分別以5.4及5.8為宜；混合使用時(shí)pH5.4-pH5.6為宜，降至4.8以下則原生質(zhì)體破裂。

酶液配制后需以0.45um微孔膜過(guò)濾除菌，而不可采用加熱滅菌法。

3．原生質(zhì)體分離及純化（1）分離：原生質(zhì)體分離有機(jī)械法（質(zhì)壁分離）及酶消化法，前者產(chǎn)量極低而不多用、后者又分一步法及二步法。

一步法是將材料在2l一28℃用纖維素酶及果膠酶混合液一次性處理2—24h。

二步法是將材料先用果膠酶降解胞間膠層得到單細(xì)胞，再用纖維素酶脫壁而釋放原生質(zhì)體。（2）純化

A.沉降法:原生質(zhì)體混合物經(jīng)微孔過(guò)濾后，低速（150g）離心5min,沉淀再用與酶液具相同糖濃度溶液反復(fù)洗3-4次，后用培養(yǎng)液洗滌備用（方便但純度不高）；

B.飄浮法:離心法純化的原生質(zhì)體若含較多碎片及少量老細(xì)胞時(shí)．可用20％蔗糖離心，原生質(zhì)體浮于液面．碎片及老細(xì)胞沉降而得以純化，純度高，但產(chǎn)量低；

C.不連續(xù)梯度離心法：將原生質(zhì)粗提液置于不連續(xù)濃度梯度的溶液中，經(jīng)離心后分離不同比重的原生質(zhì)體，優(yōu)點(diǎn)是原生質(zhì)體均勻一致、純度高，缺點(diǎn)是得率低。

4．原生質(zhì)體活力測(cè)定

純化的原生質(zhì)體需經(jīng)活力測(cè)定后方可用于培養(yǎng)。（1）根據(jù)形態(tài)待征判斷其活力：原生質(zhì)體呈綠色（若來(lái)源于葉片）及圓而鼓者為活原生質(zhì)體。（2）熒光染料活體染色法：熒光素染料（熒光素二乙酸酯法，F(xiàn)DA）可自由透過(guò)活細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解為熒光素，在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光強(qiáng)度即可判斷原生質(zhì)體死活。（3）酚藏花紅染色法：活原生質(zhì)體能吸收呈紅色，無(wú)活性的則不能吸收而無(wú)色。（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)：

1.培養(yǎng)方法：（1）固體培養(yǎng)：平板培養(yǎng)法，易觀察和獲得單細(xì)胞系，但植板率低。（2）液體培養(yǎng)：

A.淺層培養(yǎng)法:其過(guò)程是將1m1原生質(zhì)體（調(diào)整好密度）懸液置于直徑4cm培養(yǎng)皿或25m1三角瓶中使成薄層后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．初期振搖1—2次，防止粘壁；

B.固液結(jié)合培養(yǎng)法：在混好原生質(zhì)體的固體培養(yǎng)基表面加一層相同成分的液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。效果較好。C：雙層培養(yǎng)法：原生質(zhì)體在液相中。2.培養(yǎng)條件：

密度：平板培養(yǎng)103~104個(gè)/ml,

液體培養(yǎng)104~105個(gè)/ml溫度：多數(shù)為25-28oC,少數(shù)16~37oC光照：多數(shù)要求黑暗或弱光影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素：

原生質(zhì)體活性：健康的外植體、分裂旺盛的愈傷組織；原生質(zhì)體起始密度：5×103~5×105滲透壓穩(wěn)定劑：0.3%~0.5%mol/L的甘露醇；0.4%mol/L的葡萄糖；培養(yǎng)基：葡萄糖/氮源/激素及濃度；培養(yǎng)條件：暗培養(yǎng)，植物材料和基因型：甘藍(lán)型、芥菜型和白菜型油菜難度不同；木本植物難度高于草本植物。電擊和熱擊：刺激作用，促進(jìn)DNA合成，分化再生基因表達(dá)。3.細(xì)胞壁再生及細(xì)胞分裂：

l一3天即再生新細(xì)胞壁，表現(xiàn)為體積增加、膨大，再由圓變橢圓。可用質(zhì)壁分離法證實(shí)。也可用0.1%ST型或WBL型熒光增白劑染色，經(jīng)前者染色，有細(xì)胞壁者在熒光顯微鏡下呈藍(lán)色熒光。經(jīng)后者染色，有細(xì)胞壁者發(fā)射綠色熒光。在原生質(zhì)培養(yǎng)過(guò)程中，胞質(zhì)增加，液泡減少，葉綠體或顆粒內(nèi)含物分散于泡質(zhì)中或圍繞于細(xì)胞核周?chē)Ｔ?一2周內(nèi)發(fā)生第一次分裂。不同細(xì)胞分裂頻率不同。4、愈傷組織或胚狀體形成

原生質(zhì)體再生的細(xì)胞一旦開(kāi)始分裂，就可能繼續(xù)生長(zhǎng)：

A形成細(xì)胞團(tuán)，發(fā)育成愈傷組織；

B.形成胚狀體，再產(chǎn)生植株；

C.形成愈傷組織，再形成胚狀體。隨著細(xì)胞分裂及細(xì)胞團(tuán)形成，已與常規(guī)細(xì)胞和組織培養(yǎng)相同，故培養(yǎng)3—4周需添加含一定量低滲穩(wěn)定劑的新培養(yǎng)基，以滿(mǎn)足細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)，亦利于細(xì)胞團(tuán)及小愈傷組織的生長(zhǎng)。

5.植株再生

大多經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)分化再生為完整植株。當(dāng)愈傷組織達(dá)到1—2mm時(shí)，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)器官分化。分化培養(yǎng)基與原生質(zhì)體培養(yǎng)基差別在于：

(1)只用蔗糖為碳源，不加滲透穩(wěn)定劑；

(2)與原生質(zhì)體培養(yǎng)基相反，細(xì)胞分裂素濃度高于生長(zhǎng)素;(3)在誘導(dǎo)器官分化過(guò)程中，一般采用1500lx左右的高光強(qiáng)。誘導(dǎo)器官分化的溫度與原生質(zhì)體培養(yǎng)基本相同。

（三）原生質(zhì)體培養(yǎng)的目的：

1、利用原生質(zhì)體不具細(xì)胞壁的特性可以進(jìn)行細(xì)胞器移植和外源物的攝取，原生質(zhì)體之間可以進(jìn)行融合而產(chǎn)生雜種細(xì)胞(即體細(xì)胞雜交）。2、是植物基因工程的理想受體，用外源遺傳物質(zhì)對(duì)植物原生質(zhì)體進(jìn)行改造和轉(zhuǎn)化，然后誘導(dǎo)分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。3、也是研究細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、體細(xì)胞無(wú)性系變異和植物病理學(xué)研究的有用工具。A-D當(dāng)歸(Angelicasinensis(Oliv)Diels)原生質(zhì)體培養(yǎng)成再生苗

E-H,紅豆草(OnobrychisvicaefoliaScop))原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株A-E,培養(yǎng)的歐當(dāng)歸(LevisticumofficinaleKoch)原生質(zhì)體分裂再生成植株的過(guò)程

F-L,培養(yǎng)過(guò)程的核變化；F.多核，G.核穿壁，H.無(wú)絲分裂，I.染色體橋，J.2n=22，K.L.多倍體.二、原生質(zhì)體融合：

在外界因素作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上植物