第八章色譜分析法導(dǎo)論吳麗榮

第八章色譜分析法導(dǎo)論學(xué)習(xí)目標(biāo)理解色譜分離的基本原理，了解色譜的分類方法掌握色譜流出曲線所代表的各種技術(shù)參數(shù)的準確含義掌握色譜分離的理論基礎(chǔ)：塔板理論和速率理論方程學(xué)會各種色譜定性和定量的分析方法主要內(nèi)容§8-1色譜分析法及其基本概念§8-2色譜分析法基本理論§8-3色譜分析法定性和定量分析方法§8-1色譜分析法及其基本概念一、色譜分析法的產(chǎn)生和發(fā)展二、色譜分析法分類三、色譜圖及常用術(shù)語一、色譜分析法的產(chǎn)生和發(fā)展一、色譜分析法的產(chǎn)生和發(fā)展柱內(nèi)的填充物稱為固定相s

——（固體或液體）沿柱流動的物質(zhì)稱為流動相m——（氣體或液體）裝有固定相的柱子稱為色譜柱

色譜法：根據(jù)混合物各組分在固定相和流動相中的選擇性分配的差異，使各組分在色譜柱中的遷移速率不同而獲得分離的方法。色譜法的發(fā)展史20世紀40年代：薄層色譜法TLC與紙色譜法PC50年代：氣相色譜法GC60年代：高效液相色譜法HPLC，薄層掃描儀80年代初：超臨界流體色譜法SFC80年代末：毛細管電泳法CE當(dāng)前：色譜-光譜(或質(zhì)譜)聯(lián)用二、色譜法的分類2.1按兩相的狀態(tài)分類

流動相

固定相氣-固色譜（GSC）氣-液色譜（GLC）氣相色譜氣體液體液體固體1.氣體為流動相的色譜稱氣相色譜法（

GC）2.液體為流動相的色譜稱液相色譜法(LC）液相色譜液-固色譜（LSC）液-液色譜（LLC）擴展：超臨界流體色譜法(SFC)

超臨界流體是一種物質(zhì)狀態(tài)，當(dāng)物質(zhì)在超過臨界溫度及臨界壓力以上，氣體與液體的性質(zhì)會趨近于類似，最后會達成一個均勻相之流體現(xiàn)象。它具有氣體的低粘度、液體的高密度以及介于氣、液之間較高的擴散系數(shù)等特征。SFC是GC和LC的補充，SFC可以解決氣液色譜分析的難題，它可以分析氣相色譜難汽化的不揮發(fā)性樣品，同時具有比高效液相色譜更高的效率，分析時間更短。二、色譜法的分類2.2按分離機理分類吸附色譜：吸附劑對不同組分的吸附能力不同；分配色譜：不同組分在兩相中的溶解度不同；離子交換色譜：不同組分與離子交換劑的交換能

力不同；凝膠色譜（分子排阻色譜）:凝膠對不同分子的阻滯作用不同。

視頻《凝膠色譜法》二、色譜法的分類

2.3按操作形式分類1.固定相裝于柱內(nèi)的色譜法，稱為柱色譜。

比如

GC、HPLC、CE、SFC

視頻《柱色譜分離操作》2.固定相呈平板狀的色譜，稱為平板色譜，又分為薄層色譜、紙色譜、薄膜色譜。

視頻《紅藍墨水的紙層析》小結(jié)色譜法的分類？小結(jié)色譜法的分類色譜法LLC分離機理液相色譜法吸附色譜法分子排阻色譜法兩相狀態(tài)分配色譜法LSC操作形式氣相色譜法GSCGLC離子交換色譜法紙色譜法柱色譜法薄層色譜法薄膜色譜法平板色譜法三、色譜圖及常用術(shù)語（一）色譜圖（產(chǎn)生過程演示）色譜圖：指檢測器的響應(yīng)信號隨時間變化的曲線（濃度-時間曲線）色譜圖產(chǎn)生過程（二）基本術(shù)語1.基線2.色譜峰3.保留值—定性依據(jù)死時間t0

；保留時間tR

；調(diào)整保留時間t'R

死體積V0

；保留體積VR

；調(diào)整保留體積V'R

基線1.基線：色譜柱后僅有流動相通過時，檢測器響應(yīng)信號的記錄值。

穩(wěn)定的基線是一條平行于橫軸的直線?；€反映儀器是否穩(wěn)定若基線上下波動稱為噪聲若基線上斜或下斜稱為漂移2.色譜峰

組分流出時，檢測器對該組分的響應(yīng)信號隨時間變化形成的峰形曲線，正常的色譜峰為對稱的正態(tài)分布曲線。

峰高h=AB'區(qū)域?qū)挾取u價柱效①標(biāo)準偏差σ=EF/2②峰寬W=4σ=IJ

③半峰寬W1/2=2.354σ=GH/2

峰面積A——定量依據(jù)3.保留值——定性分析的依據(jù)死時間t0不與固定相作用的組分（如空氣）從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需要的時間為死時間，亦即流動相到達檢測器所需的時間。保留時間tR：組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間組分從進樣開始到色譜峰頂點對應(yīng)的時間間隔稱為該組分的保留時間。當(dāng)操作條件不變時，組分的tR為定值，因此保留時間是色譜法的基本定性參數(shù)。調(diào)整保留時間t'R即t‘R=tR-t0。調(diào)整保留時間t'R體現(xiàn)的是組分在柱中被吸附或溶解的真實時間。因其扣除了與組分性質(zhì)無關(guān)的t0，所以作為定性指標(biāo)比保留時間tR更合理。死體積V0不能被固定相滯留的組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所消耗的流動相的體積。亦即從進樣器到檢測器的流路中未被固定相占有的空隙的總體積。V0=t0×F0(F0為載氣流速,單位：mL/min)死時間相當(dāng)于載氣充滿死體積所需的時間。死體積大，色譜峰擴張(展寬)，柱效降低。保留體積VR是指組分從進樣開始到出現(xiàn)峰最大值時所需流動相的體積。VR=tR?F0

(F0為載氣流速)調(diào)整保留體積V'R

V'R=t'R?F0它真實地反應(yīng)將待測組分從固定相中攜帶出柱子所需流動相體積。t'R和V'R——定性參數(shù)?？偨Y(jié)：利用色譜圖可以解決下列問題：（1）樣品中所含組分的最少個數(shù)（2）保留值---定性（3）色譜峰面積（或峰高）---定量（4）色譜峰的區(qū)域?qū)挾?--評價柱效4.分配系數(shù)K和分配比k'4.1分配系數(shù)K在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的濃度比，稱為分配系數(shù)（平衡常數(shù)），用K表示，即：組分在固定相中的濃度組分在流動相中的濃度K=

cS

cm=K與柱溫有關(guān)，與兩相體積無關(guān)。

分配系數(shù)K的討論一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，保留值越?，出峰越?；若兩組分的K值相等，則同時出峰各組分的K值不同是分離的基礎(chǔ)；某組分不被固定相保留，則K=?組分在固定相中的濃度組分在流動相中的濃度K=

cScm=（大,慢）（0）4.2容量因子(k’)——分配比

在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的質(zhì)量之比，稱為分配比（容量因子、容量比）補充：tR、VR與K、k'的關(guān)系操作條件一定時，K或k'越大，保留值越大若K或k'相等，則兩組分的色譜峰重合K或k'不等是色譜分離的先決條件§8-2色譜分析法基本理論一、塔板理論二、速率理論三、色譜分離總效能的衡量一、塔板理論

分餾的原理是通過加熱，從塔底形成的上升蒸氣流和從塔頂冷凝的下降液體流（回流），在塔板液層上進行氣液兩相的熱交換和質(zhì)交換，依據(jù)組分的揮發(fā)度不同，輕組分隨蒸氣流向上，重組分隨液體流向下，從而完成液體混合物的分離目的。一、塔板理論

該理論是把色譜柱比作一個分餾塔，從而把色譜分離過程比作分餾過程。色譜柱內(nèi)有很多層分隔的塔板，在每一層塔板上，組分可達到一次分配平衡。因被分離組分的分配系數(shù)不同，經(jīng)多次分配平衡后，K小的組分先流出色譜柱。只要色譜柱的塔板足夠多，組分的K值僅有微小的差別，也可得到較好的分離。色譜柱長：L虛擬的每次分配平衡所需的塔板高度：H色譜柱的理論塔板數(shù)：n則三者的關(guān)系為：n=L/H理論塔板數(shù)的計算公式：注意：單位統(tǒng)一！有效塔板數(shù)(neff)和有效塔板高度(Heff)

n或neff、H或Heff——描述柱效能的重要指標(biāo)對于單一組分，n或neff越大（H或Heff越小），柱效能越高，色譜峰越窄。注意：單位統(tǒng)一！練習(xí)1在一根長3m的色譜柱上分離一樣品，得下列數(shù)據(jù)：空氣、組分1及組分2的保留時間分別為1、14、17min，組分2的峰寬為1min。求：（1）組分1和組分2的調(diào)整保留時間；（2）用組分2計算該色譜柱的理論塔板數(shù)、理論塔板高度。（3）用組分2計算該色譜柱的有效塔板數(shù)、有效塔板高度。練習(xí)2在長為2m的阿皮松柱，柱溫為100℃，記錄紙速為2.0cm/min的實驗條件下，測得苯的保留時間為1.5min，半峰寬為0.20cm，求理論塔板數(shù)和理論塔板高度。解：在實驗中，如何比較不同色譜柱的柱效？在相同的實驗操作條件下，用同一物質(zhì)通過不同色譜柱，根據(jù)所得的色譜峰分別計算出neff

,neff越大，則柱效能越高思考：某人制備了一根色譜柱，用組分Ａ，Ｂ為測試樣測得該柱的理論塔板數(shù)為４５００和４０００，因而推斷Ａ和Ｂ組分在該柱上一定能得到很好的分離，該推斷正確嗎？思考：答：不正確。因為塔板數(shù)n多，只能說明柱效高，色譜峰窄；不能判斷二組分是否能被分離塔板理論的特點和不足：特點：塔板理論有助于我們了解色譜分離的過程以及柱效的評價。不足：它的某些假設(shè)與實際色譜儀過程不符；無法提出提高柱效的途徑。二、速率理論范第姆特方程式:式中H為理論塔板高度；u為流動相的線速度(cm/s)；A為渦流擴散項；B/u為分子擴散項；C·u為傳質(zhì)阻力項其中dp表示固定相的平均粒徑大小；

λ為填充不規(guī)則因子固定相顆粒越?。╠p）越小，填充的越均勻，柱效n越高

因分子運動路徑不同，導(dǎo)致同分子出柱時間不同：分子擴散項（縱向擴散項）：B/u組分在氣相中的擴散比在液相中的擴散嚴重的多，分子擴散項主要針對GCD為組分在流動相中擴散系數(shù)（cm2·s-1）

D=Dl+Dg≈Dg

減小的方法：①采用較高的載氣流速②選擇分子量大的重載氣（N2）③采用較低柱溫分子擴散與組分在柱中的停留時間有關(guān)，停留時間越長（u?。?，分子擴散越嚴重。因此，當(dāng)線速度u大時，B/u項可忽略。3.傳質(zhì)阻抗項：C·u減小CL的方法：降低固定液膜厚度；提高柱溫

C=Cg+CL

Cg—氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)；CL—液相傳質(zhì)阻力系數(shù)減小Cg的方法：采用粒度小的填充物；分子量小的氣體（如H2）作載氣解釋柱填充均勻程度、固定相粒度、流動相種類、流動相流速、柱溫、固定液層厚度等對柱效的影響。熱力學(xué)：塔板理論解釋色譜峰形狀、定義柱效的評價指標(biāo)動力學(xué)：速率理論——VanDeemter方程

兩個基本理論三、色譜分離總效能的衡量1、柱效能和選擇性2、分離度

R

3、分離度與柱效、選擇性的關(guān)系1、柱效能和選擇性柱效能：是指色譜柱在分離過程中的分離效能。對于單一組分：n（或n

有效）越大，柱效能越好。選擇性：常用色譜圖上兩峰間的距離衡量色譜柱的選擇性，峰間距越大說明柱子的選擇性越好。一般用相對保留值表示:相對保留值僅與柱溫、固定相性質(zhì)有關(guān)，是比較理想的定性指標(biāo)。比較下列色譜分離情況的柱效和選擇性高低①柱效低，選擇性低②柱效高，選擇性低③柱效低；選擇性高④柱效高，選擇性好R<1.0：兩峰部分重疊；R=1.0：分離程度98%，基本分離；R≥1.5：分離程度達99.8%，完全分離。2.分離度R——總分離效能指標(biāo)R=1.5是相鄰兩峰完全分離的標(biāo)志。注意：保留時間與峰寬應(yīng)取相同單位R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標(biāo)志3、分離度與柱效、選擇性的關(guān)系可以通過增加塔板數(shù)n、增加選擇性r2,1、分配比k'提高分離度。設(shè)法降低板高，提高柱效，才是提高分離度的最好方法?？赏ㄟ^改變固定相、降低柱溫、控制流動相的極性來增大K'?！?-3定性和定量分析方法一、定性分析1.與標(biāo)樣對照的方法2.與其它分析儀器聯(lián)用的定性方法二、定量分析

1.定量校正因子2.定量方法1）歸一化法；2）內(nèi)標(biāo)法；3）外標(biāo)法定性分析方法與標(biāo)品對照利用峰高增量定性利用r2,1定性利用tR定性利用雙色譜系統(tǒng)定性1

利用保留值及其規(guī)律定性

各物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，因此保留值可作為定性指標(biāo)。（1）利用絕對保留值定性（標(biāo)準物對照法）在相同色譜條件下，分別測得待測物與標(biāo)準物的保留值。若相同，則可以初步認為可能是同一種物質(zhì)；若不同，則肯定不是同一種物質(zhì)。要求：同臺儀器；操作條件穩(wěn)定一致；有樣品的標(biāo)準物

（2）用相對保留值定性

根據(jù)文獻，相同色譜條件、相同對照品，測得對照品和待測樣品的相對保留值：

i-未知組分；

s-對照品。并與文獻值比較，若二者相同，則可認為是同一物質(zhì)。可消除操作條件的差異適用于無已知物或組分比較簡單的已知范圍的混合物試樣。S（3）用已知物增加峰高法定性先測未知樣品的色譜圖再在同樣的色譜條件下測加純物質(zhì)的未知樣品的色譜圖。對比兩張色譜圖，哪個峰變高了，則該組分可能是所加的純物質(zhì)。這是在確認某一復(fù)雜樣品中是否含有某物質(zhì)的最好辦法。二、定量分析方法定量依據(jù)：檢測器對組分產(chǎn)生的響應(yīng)信號與組分的量成正比，即（1）絕對校正因子指某組分i的量與檢測器響應(yīng)信號之比：fi與檢測器性能、組分和流動相性質(zhì)及操作條件有關(guān)，不易準確測量。1.校正因子（2）相對校正因子（f'i）在定量分析中常用相對校正因子，即某組分（i）與標(biāo)準物質(zhì)（S）的絕對校正因子之比。與待測物、基準物和檢測器類型有關(guān)，與操作條件（如進樣量等）無關(guān)2.定量方法1）歸一化法優(yōu)點：簡便、準確，無需標(biāo)準物，不必準確稱量和準確進樣，該法適合于常量物質(zhì)的定量。缺點：

1.要求所有組分沒有在柱內(nèi)分解；所有組分都能流出色譜柱且在檢測器上均有響應(yīng)；各組分峰沒有重疊2.必須已知所有組分的校正因子；3.不適合微量組分的測定。二氯乙烷二溴乙烷四乙基鉛相對校正因子1.001.651.75峰面積（cm2）1.501.012.82例：某色譜條件下，分析僅含有二氯乙烷、二溴乙烷及四乙基鉛三組分樣品，分析結(jié)果如下：試用歸一化法求各組分的百分含量。二氯乙烷二溴乙烷四乙基鉛解：2.定量方法2）內(nèi)標(biāo)法將已知量的純物質(zhì)ms作為內(nèi)標(biāo)物，加入到準確稱取的試樣m中，混合進樣測得相應(yīng)的峰面積，按下式求出某組分的含量：

內(nèi)標(biāo)物要滿足以下要求（1）試樣中不含有該內(nèi)標(biāo)物；（2）與被測組分性質(zhì)比較接近；（3）不與試樣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；