儀器分析-高效液相色譜

第六章

高效液相色譜法6.1概述6.2高效液相色譜儀6.3高效液相色譜法的類型HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)§6-1概述

高效液相色譜法是繼氣相色譜之后，70年代初期發(fā)展起來的一種以液體做流動相的新色譜技術。高效液相色譜是在氣相色譜和經(jīng)典液相色譜的基礎上發(fā)展起來的。現(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質的區(qū)別。不同點僅僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典液相色譜有較高的效率和實現(xiàn)了自動化操作。與經(jīng)典液相色譜的比較高壓——流動相采用高壓輸送（最高輸送壓力可達4.9107Pa）高速——分析周期短高效——每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬。高靈敏度——使用高靈敏度的檢測器與氣相色譜的比較1、應用范圍不同氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質。對高沸點化合物、非揮發(fā)性物質、熱不穩(wěn)定化合物、離子型化合物及高聚物的分離、分析較為困難。致使其應用受到一定程度的限制，據(jù)統(tǒng)計只有大約20%的有機物能用氣相色譜分析；液相色譜則不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或對熱敏感的物質、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機物的70～80%。①氣相色譜的流動相是色譜惰性的，不參與分配平衡過程，而液相色譜中流動相參與固定相爭奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個因素。②液相色譜固定相類型多,如離子交換色譜和排阻色譜等，作為分析時選擇余地大；而氣相色譜并不可能的。③液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇。2、液相色譜能完成難度較高的分離工作3、液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。4、液相色譜缺乏通用的檢測器，儀器比較復雜，價格昂貴。在實際應用中，這兩種色譜技術是互相補充的?！?–2高效液相色譜儀北京瑞利高效液相色譜儀一般可分為4個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。高效液相色譜儀的結構示意圖流程為了獲得高柱效，高效液相色譜使用粒度很小的固定相（<10μm），因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是儀器最重要的部件：由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成。高壓輸液系統(tǒng)

對高壓泵的要求：密封性好，壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調、耐腐蝕等特性。高壓輸液泵在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關。恒流泵：分類能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重現(xiàn)性差。恒壓泵：進樣系統(tǒng)

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5-30cm），所以柱外展寬（即柱外效應）較突出。進樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術要求較嚴。進樣方式：注射器進樣、閥進樣、自動進樣器。

分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm。檢測系統(tǒng)

HPLC與GC一樣，要求檢測器靈敏度高，重現(xiàn)性好，定量準確，對溫度和流速的變化不敏感，應用范圍廣，線性范圍寬等優(yōu)點。選擇性檢測器：它僅對被分離組分的物理或化學特性有響應，屬于這類檢測器的有紫外、熒光檢測器等。通用型檢測器：它對試樣和洗脫液總的物理或化學性質有響應，屬于這類檢測器的有示差折光，電導檢測器等。

原理：基于待測組分對特定波長的紫外或可見光的選擇性吸收，試樣濃度與吸光度的關系服從朗伯-比爾定律。紫外可見吸收檢測器（UV-Vis）

特點：靈敏度高，通用性好，對流量和溫度的變化不敏感，適用于梯度淋洗，線性范圍寬，適用于痕量分析。主要缺點是流動相選擇受限制，要求流動相在測定波長下無吸收。

應用：只適用于檢測對紫外光有吸收的物質，如芳香族化合物、含C=O、C=N、N=N等結構的化合物。它是HPLC中應用最廣泛的檢測器，約有80%的物質可在254nm和280nm處產(chǎn)生紫外吸收。熒光檢測器(FLD)原理：對具有熒光特性的試樣進行檢測。熒光強度與物質的濃度成正比。特點：靈敏度高，檢出限低（10-12～10-13g·mL-1)，選擇性好，適用于痕量分析，也可用于梯度洗脫，是高效液相色譜中最靈敏的檢測器之一。主要缺點是線性范圍窄（103左右）。應用：檢測能顯示熒光的物質（不如紫外應用廣泛），如共軛體系的分子及不太強的離子化合物，尤其是對多環(huán)芳烴，甾類化合物、氨基酸、維生素、酶、蛋白質等的分析。示差折光率檢測器(RID)原理:利用純流動相與包含樣品的流動相之間的折射率不同，檢測器把這種差值檢測出來，給出信號，信號的大小與樣品含量成正比。特點：通用性強，線性范圍寬。主要缺點是靈敏度低，不適宜痕量分析，對溫度變化敏感，不能用于梯度淋洗。**HPLC梯度淋洗與GC中的程序升溫一樣。梯度洗脫裝置梯度洗脫：在一個色譜分析周期內(nèi)，不斷改變流動相配比、極性、pH、離子強度（使用兩種或兩種以上溶劑），以達到用最短的時間獲得最佳的分離效果。內(nèi)梯度（高壓）外梯度（低壓）--對分配比變化范圍寬的樣品。6-3高效液相色譜法

的主要類型及分離原理液-固吸附色譜（LSAD)液-液分配色譜(LLPC)化學鍵合相色譜法（CBPC）離子交換色譜(IEC)離子色譜(IC)離子對色譜(IPC)排阻色譜(SEC)親和色譜(AC)一、液-固吸附色譜

liquid-solidadsorption

chromatography基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；固定相：為固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動相（洗脫劑）：各種不同極性的一元或多元溶劑。對極性大的試樣往往采用極性強的洗脫劑（甲醇、乙醇、正丙醇、吡啶等），對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑（石油醚、正戊烷、環(huán)己烷等）。二、液-液分配色譜

liquid-liquidpartition

chromatography

基本原理：組分在固定相和流動相上的溶解度不同。正相分配色譜：適用于極性化合物的分離。反相分配色譜：適用于非極性化合物的分離。流動相：盡可能不與固定相互溶，兩者極性差別越大越好。固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；現(xiàn)多采用化學鍵合固定相?；瘜W鍵合相色譜法鍵合固定相：將各種不同基團通過化學反應鍵合到硅膠（擔體）表面的游離羥基(Si一OH)上。它具有固定相不易流失、柱效高、選擇性好及可用于梯度洗脫等特點。正相鍵合相色譜：采用極性鍵合固定相，如硅膠一CN、硅膠一NH2等；流動相是采用非極性或極性小的溶劑（如烴類），或在其中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等）以分離極性化合物。反相鍵合相色譜：采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠一C18H37（簡稱ODS)、硅膠一苯基等；流動相是采用極性較強的溶劑，如甲醇—水、乙腈一水、水和無機鹽的緩沖溶液等。**反相鍵合相色譜是高效液相色譜法中應用最廣的模式三、離子交換色譜法

ion-exchange

chromatography基本原理：不同組分對固定相親和力的差別實現(xiàn)分離的，組分在固定相上發(fā)生了反復離子交換反應。陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4Cl+X-=R—NR4X+Cl-

固定相：陰離子交換樹脂或陽離子交換樹脂；流動相：大多是一定PH和鹽濃度（或離子強度）的緩沖溶液。四、排阻色譜法

size-exclusionchromatography

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)

原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快。分析范圍：相對分子質量在100-106范圍內(nèi)的化合物按質量分離。作業(yè)：1.某一色譜柱的理論計算所得的n理很大，H